Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine integrierte Strategie zur Erforschung der wichtigsten Ziele und Mechanismen von Fructus Phyllanthi gegen Hyperlipidämie, basierend auf der Vorhersage der Netzwerkpharmakologie und der Verifizierung der Metabolomik.
Abstract
Hyperlipidämie ist weltweit zu einem der führenden Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Leberschäden geworden. Fructus Phyllanthi (FP) ist ein wirksames Medikament gegen Hyperlipidämie in den Theorien der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) und der Indischen Medizin, der potenzielle Mechanismus muss jedoch weiter erforscht werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, den Mechanismus der FP gegen Hyperlipidämie aufzudecken, basierend auf einer integrierten Strategie, die die Vorhersage der Netzwerkpharmakologie mit der Validierung der Metabolomik kombiniert. Ein durch fettreiche Diät (HFD) induziertes Mäusemodell wurde durch die Auswertung der Plasmalipidspiegel erstellt, einschließlich Gesamtcholesterin (TC), Triglycerid (TG), Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin (LDL-C) und High-Density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C). Die Netzwerkpharmakologie wurde angewendet, um die Wirkstoffe von FP und mögliche Angriffspunkte gegen Hyperlipidämie herauszufinden. Metabolomik von Plasma und Leber wurde durchgeführt, um differentielle Metaboliten und ihre entsprechenden Signalwege zwischen der Normalgruppe, der Modellgruppe und der Interventionsgruppe zu identifizieren. Die Beziehung zwischen Netzwerkpharmakologie und Metabolomik wurde weiter konstruiert, um einen umfassenden Überblick über den Prozess der FP gegen Hyperlipidämie zu erhalten. Die erhaltenen Schlüsselzielproteine wurden durch molekulares Andocken verifiziert. Diese Ergebnisse spiegelten wider, dass FP die Plasmalipidspiegel und die Leberschädigung der durch eine HFD induzierten Hyperlipidämie verbesserte. Gallussäure, Quercetin und Beta-Sitosterol in FP wurden als die wichtigsten Wirkstoffe nachgewiesen. Insgesamt wurden 16 bzw. sechs potentielle differentielle Metaboliten im Plasma bzw. in der Leber gefunden, die an den therapeutischen Effekten von FP gegen Hyperlipidämie durch Metabolomik beteiligt sind. Darüber hinaus zeigte die Integrationsanalyse, dass die Interventionseffekte mit CYP1A1, AChE und MGAM sowie mit der Anpassung von L-Kynurenin, Corticosteron, Acetylcholin und Raffinose assoziiert waren, wobei hauptsächlich der Tryptophan-Stoffwechselweg beteiligt war. Molekulares Docking stellte sicher, dass die oben genannten Inhaltsstoffe, die auf Hyperlipidämie-bedingte Proteinziele wirken, eine Schlüsselrolle bei der Senkung der Lipide spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Forschung eine neue Möglichkeit zur Vorbeugung und Behandlung von Hyperlipidämie bietet.
Introduction
Hyperlipidämie ist eine häufige Stoffwechselerkrankung mit schwerwiegenden Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und auch der Hauptrisikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen1. In jüngster Zeit ist ein altersbedingter Abwärtstrend für diese Krankheit zu beobachten, und jüngere Menschen sind aufgrund eines langfristig unregelmäßigen Lebensstils und ungesunder Essgewohnheiten anfälliger geworden2. In der Klinik wurden verschiedene Medikamente zur Behandlung von Hyperlipidämie eingesetzt. Eines der am häufigsten verwendeten Medikamente für Patienten mit Hyperlipidämie und verwandten atherosklerotischen Störungen sind beispielsweise Statine. Die langfristige Einnahme von Statinen hat jedoch nicht zu vernachlässigende Nebenwirkungen, die zu einer schlechten Prognose führen, wie z. B. Unverträglichkeit, Therapieresistenz und unerwünschte Ereignisse 3,4. Diese Unzulänglichkeiten sind für Hyperlipidämie-Patienten zu zusätzlichen Schmerzen geworden. Daher sollten neuartige Behandlungen für eine stabile lipidsenkende Wirksamkeit und weniger Nebenwirkungen vorgeschlagen werden.
Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) wird aufgrund ihrer guten Wirksamkeit und ihrer geringen Nebenwirkungen häufig zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt5. Fructus Phyllanthi (FP), die Trockenfrucht von Phyllanthus emblica Linn. (im Volksmund als Amla-Beere oder indische Stachelbeere bekannt), ist ein berühmtes Medizin- und Lebensmittel-homologes Material der traditionellen chinesischen und indischen Medizin 6,7. Dieses Arzneimittel wurde gemäß den TCM-Theorien8 verwendet, um Hitze zu beseitigen, das Blut zu kühlen und die Verdauung zu fördern. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass FP reich an bioaktiven Verbindungen wie Gallussäuren, Ellagsäuren und Quercetin9 ist, die für eine Reihe facettenreicher biologischer Eigenschaften verantwortlich sind, indem sie als Antioxidans, entzündungshemmend, leberschützend, antihypolipidämisch usw. wirken10. Neuere Forschungen haben auch gezeigt, dass FP die Blutfette von Patienten mit Hyperlipidämie effektiv regulieren kann. Zum Beispiel haben Variya et al.11 gezeigt, dass FP-Fruchtsaft und sein chemischer Hauptbestandteil Gallussäure den Plasmacholesterinspiegel senken und das Eindringen von Öl in Leber und Aorta verringern können. Die therapeutische Wirksamkeit hing mit der Regulation von FP zusammen, die Expression von Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor-alpha zu erhöhen und die hepatische lipogene Aktivität zu verringern. Der zugrunde liegende Mechanismus von FP bei der Verbesserung der Hyperlipidämie sollte jedoch weiter untersucht werden, da seine bioaktiven Inhaltsstoffe recht umfangreich sind. Wir haben versucht, den potenziellen Mechanismus der therapeutischen Wirksamkeit von FP zu untersuchen, der für die weitere Entwicklung und Anwendung dieses Arzneimittels von Vorteil sein könnte.
Gegenwärtig wird die Netzwerkpharmakologie als ganzheitliche und effiziente Technik angesehen, um den therapeutischen Mechanismus der TCM zu untersuchen. Anstatt nach einzelnen krankheitsverursachenden Genen und Medikamenten zu suchen, die nur ein einzelnes Ziel behandeln, wird ein vollständiges Netzwerk von Arzneimitteln, Inhaltsstoffen, Genen und Krankheiten aufgebaut, um den Multi-Zielmechanismus des Arzneimittels mit mehreren Inhaltsstoffen in Bezug auf ihre umfassende Behandlung zu finden12. Diese Technik eignet sich besonders für die TCM, da ihre chemische Zusammensetzung massiv ist. Leider kann die Netzwerkpharmakologie nur theoretisch zur Vorhersage von Zielen verwendet werden, die von chemischen Inhaltsstoffen beeinflusst werden. Die endogenen Metaboliten im Krankheitsmodell sollten beobachtet werden, um die Wirksamkeit der Netzwerkpharmakologie zu validieren. Die Metabolomik-Methode, die mit der Entwicklung der Systembiologie auftaucht, ist ein wichtiges Werkzeug zur Überwachung der Veränderungen in endogenen Metaboliten13. Die Veränderungen der Metaboliten spiegeln die stationären Zustandsänderungen des Wirts wider, was auch ein wichtiger Indikator für die Untersuchung des internen Mechanismus ist. Einigen Forschern ist es gelungen, Netzwerkpharmakologie und Metabolomik zu integrieren, um den Interaktionsmechanismus zwischen Medikamenten und Krankheiten zu erforschen14,15.
Dieser Artikel untersucht die mechanistischen Grundlagen der FP gegen Hyperlipidämie durch die Integration von Netzwerkpharmakologie und Metabolomik-Techniken. Die Netzwerkpharmakologie wurde angewendet, um die Beziehung zwischen den Hauptwirkstoffen in FP und molekularen Zielen für Hyperlipidämie zu analysieren. Anschließend wurde eine Metabolomik durchgeführt, um die Veränderung der endogenen Metaboliten im Tiermodell zu beobachten, was die Arzneimittelwirkung auf metabolischer Ebene erklären kann. Verglichen mit der alleinigen Anwendung der Netzwerkpharmakologie oder Metabonomik bot diese integrierte Analyse einen spezifischeren und umfassenderen Forschungsmechanismus. Darüber hinaus wurde die molekulare Docking-Strategie verwendet, um die Interaktion zwischen Wirkstoffen und Schlüsselproteinen zu analysieren. Im Allgemeinen könnte dieser integrierte Ansatz den Mangel an experimenteller Evidenz für die Netzwerkpharmakologie und das Fehlen eines endogenen Mechanismus für die Metabolomik-Methode kompensieren und für die Analyse des therapeutischen Mechanismus der Naturheilkunde verwendet werden. Das schematische Hauptflussdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
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Protocol
Alle Verfahren, die den Umgang mit Tieren betreffen, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Universität Chengdu durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Chengdu genehmigt (Protokollnummer 2020-36). Für die vorliegende Studie wurden männliche C57BL/6-Mäuse (20 ± 2 g) verwendet. Die Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Netzwerkpharmakologie-basierte Vorhersage
HINWEIS: Die Netzwerkpharmakologie wird verwendet, um die Wirkstoffe und ihre Hauptziele von FP gegen Hyperlipidämie vorherzusagen.
- Auswahl der Wirkstoffe und der wichtigsten Ziele
- Suchen Sie nach dem Stichwort "Phyllanthi Fructus" in der pharmakologischen Datenbank (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) des Systems der Traditionellen Chinesischen Medizin, um die Liste der Wirkstoffkandidaten und Ziele von FP zu erhalten.
HINWEIS: Normalerweise werden nur Inhaltsstoffe mit oraler Bioverfügbarkeit (OB) ≥30% und wirkstoffähnlichen (DL) Werten ≥0,18 in der Datenbank als Wirkstoffe aufgenommen. - Suchen Sie nach dem Stichwort "Hyperlipidämie" in der GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/), der Online Mendelian Inheritance in Man Datenbank (OMIM; https://omim.org/) und der therapeutischen Zieldatenbank (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/), um die jeweiligen Kandidaten für Hyperlipidämie zu erhalten. Laden Sie die Tabellen mit den Krankheitszielen herunter. Löschen Sie die wiederholten Ziele, um die Liste der Hyperlipidämieziele zu erhalten.
- Kopieren Sie diese Listen aus den Schritten 1.1.1 und 1.1.2 in eine neue Tabelle. Verwenden Sie die Funktion "Daten - Duplikate identifizieren" in der Symbolleiste, um Schnittpunkte zu erhalten. Importieren Sie die Kreuzungszielliste in UniProtKB (http://www.uniprot.org/), um die Gen- und Proteinnamen zu standardisieren.
HINWEIS: Diese Ziele beziehen sich sowohl auf FP als auch auf Hyperlipidämie. Sagen Sie daher diese Schnittziele als Ziele der FP gegen Hyperlipidämie voraus.
- Suchen Sie nach dem Stichwort "Phyllanthi Fructus" in der pharmakologischen Datenbank (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) des Systems der Traditionellen Chinesischen Medizin, um die Liste der Wirkstoffkandidaten und Ziele von FP zu erhalten.
- Aufbau eines Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks
- Öffnen Sie die STRING-Datenbank (https://string-db.org/) 11.5. Fügen Sie die Schnittpunktzielliste von FP gegen Hyperlipidämie in das Dialogfeld "Liste der Namen" ein. Wählen Sie unter "Organismen" Homo sapiens aus und klicken Sie auf SUCHEN > WEITER.
HINWEIS: Menschen und Mäuse haben sehr ähnliche Gene. Daher wird eine weitere experimentelle Verifizierung mit Mäusen durchgeführt. - Wenn die Ergebnisse verfügbar sind, aktivieren Sie unter "Erweiterte Einstellungen" das Kontrollkästchen Getrennte Knoten im Netzwerk ausblenden . Legen Sie die höchste Konfidenz (0,900) für "Minimum required interaction score" fest und klicken Sie dann auf die Schaltfläche AKTUALISIEREN .
- Klicken Sie in der Titelleiste auf Exporte und laden Sie den kurzen Tabellentext des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) im PNG- und TSV-Format herunter.
- Öffnen Sie die STRING-Datenbank (https://string-db.org/) 11.5. Fügen Sie die Schnittpunktzielliste von FP gegen Hyperlipidämie in das Dialogfeld "Liste der Namen" ein. Wählen Sie unter "Organismen" Homo sapiens aus und klicken Sie auf SUCHEN > WEITER.
- Aufbau eines Drug-Component-Disease-Target-Netzwerks
- Öffnen Sie Cytoscape 3.9.1 (siehe Materialtabelle). Importieren Sie die TSV-Formatdatei aus Schritt 1.2.3. Optimieren Sie die Farbe, die Schriftart und die Seite der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der Systemsteuerung.
- Verwenden Sie die Funktion "Netzwerk analysieren" für die Analyse der Netzwerktopologie. Erhalten Sie Hub-Gene von CytoHubba in Cytoscape. Etablieren Sie das Netzwerk aus Arzneimitteln, Inhaltsstoffen und Zielkrankheiten.
- GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse
- Öffnen Sie DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Klicken Sie auf Analyse starten und fügen Sie die Zielliste in das linke Dialogfeld ein. Wählen Sie unter "Kennung auswählen" die Option OFFIZIELLES GENSYMBOL aus. Wählen Sie Homo sapiens unter "Spezies auswählen" aus. Setzen Sie ein Häkchen bei Genliste unter "Listentyp". Klicken Sie auf Liste senden.
- Wenn die Ergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf Analysieren Sie die obige Genliste mit einem der DAVID-Tools. Setzen Sie ein Häkchen bei GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT in "Gene Ontology" für die Analyse der GO-Funktionsanreicherung. Kreuzen Sie KEGG_Pathway in "Pathways" für die KEGG-Pathway-Anreicherungsanalyse an.
- Klicken Sie auf Functional Annotation Chart , um die Ergebnisse anzuzeigen.
HINWEIS: Legen Sie den Schwellenwert für die statistische Signifikanz der Anreicherungsanalyse auf p < 0,05 fest.
2. Versuchsplanung
- Das wässrige Extraktpräparat FP
HINWEIS: FP wird im Labor von Professor Lina Xia an der Chengdu University of TCM8 verarbeitet.- Das getrocknete FP-Pulver (90 g) in 1 l reinem Wasser in einem sauberen 2-Liter-Messkolben einweichen. Verwenden Sie eine Ultraschallbehandlung (im 4 °C warmen Wasserbad, Leistung: 250 W, Frequenz: 35 kHz), um die Auflösung für 30 Minuten zu unterstützen. Filtern Sie die Lösung, um den Extrakt zu erhalten, mit einer doppelschichtigen, 1 mm x 1 mm sterilen medizinischen Gaze. Wiederholen Sie den obigen Vorgang dreimal, um die vollständige Auflösung von FP sicherzustellen.
- Verwenden Sie die Rotationsverdampfungsmethode für eine weitere Konzentration. Stellen Sie die Drehzahl auf 50 U/min mit einer Temperatur von 60 °C für 4 h ein. Konzentrieren Sie den wässrigen Extrakt auf 100 ml.
- Den Rohextrakt von FP (0,9 g/ml) gleichmäßig in zwei Teile (50 ml) teilen. Ein Teil wird als hochdosierte FP-Flüssigkeit (0,9 g/ml) verwendet. Geben Sie 50 ml reines Wasser in einen anderen Teil und betrachten Sie es als niedrig dosierte FP-Flüssigkeit (0,45 g/ml). Verwenden Sie für die Verabreichung die hoch- und niedrig dosierten wässrigen FP-Lösungen. Lagern Sie die Flüssigkeit bis zur Verwendung bei -20 °C.
- Tiervorbereitung
- Unterbringe 50 männliche C57BL/6 Mäuse (20 ± 2 g) in einem gut belüfteten Raum bei Raumtemperatur, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und reinem Wasser.
- Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip zwei Gruppen zu: Füttern Sie 10 Mäuse mit normaler Ernährung und 40 Mäuse mit einer fettreichen Diät (siehe Materialtabelle), um eine Hyperlipidämie zu induzieren.
HINWEIS: Nach 8-wöchiger Fütterung wurden die Mäuse auf weitere medikamentöse Interventionen untersucht. - In der 8. Woche werden etwa 200 μl Blut aus jeder Maushöhle entnommen. Zentrifugieren Sie das Blut 10 Minuten lang bei 5.733 x g bei 4 °C, um Plasmaproben zu erhalten. Bestimmen Sie die TC- und TG-Gehalte mit handelsüblichen Assay-Kits (siehe Materialtabelle).
- Wählen Sie sechs Mäuse mit den normalsten Lipidwerten als Kontrollgruppe ohne Behandlung (NC) aus. Wählen Sie 24 Mäuse mit einem signifikant höheren Lipidspiegel als Gruppe mit fettreicher Diät aus und teilen Sie sie nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen ein: Gruppe mit fettreicher Diät (HFD), Gruppe mit niedrig dosiertem FP (FP_L), Gruppe mit hochdosiertem FP (FP_H) und Gruppe mit Positivkontrolle (PC).
- Verabreichen Sie der FP_L- und FP_H Gruppe eine Magenspülung mit zwei Dosierungen von FP (niedrige Dosis, 4,5 g/kg bzw. hohe Dosis, 9 g/kg); Magenspülung in der PC-Gruppe mit Simvastatin-Tabletten (5 mg/kg; siehe Materialtabelle); und Magenspülung in die NC- und HFD-Gruppen mit der gleichen Menge an physiologischer Kochsalzlösung einmal täglich für 4 Wochen.
HINWEIS: In der aktuellen Studie wurden die wässrigen Lösungen von FP und Simvastatin zur Behandlung verwendet. - In der 12. Woche, nach Narkose mit 1% Pentobarbitalnatrium (30 mg/kg), die Mäuse aller Gruppen opfern. Sammeln Sie ~400 μl Blutproben aus der Orbitalvene jeder Maus.
Anmerkungen: Stimulieren Sie die Zehen und Fußsohlen der Mäuse mit einer Pinzette. Wenn keine Reaktion auftritt, erweist sich eine ausreichende Anästhesie. - Zentrifugieren Sie das Blut 10 Minuten lang bei 5.733 x g bei 4 °C, um Plasmaproben zu erhalten, und bestimmen Sie die TC-, TG-, LDL-C- und HDL-C-Spiegel mit handelsüblichen Assay-Kits (siehe Materialtabelle). Es werden Lebergewebeproben16 entnommen und histopathologisch analysiert. Verwenden Sie die verbleibenden Plasma- und Leberproben für die Metabolomik-Analyse (Schritt 3).
HINWEIS: Alle Proben werden bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
- Histopathologische Untersuchung der Leber
- Fixieren Sie frisches Lebergewebe mit 4%iger Paraformaldehydlösung für mehr als 24 Stunden. Nehmen Sie das Gewebe aus dem Fixiermittel und glätten Sie das Zielgewebe mit einem Skalpell. Legen Sie das Taschentuch und das dazugehörige Etikett in den Dörrautomaten.
- Dörren in einem Ethanolgradienten: 75% Alkohol für 4 h, 85% Alkohol für 2 h, 90% Alkohol für 2 h, 95% Alkohol für 1 h, absolutes Ethanol für 1 h, Xylol für 30 min. Legen Sie die Gewebekassette für drei Waschgänge von je 30 Minuten in eine Gewebeform aus Paraffinwachs16 Minuten.
- Legen Sie die wachsgetränkten Tücher in den Tissue-Embedder (siehe Materialtabelle). Bevor das Wachs erstarrt, nehmen Sie die Taschentücher aus dem Dörrgerät, legen Sie sie in die eingebettete Schachtel und bringen Sie das entsprechende Etikett an.
- Kühlen Sie die Wachsblöcke in einem -20 °C Gefriertisch ab, entfernen Sie sie aus dem eingebetteten Rahmen und schneiden Sie den Wachsblock ab.
- Schneiden Sie die beschnittenen Wachsblöcke mit einem Mikrotom in 3 μm dicke Abschnitte (siehe Materialtabelle). Die Stücke in 40 °C heißem Wasser schwimmen lassen, von den Objektträgern nehmen und bei 60 °C backen. Nach dem Backen mit Wasser und Trockenwachs herausnehmen und bei Raumtemperatur aufbewahren.
- Legen Sie die Abschnitte nacheinander 10 Minuten lang in Xylol I, 10 Minuten in Xylol II, 10 Minuten in Xylol III, 5 Minuten in absolutes Ethanol I, 5 Minuten in absolutes Ethanol II, 5 Minuten in 75%igen Alkohol und waschen Sie sie in Wasser16.
- Färben Sie die Abschnitte 4 Minuten lang mit Hämatoxylin-Färbelösung, 1 % Salzsäurealkohollösung (75 % Alkohol) zur Differenzierung, 1 % Ammoniakwasserlösung blau zurück und waschen Sie sie mit Wasser.
- Färben Sie die Abschnitte 2 Minuten lang mit Eosin-Färbelösung und waschen Sie sie mit Wasser.
- Betrachten Sie die Schnitte mit einem Lichtmikroskop mit einer 200- und 400-fachen Vergrößerung.
- Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Analyse
- Identifizierung der Inhaltsstoffe von FP
HINWEIS: Die Analyse wird mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit hochauflösender Hybrid-Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometrie (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; siehe Materialtabelle) durchgeführt.- Messen Sie genau 1 g getrocknetes FP-Pulver ab und geben Sie es in einen sauberen 50-ml-Messkolben.
- Geben Sie 25 ml 70%iges Methanol in den Messkolben und wiegen Sie genau. Verwenden Sie eine Ultraschallbehandlung (im 4 °C warmen Wasserbad, Leistung: 250 W, Frequenz: 35 kHz) für 30 min, um die Auflösung zu unterstützen. Wiegen Sie erneut genau, um den Verlust nach der Auflösung genau zu bestimmen, und verwenden Sie 70 % Methanol, um den Verlust auszugleichen.
Anmerkungen: Messen Sie nicht das Volumen, da die Skala des Messkolbens nicht genau ist, insbesondere nach dem 4 °C warmen Wasserbad. - Schütteln, um vollständig zu mischen. Verwenden Sie zum Filtern eine mikroporöse Membran von 0,22 μm.
- Vorbereitung von Plasmaproben
- Präzise 100 μl Plasma (Schritt 2.2.7) in ein doppeltes Volumen (200 μl) Acetonitril in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben und mindestens 30 s lang mit einem Vortex-Vibrator vortexieren. Befolgen Sie dieses Verfahren für alle Proben.
- Alle Proben werden bei 17.200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände nach der Zentrifugation in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Trocknen Sie die Überstände unter Stickstoff. Rekonstituieren Sie mit 200 μl Extraktionslösungsmittel (Acetonitril:Wasser = 4:1 [v/v]).
- Die rekonstituierte Lösung wird mindestens 30 s lang gewirbelt und 10 Minuten lang mit Ultraschall behandelt (im 4 °C warmen Wasserbad, Leistung: 250 W, Frequenz: 35 kHz). Bei 17.200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Filtrieren Sie die Überstände mit 0,22 μm Filtermembranen und halten Sie sie zur Analyse bei 4 °C.
- Vorbereitung von Leberproben
- 90 mg Lebergewebe (Schritt 2.2.7) werden 1 min in eiskaltem Methanol-Wasser (1:1, v/v, 1 mL) homogenisiert und bei 21.500 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Übertragen Sie den Überstand in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Befolgen Sie dieses Verfahren für alle Proben.
- Extrahieren Sie die Ausfällungen nach dem gleichen Verfahren erneut und fassen Sie die Überstände in neuen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen zusammen. Trocknen Sie die Überstände unter Stickstoff. Rekonstituieren Sie mit 300 μl des Extraktionslösungsmittels (Methanol:Wasser = 4:1 [v/v]).
- Die rekonstituierte Lösung wird mindestens 30 s lang gewirbelt und 10 Minuten lang mit Ultraschall behandelt (im 4 °C warmen Wasserbad, Leistung: 250 W, Frequenz: 35 kHz). Bei 17.200 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Filtrieren Sie die Überstände mit 0,22 μm Filtermembranen und halten Sie sie zur Analyse bei 4 °C.
HINWEIS: Die gepoolten Qualitätskontrollproben (QC) wurden durch Mischen von 10-μl-Aliquoten aus jeder Plasma- und Leberprobe (eine pro sechs Proben) hergestellt.
- Analyseparameter der LC-MS
HINWEIS: Die mobile Phase besteht aus 0,1 % Ameisensäure (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B). Füllen Sie diese Lösungsmittel in eine saubere Glasflasche und verbinden Sie sie mit dem LC-MS-System.- Stellen Sie die Gradientenprogramme von Plasmaproben in der "Einlassdatei" des LC-MS-Systems wie folgt ein: 1 % B (0-1,5 min), 1 %-60 % B (1,5-13,0 min), 60 %-99 % B (13,0-20,0 min), bei 99 % B (20,0-25,0 min), 99 %-1 % B (25,0-25,1 min) und bei 1 % B bis 27 min halten.
- Stellen Sie die Autosampler-Bedingungen der Plasmaproben in der "Einlassdatei" des LC-MS-Systems wie folgt ein: das Injektionsvolumen, 2 μl; und die Flussrate von 0,3 ml/min für jede Analyse.
- Stellen Sie das Gradientenprogramm der Leberproben in der "Einlassdatei" des LC-MS-Systems wie folgt ein: 1 % B (0-1 min), 1 %-53 % B (1-15 min), 53 %-70 % B (15-30 min), 70 %-90 % B (30-32 min), 90 %-95 % B (32-40 min), 95 %-1 % B (40-42 min) und bis 45 min bei 1 % B halten.
- Stellen Sie die Autosampler-Bedingungen der Leberproben in der "Inlet-Datei" des LC-MS-Systems wie folgt ein: Injektionsvolumen, 5 μL; und die Flussrate von 0,3 ml/min für jede Analyse.
- Stellen Sie die MS-Detektionsbedingungen sowohl der Plasma- als auch der Leberprobe in der "MS-Tune-Datei" des LC-MS-Systems ein. Führen Sie die MS-Erfassung sowohl im positiven als auch im negativen Ionisationsmodus durch.
Anmerkungen: Die Parameter für die Ionisation des beheizten Elektrosprays sind wie folgt: Sprühspannung: 3,5 kV für positive Ionisation und 3,8 kV für negative Ionisation; Mantelgasdurchfluss: 55 Arb; Hilfsgasstrom: 15 Arb; Temperatur der Sondenheizung: 300 °C; und Kapillartemperatur: 350 °C. - Importieren Sie die gesammelten Rohdaten in die Compound Discoverer-Software und legen Sie die Methodenvorlage gemäß den Anweisungen des Herstellers fest (siehe Materialtabelle).
- Identifizierung der Inhaltsstoffe von FP
3. Metabolomische Validierung
HINWEIS: Die metabolomischen Profiling-Daten von Plasma- und Lebermetaboliten werden in die Compound Discoverer-Software importiert, um die Extraktion metabolischer Merkmale durchzuführen, indem ein Algorithmus zur Extraktion molekularer Merkmale verwendet wird. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Massenabweichung, 5 x 10-6; Massenbereich, 100-1.500; Schwellenwert für das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), 3; und Retentionszeitabweichung 0,05. Bewerten Sie die Stabilität und Wiederholbarkeit der Metabolomik anhand der relativen Standardabweichung (RSD) der QC-Peakbereiche.
- Verwenden Sie die SIMCA-P-Software (siehe Materialtabelle) für die multivariate statistische Analyse der Integralwerte, die aus LC-MS-Befunden gewonnen wurden. Verwenden Sie die orthogonale partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (OPLS-DA) für die mittelwertzentrierten Daten und die Modellierung von Stichprobenklassen.
- Betrachten Sie nach dem OPLS-DA-Test die Metaboliten mit Integral mit variabler Bedeutung in der Projektion (VIP) von >1 und einem p-Wert von <0,05 aus dem Student-t-Test als potenzielle differentielle Metaboliten.
- Identifizieren Sie die gestörten Metaboliten und Stoffwechselwege anhand offener Datenbankquellen, einschließlich Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) und MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
- Visualisieren Sie die Ergebnisansichten von MetaboAnalyst5.0 und der Plattform 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).
4. Molekulares Andocken
- Laden Sie die 3D-Struktur der ausgewählten FP-Inhaltsstoffe aus der TCMSP-Datenbank herunter. Suchen Sie die Namen der Inhaltsstoffe im Suchfeld "Chemischer Name" und laden Sie die entsprechenden 3D-Strukturdateien im mol2-Format herunter.
- Laden Sie die Kristallstrukturen der wichtigsten Targets aus der AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/) herunter. Suchen Sie die Zielnamen im Suchfeld und laden Sie die entsprechenden Kristallstrukturdateien im PDB-Format herunter.
- Importieren Sie die Datei mit Zutaten und Zielstrukturen in die AutoDockTools-Software. Klicken Sie auf Bearbeiten > Wasser löschen, um Wassermoleküle zu löschen. Klicken Sie auf Bearbeiten > Wasserstoffe > Hinzufügen , um Wasserstoff hinzuzufügen. Legen Sie die Inhaltsstoffe als "Liganden" fest und führen Sie ein blindes Andocken durch, indem Sie die gesamten Ziele als "Rezeptor" auswählen17.
- Geben Sie einen Wert in das Feld hinter "center" und "size" ein, um den neu entwickelten Raum so anzupassen, dass der Ligand und der Rezeptor vollständig umschlossen werden können. Speichern Sie die Liganden- und Rezeptordateien im pdbqt-Format.
- Verwenden Sie AutoDock Vina, um molekulares Docking durchzuführen. Setzen Sie den Balken "Rezeptor" auf den Namen der Datei "receptor.pdbqt" und den Balken "Ligand" auf den Namen der Datei "ligand.pdbqt". Ermitteln Sie die optimale Position für die Bindung des Liganden an den Rezeptor. Notieren Sie den Bindungsenergiewert an der optimalen Position.
HINWEIS: Der Andockvorgang wurde mit dem genetischen Algorithmus14 berechnet. Bei allen Optionen für die Dockingausführung handelte es sich um Standardwerte. Das Andocken von Frames wird automatisch von der höchsten zur niedrigsten Bindungsenergie gereiht. - Importieren Sie die Docking-Dateien in PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index), um das visuelle Systemmodell zu erhalten. Laden Sie die Modelldateien im PSE-Format herunter und importieren Sie sie in die PyMOL-Software (siehe Materialtabelle), um weitere Visualisierungen zu erstellen.
5. Statistische Analyse
HINWEIS: Verwenden Sie für die Datenanalyse die Statistiksoftware SPSS (siehe Materialtabelle). Betrachten Sie den Wert von p < 0,05 als statistisch signifikant.
- Drücken Sie die Werte als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus.
- Führen Sie eine einfaktorielle ANOVA durch, gefolgt von einer Post-hoc-LSD-Analyse (Least Significant Difference), Dunnett (bei gleicher Varianz) oder Dunnetts T3 (bei ungleicher Varianz), um die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen zu testen.
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Representative Results
Netzwerk Pharmakologie
Insgesamt wurden 18 potentielle Inhaltsstoffe in FP nach ihren pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften aus der Datenbank und der LC-MS-Analyse gescreent (die Gesamtionenchromatogramme sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt). In der einschlägigen Literatur wird darauf hingewiesen, dass der Gehalt an Gallussäure viel höher ist als bei anderen Inhaltsstoffen und die Lipide wirksam senkt 9,11. Daher wurde auch dieser Inhaltsstoff als potenzieller Inhaltsstoff angesehen. Insgesamt wurden 19 Inhaltsstoffe und 134 inhaltsstoffbezogene Ziele von FP gegründet. Alle 19 Inhaltsstoffe sind in Tabelle 1 aufgeführt. Um die repräsentativsten Inhaltsstoffe für die weitere Analyse auszuwählen, wurden diese Inhaltsstoffe in die Datenbank des Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) importiert. Laut dem Ingredient-Target-Pathway-Disease-Netzwerk wurden einige bioaktive Inhaltsstoffe wie Gallussäure, Quercetin und Beta-Sitosterol als die wichtigsten Bestandteile von FP im Zusammenhang mit Hypercholesterinämie und koronarer Atherosklerose identifiziert (ergänzende Abbildung 2). Unter diesen ist Gallussäure eine der am besten untersuchten Phenolsäuren; Es ist der wichtigste bioaktive Inhaltsstoff, der im RP18 vorgestellt wird. Inzwischen ist Gallussäure auch der Inhaltsstoff mit dem höchsten Gehalt in FP; Seine Konzentration beträgt in der Regel 1 % bis 3 %. El-Hussainy et al.19 haben gezeigt, dass Gallussäure Herzschäden begrenzen, das Lipidprofil verbessern und kardiale Entzündungsmarker herunterregulieren kann. Der Gehalt an Quercetin und Beta-Sitosterol ist geringer, aber einige Studien haben ihre Wirkung auf die Senkung der Lipide nachgewiesen. Quercetin, als wichtiges Flavonoid, das in Pflanzen weit verbreitet ist, hat verschiedene Eigenschaften, wie z. B. antioxidative, entzündungshemmende und kardiovaskuläre Schutzwirkungen20. Lu et al.21 haben untersucht, dass der mit Quercetin angereicherte Saft die TC-, LDL-C- und HDL-C-Spiegel bei gesunden Personen mit leichter Hypercholesterinämie abschwächen kann. Was Beta-Sitosterol betrifft, so haben klinische Studien gezeigt, dass Pflanzensterin Hypercholesterinämie und Herz-Kreislauf-Erkrankungen signifikant vorbeugen kann22,23. Althwab et al.24wiesen nach, dass Beta-Sitosterol das Lipidprofil und den atherogenen Index bei HFD-Ratten verbessern kann. Es ist ersichtlich, dass die lipidsenkende Wirkung von FP mit diesen drei Inhaltsstoffen zusammenhängen könnte.
Zusätzlich wurden 1.552 Targets für Hyperlipidämie aus den Genecards-, OMIM- und TTD-Datenbanken gesammelt. Nach dem Abgleich der 134 FP-bezogenen Targets mit den Hyperlipidämie-bezogenen Targets wurden 62 Targets als potenzielle Targets für FP gegen Hyperlipidämie identifiziert (Abbildung 2A). Alle durchschnittenen Ziele wurden laut der UniProt-Datenbank auf ihre offiziellen Symbole normalisiert. Anschließend wurde das PPI-Netzwerk mit Hilfe von STRING (Abbildung 2B) und Cytoscape (Abbildung 2C) aufgebaut. Kombiniert man die Ergebnisse der Berechnungsmethoden, waren die Top-10-Ziele ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 und MYC. Die Details sind in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Alle diese 62 Ziele bilden die Grundlage für weitere Analysen, die mit den Ergebnissen der Metabonomik integriert werden.
GO- und KEGG-Signalwege wurden mittels Anreicherungsanalyse durchgeführt. Die 15 besten Pfade, entsprechend der Anzahl der Ziele, wurden für die Analyse anhand des p-Wertes ausgewählt. Die Ergebnisse der GO-Anreicherung deuten darauf hin, dass die biologischen Prozesse und die molekulare Funktion von FP gegen Hyperlipidämie hauptsächlich mit der Genexpression und der Proteinbindung zusammenhängen (Abbildung 2D). Die KEGG-Anreicherung bewies, dass FP in den Prozess des Fettstoffwechsels und der Atherosklerose eingreifen kann (Abbildung 2E), was bedeutet, dass FP Hyperlipidämie durch Beeinflussung des Fettstoffwechsels lindert.
Die Wirkung von FP auf den Plasmalipidspiegel und den Leberindex
Um die verbesserte Wirkung von FP auf Hyperlipidämie zu testen, wurden zunächst die Veränderungen von TC, TG, LDL-C, HDL-C und dem Leberindex (das Verhältnis von Lebergewicht zu Körpergewicht) gemessen. Im Vergleich zur NC-Gruppe zeigten die Mäuse der HFD-Gruppe einen signifikanten Anstieg der Plasmaspiegel von TC (p < 0,001), LDL-C (p < 0,001) und TG (p < 0,05), was darauf hindeutet, dass eine langfristige HFD-Intervention die Lipidspiegel erhöhen und eine Hyperlipidämie induzieren kann (Abbildung 3).
Nach Verabreichung von wässrigem FP-Extrakt waren die TC-Spiegel in FP_L und FP_H Gruppen signifikant (p < 0,05) um 18,8 % bzw. 12,4 % reduziert (Abbildung 3A). Die LDL-C-Spiegel in FP_L und FP_H Gruppe waren signifikant (p < 0,05) um 13,7 % bzw. 21,8 % reduziert (Abbildung 3B). In Bezug auf den HDL-C-Spiegel war die FP_H-Gruppe signifikant (p < 0,01) von 1,81 ± 0,08 mmol/L auf 2,65 ± 0,16 mmol/L im Vergleich zur HFD-Gruppe erhöht (Abbildung 3C). Obwohl der TG-Spiegel nach der FP-Intervention nicht signifikant blieb, war er im Vergleich zur HFD-Gruppe reduziert (Abbildung 3D). Jüngste Studien haben gezeigt, dass der Index des LDL-C/HDL-C-Verhältnisses bei der Vorhersage von Herz-Kreislauf-Erkrankungen ein besserer Index ist als LDL-C oder HDL-C allein25,26. Im Vergleich zur HFD-Gruppe war das LDL-C/HDL-C-Verhältnis in der FP_H-Gruppe signifikant (p < 0,01) um 46,3 % reduziert (Abbildung 3E), was bedeutet, dass die FP-Intervention das schlechte Cholesterin senkte und den guten Cholesterinspiegel erhöhte. Das Lebergewicht als Hauptorgan des Fettstoffwechsels spiegelt in gewissem Maße die Fettspeicherung bei Mäusenwider 27. Nach 12 Wochen waren die Leberindizes in der FP_L-Gruppe und FP_H-Gruppe im Vergleich zur HFD-Gruppe signifikant (p < 0,01) reduziert (Abbildung 3F). Die PC-Gruppe zeigte auch eine unterschiedliche Reduktion dieser oben genannten Indikatoren, was zeigt, dass FP ähnliche Wirkungen wie Statine hatte und die schützende Wirkung eine Dosis-Wirkungs-Beziehung aufwies.
Verschiedene klinische Studien zeigten, dass nach der Einnahme von Extrakt oder ganzem FP für eine Weile die TC- und LDL-C-Spiegel signifikant gesenkt wurden. Währenddessen wurde der HDL-C-Spiegel bei langfristiger Verabreichung vonFP 28,29 deutlich angehoben. Nambiar und Shetty30 fanden heraus, dass FP-Saft oxidierte Lipoproteine niedriger Dichte reduzieren kann, wodurch das Risiko einer Arteriosklerose erheblich verringert wird. Gopa et al.31 untersuchten die hypolipidämische Wirkung von FP bei Patienten mit Hyperlipidämie und verglichen sie mit Simvastatin. Die Behandlung mit FP führte zu einer deutlichen Verringerung von TC, LDL-C und TG und einem signifikanten Anstieg der HDL-C-Spiegel, ähnlich wie bei Simvastatin. In dieser Studie hatten FP und Simvastatin auch ähnliche therapeutische Wirkungen, und die LDL-C-senkende Wirkung und die hepatische Reparaturwirkung von FP waren Simvastatin überlegen.
Histopathologische Beobachtung der Leber
Die Wirkung von FP auf die hepatische Steatose bei HFD-Mäusen ist in Abbildung 4 dargestellt. Die pathologischen Leberschnitte in der NC-Gruppe wiesen eine regelmäßige Hepatozytenmorphologie, klar definierte Zellgrenzen und keine offensichtlichen Fettvakuolen auf (Abbildung 4A,B). Im Vergleich dazu wies die HFD-Gruppe Fettvakuolen unterschiedlicher Größe um die Blutgefäße herum auf und zeigte eine offensichtliche Leberschädigung, die durch Zellschwellung, Fettdegeneration, Verlust der Zellgrenzen, Zellkontraktion und Hepatozytennekrose gekennzeichnet war (Abbildung 4C, D). Wie in Abbildung 4E,F dargestellt, könnte eine FP-Intervention die Lebersteatose verbessern, insbesondere in der FP_L Gruppe. Im Vergleich zur HFD-Gruppe wiesen die FP_H (Abbildung 4G,H) und die PC-Gruppe (Abbildung 4I,J) ein gewisses Maß an Erholung der Leberzellstruktur, Fettdegeneration und Fettvakuolenreduktion auf. Das bedeutet, dass eine FP-Intervention das Lebergewebe vor HFD-induzierten Leberschäden schützen kann.
Metabolomics-Profilerstellung
Nach dem Plasmalipidspiegel und der leberhistopathologischen Beobachtung hatte eine hochdosierte FP eine bessere Wirkung auf die Hyperlipidämie als eine niedrig dosierte FP. Daher wurden NC-, HFD- und FP_H-Gruppen ausgewählt, um deren Veränderung des Stoffwechselniveaus zu analysieren. Die Gesamtionenchromatogramme der QC-Proben sind in der ergänzenden Abbildung 4 dargestellt. Um die Genauigkeit der Daten zu gewährleisten, wurden die Merkmale mit RSD-Werten >30 % aus allen QC-Proben entfernt. PCA- und Ionenchromatogramme zeigten, dass die QC-Proben während des Prozesses stabil waren (ergänzende Abbildung 5). Nach der Datenvorverarbeitung wurden insgesamt 626 bzw. 562 Merkmale im Plasma und in der Leber bestimmt. Darunter wurden 120 bzw. 124 Metaboliten im Plasma bzw. in der Leber auf Basis der KEGG-Datenbank identifiziert. Die OPLS-DA-Analyse wurde verwendet, um die Trennung zwischen den NC-, HFD- und FP_H-Gruppen zu untersuchen. OPLS-DA zeigte, dass sich die gleichen Gruppenproben und die verschiedenen Gruppenproben gut unterschieden (Abbildung 5A,B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die HFD- und FP-Interventionen offensichtliche metabolische Variationen verursachten.
Um die potentiellen differentiellen Metaboliten zu identifizieren, die zur metabolischen Unterscheidung beigetragen haben, wurden weitere OPLS-DA- und t-Test-Analysen von NC versus HFD bzw. HFD versus FP_H durchgeführt. Die OPLS-DA-Ergebnisse unterschieden sich gut und zeigten signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Modellgruppen14 (ergänzende Abbildung 6). Basierend auf VIP (Variable important in projection) >1 und p < 0,05 zeigten 32 Metaboliten im Plasma eine Differenzierung zwischen der NC- und der HFD-Gruppe und 72 Metaboliten eine Differenzierung zwischen der HFD- und der FP_H Gruppe. In der Leber zeigten 38 Metaboliten eine Differenzierung zwischen der NC- und der HFD-Gruppe und 17 Metaboliten eine Differenzierung zwischen der HFD- und der FP_H Gruppe. Schließlich wurden insgesamt 16 bzw. 6 Metaboliten als differentielle Metaboliten in FP-beeinflussenden HFD-Mäusen im Plasma bzw. in der Leber identifiziert (ergänzende Abbildung 7). Die Informationen zu diesen Metaboliten sind in Tabelle 2 dargestellt.
Um die Variation der Metaboliten zwischen den drei Gruppen zu visualisieren, wurden Heatmaps mit MetaboAnalyst 5.0 erstellt. Alle differentiellen Metaboliten im Plasma und in der Leber waren in der HFD-Gruppe verändert und die meisten von ihnen wurden in der FP-Gruppe umgekehrt, was darauf hindeutet, dass eine FP-Intervention die Stoffwechselstörung verbessern kann (Abbildung 5C,D). Darüber hinaus wurden differentielle Metaboliten in MetaboAnalyst 5.0 importiert, um die Stoffwechselwege von FP in HFD-Mäusen zu untersuchen. Basierend auf p < 0,05 und einem Signalweg >0,10 war der Tryptophan-Stoffwechsel im Plasma signifikant beeinflusst, und die mit diesem Signalweg verbundenen Metaboliten waren D-Tryptophan und L-Kynurenin (Abbildung 5E). Jung et al.32 untersuchten, dass eine anhaltende Hyperlipidämie den Serumspiegel von Kynurenin senken kann. Der Taurin- und Hypotaurinstoffwechsel war in der Leber signifikant beeinflusst, und der verwandte Metabolit war Taurin (Abbildung 5F). Taurin ist eine wichtige und notwendige Aminosäure im tierischen Körper; Dong et al.33 untersuchten, dass Taurin die Schädigung der Blutfette leicht reduzieren und das durch HFD verursachte Atheroskleroserisiko senken kann. In dieser Forschung erhöhte die FP-Intervention den Gehalt an L-Kynurenin und Taurin, was positiv mit der Senkung des Lipidspiegels zusammenhängt und die Wirksamkeit von FP gegen Hyperlipidämie unterstützt.
Integrierte Analyse von Netzwerkpharmakologie und Metabolomik
Eine integrierte Strategie der Netzwerkpharmakologie in Kombination mit der Metabolomik ist bei der Erforschung von Krankheitsmechanismen und Interventionsstrategien immer unverzichtbarer geworden. Die Relevanz zwischen Netzwerkpharmakologie und Metabolomik wurde mit begrenzter Evidenz nachgewiesen. Um einen umfassenden Überblick über den Mechanismus von FP gegen Hyperlipidämie zu erhalten, wurden die auf Netzwerkpharmakologie und Metabolomik basierenden Interaktionsnetzwerke konstruiert. Differentielle Metaboliten wurden in das MetScape-Plugin in Cytoscape importiert und mit den in der Netzwerkpharmakologie identifizierten Hub-Genen abgeglichen, um die Compound-Reaction-Enzym-Gennetzwerke zu sammeln (Abbildung 6). Wie in Tabelle 3 gezeigt, waren L-Kynurenin und Corticosteron in Plasmametaboliten mit CYP1A1 verwandt, das die Lipidperoxidation katalysieren und eine nichtalkoholische Fettlebererkrankung induzieren kann34,35; Die betroffenen Signalwege waren der Tryptophan-Stoffwechsel bzw. die Steroidhormon-Biosynthese. Acetylcholin war mit AChE verwandt und beeinflusste den Glycerophospholipidstoffwechsel. In Lebermetaboliten wurden MGAM und Raffinose mit dem Galaktosestoffwechsel in Verbindung gebracht. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Einnahme von Oligosacchariden der Raffinosefamilie Stoffwechselstörungen bei HFD-Mäusen verbessern könnte36.
Darüber hinaus wurde das Netzwerk von Inhaltsstoffen, Zielen, Metaboliten und Signalwegen aufgebaut (Abbildung 7). In den Inhaltsstoffen verband Quercetin die meisten Ränder, was darauf hindeutet, dass Quercetin von FP die wichtigste Rolle bei der Senkung der Lipide spielt. Die oben integrierte Analyse enthüllte die wichtigsten Ziele, Metaboliten und Signalwege von FP gegen Hyperlipidämie, was die Grundlage für weitere Studien des therapeutischen Mechanismus und der klinischen Anwendung dieses Arzneimittels sein könnte.
Molekulares Andocken
Um die Möglichkeit einer Interaktion zwischen den ausgewählten Inhaltsstoffen und den wichtigsten Targets weiter zu untersuchen, wurde molekulares Docking verwendet, um deren Liganden-Aktivstellen-Interaktionen zu analysieren. Für das molekulare Andocken wurde die AutoDock Vina-Software (siehe Materialtabelle) verwendet, und die erste Andockpose wurde entsprechend dem Rang der Scoring-Funktion ausgegeben. Die Andockergebnisse sind in Abbildung 8 dargestellt.
In der integrierten Analyse wurden CYP1A1, AChE und MGAM mit differentiellen Metaboliten in Beziehung gesetzt; Sie bauten Brücken zwischen Zielmolekülen und Metaboliten. Ein weiteres molekulares Docking wurde durchgeführt, um die Beziehung zwischen dem Target und den Inhaltsstoffen zu überprüfen. Die Ergebnisse des Andockens der Inhaltsstoffe an CYP1A1 waren wie folgt: Gallussäure bildete vier Wasserstoffbrückenbindungen durch die Aminosäurereste Asn-185, Tyr-187, Asn-219 und His-500 und bildete π-π-Stapelinteraktion durch den Aminosäurerest Tyr-187 (Abbildung 8A); Quercetin bildete drei Wasserstoffbrückenbindungen durch Asn-185, Asn-219 und His-500, hydrophobe Wechselwirkung und π-π-Stapelwechselwirkung durch Tyr-187 (Abbildung 8B); Beta-Sitosterol bildete vier Wasserstoffbrückenbindungen durch Arg-362, Ser-363, Leu-365 und Arg-464 und hydrophobe Wechselwirkung durch Glu-369 und Ile-439 (Abbildung 8C). Die Bindungsenergien betrugen 5,3, 7,0 bzw. 7,3 kcal/-mol. In der Wechselwirkung mit AChE wurde Gallussäure durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Arg-237, Arg-238 und Arg-480 stabilisiert (Abbildung 8D); Quercetin wurde durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Arg-237 und Phe-474, durch hydrophobe Wechselwirkung mit Phe-157 und durch π-π-Stapelwechselwirkung mit Tyr-478 stabilisiert (Abbildung 8E); Beta-Sitosterol wurde durch hydrophobe Wechselwirkung mit Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 und TYR478 stabilisiert (Abbildung 8F). Die Bindungsenergien betrugen 5,0, 6,5 bzw. 8,0 kcal/- mol. In der Wechselwirkung mit MGAM wurde Gallussäure durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Ile-1716, Gly-1747 und Trp-1749 sowie durch hydrophobe Wechselwirkung mit Tyr-1715 und Trp-1749 stabilisiert (Abbildung 8G); Quercetin wurde durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 und Trp-1752, durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Arg-1730 und durch π-π-Stapelung mit His-1727 stabilisiert (Abbildung 8H); beta-Sitosterol wurde durch hydrophobe Wechselwirkung mit Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 und Phe-1560 stabilisiert. Die Bindungsenergien betrugen 5,9, 8,1 bzw. 6,9 kcal/mol. Detaillierte Informationen zu den Wechselwirkungen und Bindungsaffinitäten sind in Tabelle 4 dargestellt. Mehrere Bindungsstellen und hohe Bindungsenergien erklären die hohe Affinität zwischen Inhaltsstoffen und Proteinzielen, was bestätigt, dass diese Inhaltsstoffe die Rolle der Lipidsenkung spielen, indem sie auf Hyperlipidämie-bezogene Ziele wirken.
Abbildung 1: Schematisches Flussdiagramm der integrierten Strategie. Die Inhaltsstoffe und Gene des Hubs wurden mittels Netzwerkpharmakologie extrahiert (Teil 1). Differentielle Metaboliten von FP gegen Hyperlipidämie wurden mittels Plasma- und Lebermetabolomik analysiert (Teil 2). Die wichtigsten Ziele, Metaboliten und Signalwege wurden auf der Grundlage einer integrierten Analyse von Teil 1 und Teil 2 (Teil 3) identifiziert und verknüpft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Target-Screening, Netzwerkkonstruktion und Anreicherungsanalyse der Wirkung von FP gegen Hyperlipidämie . (A) Venn-Diagramm der FP-Hyperlipidämie-Ziele. (B) Potenzielles Netzwerk von Wirkstoffen, Wirkstoffen und Krankheiten: verschiedene Farbsymbole, wie hier erwähnt: Krankheit (rot), Arzneimittel (blau), Inhaltsstoffe (grün) und Ziele (gelb). (C) PPI-Netzwerk nach STRING. (D) Analyse der Anreicherung des GO-Signalwegs. (E) Analyse der Anreicherung des KEGG-Signalwegs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Wirkung von FP auf den Plasmalipidspiegel und den Leberindex bei Mäusen mit HFD-induzierter Hyperlipidämie (n = 6). (A) TC-Spiegel. (b) LDL-C-Spiegel. (C) HDL-C-Spiegel. (D) TG-Niveau. (E) Das LDL-C/HDL-C-Verhältnis. (F) Leberindizes.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA bewertet, gefolgt von einem Dunnett-Mehrfachvergleichstest oder einer Post-hoc-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Wirkung von FP auf Lebergewebe bei Mäusen mit HFD-induzierter Hyperlipidämie (H&E-Färbung). (A,B) NC-Gruppe, (C,D) HFD-Gruppe, (E,F) FP_L-Gruppe, (G,H) FP_H-Gruppe, (I,J) PC-Gruppe (n = 6). Maßstabsleiste: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Die OPLS-DA-Score-Diagramme, Heatmaps und Stoffwechselwege von differentiellen Metaboliten. Der OPLS-DA-Score zeigt FP-Diagramme auf HFD-Mäusen im Plasma (A) und in der Leber (B). Die Heatmaps der differentiellen Metaboliten im Plasma (C) und in der Leber (D). Die Stoffwechselwege unterschiedlicher Metaboliten im Plasma (E) und in der Leber (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Die Compound-Reaction-Enzym-Gen-Netzwerke der wichtigsten Metaboliten und Ziele. Knoten mit niedrigem Grad wurden entfernt. Die roten Sechsecke, blauen Kreise, runden grünen Rechtecke und grauen Rauten stehen für die Wirkstoffe, Gene, Proteine bzw. Reaktionen. Die wichtigsten Ziele und Metaboliten wurden vergrößert. Die Bahnen mit dem weißen Hintergrund sind im Plasma stark reguliert. Der Weg mit dem grauen Hintergrund ist in der Leber stark reguliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Das Netzwerk aus Inhaltsstoffen, Zielen, Metaboliten und Signalwegen. Je dunkler die Farbe, desto mehr verbundene Kanten sind vorhanden, was darauf hinweist, dass der Knoten in diesem Netzwerk wichtiger ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Die Interaktionsdiagramme der FP-Inhaltsstoffe und die wichtigsten Ziele . (A) Gallussäure, die auf CYP1A1 wirkt. (B) Quercetin, das auf CYP1A1 wirkt. (C) Beta-Sitosterol, das auf CYP1A1 wirkt. (D) Gallussäure, die auf AChE wirkt. (E) Quercetin, das auf AChE wirkt. (F) Beta-sitosteroling-Handlung auf AChE. (G) Gallussäure, die auf MGAM wirkt. (H) Quercetin, das auf MGAM wirkt. (I) Beta-Sitosterol, das auf MGAM wirkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Überblick über das Ergebnis von FP gegen Hyperlipidämie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Die ausgewählten Inhaltsstoffe des wässrigen FP-Extrakts. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Die unterschiedlichen Metaboliten zwischen den drei Gruppen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Die Informationen zu den wichtigsten Zielen, Metaboliten und Signalwegen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Bindungsstellen und Aktionskräfte zwischen FP-Inhaltsstoffen und Zielproteinen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Die positiven und negativen Ionenchromatogramme des wässrigen FP-Extrakts. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Das FP-Ingredient-Target-Pathway-Disease-Netzwerk von BATMAN-TCM. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Die Häufigkeitsanalyse von Hub-Genen in der Netzwerkpharmakologie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Ionenchromatogramme von Plasma- und Leber-QC-Proben. Die repräsentativen positiven (A) und negativen (B) Ionenchromatogramme von Plasma-QC-Proben. Die repräsentativen positiven (C) und negativen (D) Ionenchromatogramme von Leber-QC-Proben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 5: Die PCA-Score-Diagramme von Plasma- (A) und Leber- (B) QC-Proben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 6: Die OPLS-DA-Score-Diagramme von Plasma- (A und B) und Leberproben (C und D). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 7: Venn-Diagramme der differentiellen Metaboliten in Plasma- (A) und Leberproben (B). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In den letzten Jahren ist die Inzidenzrate von Hyperlipidämien gestiegen, was vor allem auf langfristige ungesunde Essgewohnheiten zurückzuführen ist. Die TCM und ihre chemischen Inhaltsstoffe haben verschiedene pharmakologische Aktivitäten, die in den letzten Jahren umfassend untersucht wurden37,38. FP ist eine Art Fruchtressource, die sowohl als Medizin als auch als Lebensmittel verwendet wird und ein wichtiges Potenzial zur Behandlung von Hyperlipidämie hat. Der potentielle therapeutische Mechanismus von FP gegen Hyperlipidämie muss jedoch weiter untersucht werden.
Die Netzwerkpharmakologie bewertet die polypharmakologischen Wirkungen von Arzneimitteln auf molekularer Ebene und sagt die Wechselwirkung von Naturstoffen und Proteinen voraus, um den Hauptmechanismus zu bestimmen39. Der erste Schritt besteht darin, die Wirkstoffe und Hauptziele des Medikaments auszuwählen. Dabei wurden neun Wirkstoffe und 62 Hub-Gene gefunden. Um den molekularen Mechanismus von FP auf Hyperlipidämie besser zu verstehen, wurden PPI und Ingredient-Target-Netzwerke auf der Grundlage von netzwerkpharmakologischen Analysen etabliert. Um den Umfang der Hauptinhaltsstoffe und Zielstrukturen einzugrenzen, wurden drei Hauptinhaltsstoffe (Gallussäure, Quercetin und Beta-Sitosterol) im Zusammenhang mit Hypercholesterinämie und koronarer Atherosklerose von BATMAN-TCM gegründet. Alle diese Inhaltsstoffe könnten den LDL-C-Spiegel senken oder den HDL-C-Spiegel erhöhen, was die spezifischen Auswirkungen von FP auf Hyperlipidämie bestätigt. Außerdem hängt die Funktion von FP bei Hyperlipidämie laut KEGG-Anreicherungsanalyse mit der Aktivität des Lipid- und Atherosklerose-Signalwegs zusammen. Obwohl diese Methode zu sehr von der Datenbank abhängt und keine experimentelle Verifikation hat, hat sie einen theoretischen Wert und liefert Anregungen für die anschließende experimentelle Verifikationsforschung.
Zur weiteren experimentellen Validierung wurden Mäuse 8 Wochen lang mit einer fettangereicherten Diät gefüttert, um eine Hyperlipidämie zu induzieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Plasmaspiegel von TC, LDL-C und TG signifikant erhöht waren. Obwohl der HDL-C-Spiegel deutlich abnahm, stieg das Verhältnis von LDL-C zu HDL-C deutlich an. Die histopathologischen Beobachtungen zeigten, dass das Lebergewebe von HFD-Mäusen stark geschädigt war, aber es gab keinen signifikanten Anstieg des Leberindex; Es kann sein, dass Veränderungen des Körpergewichts und des viszeralen Gewichts länger dauern. Die Lipide und Leberveränderungen zeigten adäquat den Interventionseffekt von FP auf Hyperlipidämie. Der interne Mechanismus des Interventionseffekts muss jedoch noch weiter erforscht werden.
Metabolomics bietet eine Liste potenzieller Metaboliten und verwandter Signalwege, die darauf abzielen, den Mechanismus von Stoffwechselerkrankungen und die Wirkung von therapeutischen Medikamenten zu erforschen40. Das Ergebnis der Metabolomik kann durch die Art der Probe beeinflusst werden. Unter Berücksichtigung der pathogenen Eigenschaften der Hyperlipidämie wurden in dieser Arbeit Plasma- und Leberproben für die metabonomische Analyse ausgewählt. Nach den OPLS-DA-Ergebnissen wurden die Metaboliten der NC-, HFD- und FP_H-Gruppen gut unterschieden. Insgesamt wurden 16 differentielle Metaboliten im Plasma und 6 differentielle Metaboliten in der Leber gefunden. Es gab mehr beeinflusste Metaboliten im Plasma als in der Leber, was beweist, dass Blut der Hauptort von Stoffwechselstörungen ist, die durch Hyperlipidämie induziert werden. Eine FP-Intervention kann die Veränderung dieser Metaboliten unter dem Einfluss von HFD rückgängig machen. Des Weiteren wurden diese differentiellen Metaboliten in die KEGG-Datenbank importiert. Die signifikanten Stoffwechselwege der differentiellen Metaboliten im Plasma waren der Tryptophanstoffwechsel und in der Leber der Taurin- und Hypotaurinstoffwechsel. In dieser Forschung erhöhte die FP-Intervention den Gehalt an L-Kynurenin des Tryptophan-Stoffwechsels und den Taurin-Gehalt des Taurin- und Hypotaurin-Stoffwechsels, was bedeutet, dass FP bei der günstigen Anpassung von Stoffwechselstörungen und Hyperlipidämie wirksam sein könnte. Die Metabolomics-Analyse zeigte, welche Metaboliten mit Hyperlipidämie oder FP-Intervention in Verbindung standen, und bestimmte den nachgeschalteten Mechanismus des FP-Effekts.
Durch die Kombination der Ergebnisse der Netzwerkpharmakologie mit der Metabolomik konnten drei Schlüsselziele (CYP1A1, AChE und MGAM) in den Compound-Reaction-Enzym-Gen-Netzwerken identifiziert werden. Laut molekularer Docking-Analyse zeigten diese Targets eine hohe Affinität zu FP-Inhaltsstoffen (Gallussäure, Quercetin und Beta-Sitosterol). Vier Metaboliten (L-Kynurenin, Corticosteron, Acetylcholin und Raffinose) und vier verwandte Signalwege (Tryptophanstoffwechsel, Steroidhormonbiosynthese, Glycerophospholipidstoffwechsel und Galaktosestoffwechsel) wurden als die wichtigsten Metaboliten und Stoffwechselwege identifiziert. Unter diesen war Quercetin mit den meisten Zielen assoziiert, und der Tryptophan-Stoffwechsel erschien sowohl in der Metabonomik als auch in den integrierten Ergebnissen. Sie spielen die wichtigste Rolle bei der therapeutischen Wirkung von FP gegen Hyperlipidämie. Das molekulare Docking-Ergebnis zeigte, dass CYP1A1, AChE und MGAM eine hohe Affinität zu Inhaltsstoffen aufweisen. Die oben genannten Ergebnisse belegen, dass diese gescreenten Targets eng mit der therapeutischen Wirkung von FP zusammenhängen.
In der vorliegenden Arbeit wurden Gallussäure, Quercetin und Beta-Sitosterol als FP-Wirkstoffe zur Bekämpfung der Hyperlipidämie identifiziert, und der Tryptophan-Stoffwechsel ist der Hauptstoffwechselweg der FP-Therapie bei HFD-Mäusen. Die Übersicht über das Ergebnis ist in Abbildung 9 dargestellt. Diese Forschung lieferte Daten und theoretische Unterstützung für weitere Studien der Mechanismen und bildete die Grundlage für die klinische Anwendung der FP-Medizin. Es hat sich auch gezeigt, dass natürliche Lebensmittel eine vielversprechende Option mit großen Aussichten in der klinischen Praxis sein könnten. Es gibt jedoch noch einige Mängel in dieser Forschung. Die therapeutische Wirkung des Wirkstoffs allein bei Hyperlipidämie ist nicht nachgewiesen. Darüber hinaus wurde der Weg der wichtigsten Zielmoleküle nicht untersucht. Es braucht auch weitere systematische molekularbiologische Experimente, um den genauen Mechanismus zu verifizieren.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch das Produktentwicklungs- und Innovationsteam der TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) und Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+" unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | \ | |
| 80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| 80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
| Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
| AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | \ | |
| BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | \ | |
| Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | \ | |
| DM500 Optical Microscope | Leica | \ | |
| DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
| Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
| HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
| High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
| Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | \ | |
| Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | \ | |
| Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
| Image-forming System | LIOO | \ | |
| JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | \ | |
| LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | \ | Version 2.3.2 |
| Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
| Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | \ | Version 14.1 |
| RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | \ | |
| RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | \ | Version 26.0 |
| SIMCA-P | Umetrics AB | \ | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
| SPSS | International Business Machines Corporation | \ | |
| TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
| Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
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