Summary
Här beskrivs ett protokoll, extended endothelial cell culture method (EECM), som möjliggör differentiering av pluripotenta stamceller till hjärnans mikrovaskulära endotelcellsliknande (BMEC)-liknande celler. Dessa celler visar uttryck av endotelcelladhesionsmolekyler och är därför en human blod-hjärnbarriärmodell lämplig för att studera immuncellsinteraktioner in vitro.
Abstract
Dysfunktion i blod-hjärnbarriären (BBB) är ett patologiskt kännetecken för många neurodegenerativa och neuroinflammatoriska sjukdomar som påverkar centrala nervsystemet (CNS). På grund av den begränsade tillgången till sjukdomsrelaterade BBB-prover är det fortfarande inte väl förstått om BBB-fel är orsakande för sjukdomsutveckling eller snarare en följd av den neuroinflammatoriska eller neurodegenerativa processen. Humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) ger därför en ny möjlighet att etablera in vitro BBB-modeller från friska donatorer och patienter, och därmed att studera sjukdomsspecifika BBB-egenskaper från enskilda patienter. Flera differentieringsprotokoll har upprättats för att härleda hjärnans mikrovaskulära endotelceller (BMEC)-liknande celler från hiPSC. Övervägande av den specifika forskningsfrågan är obligatorisk för korrekt val av respektive BMEC-differentieringsprotokoll. Här beskriver vi den utökade endotelcellodlingsmetoden (EECM), som är optimerad för att differentiera hiPSC till BMEC-liknande celler med en mogen immunfenotyp, vilket möjliggör studier av immuncell-BBB-interaktioner. I detta protokoll differentieras hiPSC först till endoteliala stamceller (EPC) genom att aktivera Wnt / β-catenin-signalering. Den resulterande kulturen, som innehåller glattmuskelliknande celler (SMLC), passeras sedan sekventiellt för att öka renheten hos endotelceller (EC) och för att inducera BBB-specifika egenskaper. Samodling av EECM-BMEC med dessa SMLC eller konditionerat medium från SMLC möjliggör reproducerbart, konstitutivt och cytokinreglerat uttryck av EC-adhesionsmolekyler. Viktigt är att EECM-BMEC-liknande celler etablerar barriäregenskaper som är jämförbara med primära humana BMEC, och på grund av deras uttryck av alla EC-vidhäftningsmolekyler skiljer sig EECM-BMEC-liknande celler från andra hiPSC-härledda in vitro BBB-modeller . EECM-BMEC-liknande celler är således den modell som valts för att undersöka den potentiella effekten av sjukdomsprocesser på BBB-nivå, med en inverkan på immuncellsinteraktion på ett personligt sätt.
Introduction
Den neurovaskulära enheten (NVU) i centrala nervsystemet (CNS) består av de högspecialiserade mikrovaskulära endotelcellerna (EC), pericyter inbäddade i endotelbasalmembranet samt det parenkymala basalmembranet och astrocytändfötterna1. Inom NVU är hjärnans mikrovaskulära endotelceller (BMEC) de viktigaste komponenterna som bildar blod-hjärnbarriären (BBB). BMEC bildar komplexa och kontinuerliga täta korsningar och har extremt låg pinocytotisk aktivitet jämfört med mikrovaskulära ECs i perifera organ, vilket gör att BBB kan hämma den fria paracellulära diffusionen av vattenlösliga molekyler i CNS. Uttrycket av specifika tillströmningstransportörer och effluxpumpar av BMEC säkerställer upptag och export av näringsämnen respektive skadliga molekyler från CNS2. Dessutom kontrollerar BBB strikt immuncellinträde i CNS genom att uttrycka låga nivåer av endoteladhesionsmolekyler som är avgörande för immuncellshandel i CNS3. Under fysiologiska förhållanden är uttrycksnivåerna av vidhäftningsmolekyler på ytan av BMEC, såsom intercellulär adhesionsmolekyl-1 (ICAM-1) och vaskulär celladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1), låga, men dessa nivåer ökar i vissa neurologiska störningar2. Morfologisk och funktionell nedbrytning av BBB rapporteras i många neurologiska sjukdomar, såsom stroke4, multipel skleros (MS) 5 och flera neurodegenerativa sjukdomar 6,7,8. Detaljerad undersökning av de cellulära och molekylära egenskaperna hos BMEC under både fysiologiska och patologiska förhållanden är ett tillvägagångssätt för att identifiera nya terapeutiska strategier som riktar sig mot BBB.
Fram till nyligen användes primära eller odödliga humana och gnagare BMEC för att studera BBB. Huruvida slutsatser baserade på djurmodeller av BBB är lätt tillämpliga på humant BBB är dock oklart, eftersom uttrycket av flera viktiga molekyler, inklusive vidhäftningsmolekyler och lösta bärarproteiner, skiljer sig mellan människor och gnagare 9,10. Även om humana BMEC-linjer som hCMEC/D3 uttrycker lämpliga nivåer av vidhäftningsmolekyler11, har dessa odödliggjorda BMEC i allmänhet inte komplexa täta korsningar och robusta barriäregenskaper12. Primära humana BMEC är användbara för att studera barriärfunktioner13, men de är inte lätt tillgängliga för alla forskare. Vidare kan primära BMEC från patienter vara svåra att få eftersom de måste samlas in genom en hjärnbiopsi eller kirurgi som endast utförs under specifika kliniska tillstånd.
De senaste framstegen inom stamcellstekniken har gjort det möjligt att differentiera olika typer av mänskliga celler, som härrör från stamcellskällor som humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC). De hiPSC-härledda modellerna gör det möjligt för oss att etablera patofysiologiska modeller med hjälp av patient-härledda prover. Flera hiPSC-härledda celltyper kan kombineras för att etablera autologa samkulturer eller organoider som bättre efterliknar fysiologiska förhållanden. Flera allmänt använda protokoll 14,15,16,17,18,19 kan användas för att differentiera hiPSC-härledda BMEC-liknande celler som har robusta diffusionsbarriäregenskaper med uttryck av BBB-specifika transportörer och effluxpumpar, och är användbara för att studera paracellulär diffusion av små molekyler, molekylära transportmekanismer och läkemedelsleverans till hjärnan 20,21. Tidigare studier har dock visat att allmänt använda hiPSC-härledda BMEC-liknande celler saknar uttryck av viktiga endoteladhesionsmolekyler, inklusive VCAM-1, selektiner och ICAM-2, som är ansvariga för att förmedla interaktioner mellan immunceller och BBB22. Dessutom har tidigare hiPSC-härledda BMECs rapporterats uppvisa blandade endotel- och epitelegenskaper på transkriptionsnivå23. Därför utvecklade vi den utökade endotelcellodlingsmetoden (EECM), ett nytt protokoll som möjliggör differentiering av hiPSC till BMEC-liknande celler som liknar primära humana BMEC med avseende på morfologi, barriäregenskaper och endoteladhesionsmolekyluttryck. Detta protokoll beskriver de detaljerade metodologiska förfarandena för att differentiera hiPSC till BMEC-liknande celler som uppvisar en mogen immunfenotyp.
Protocol
Bild 1: Översikt över protokollet. Manuskriptet presenterar ett steg-för-steg-protokoll för att differentiera hiPSC till EECM-BMEC-liknande celler. De rätta scheman visar cellpopulationerna vid varje steg. Klicka här för att se en större version av denna figur.
hiPSC-linjen, HPS1006, tillhandahölls av RIKEN BRC genom National Bio-Resource Project i MEXT/AMED, Japan.
1. Induktion av hiPSC-differentiering i endoteliala stamceller (EPC)
- Extracellulära matrisplattor och reagens belagda med extracellulär matris (ECM)
- Bered matrisbelagda plattor med 12 brunnar i basalmembranet genom att alikvotera 2,5 mg matrisgel i 50 ml centrifugrör för förvaring vid -20 °C i upp till 6 månader. Tillsätt 30 ml kall Dulbeccos modifierade Eagles medium/näringsblandning F-12 (DMEM/F12), som har förvarats i kylskåp (4 °C), i röret. Blanda försiktigt genom pipettering tills gelen har tinat och tillsätt sedan 500 μl av lösningen till varje brunn på 12-brunnsplattan. Placera plattan i en inkubator (37 °C, 5%CO2) i minst 1 timme.
OBS: Basalmembranmatrisgelen är temperaturkänslig och ska hanteras enligt tillverkarens instruktioner för alikvotering och plattbeläggning. Koncentrationen av extracellulära matrisproteiner kan variera mellan satser. För att säkerställa noggrannheten bör det anges exakt vilken koncentration som krävs på kvalitetsintygsbladet för det specifika partiet med användning av partiets nummer. Till exempel, om den exakta koncentrationen är 10,0 mg / ml, använd 250 μL gel för totalt 2,5 mg. - Bered stamlösning av rhokinashämmare (ROCK) genom att lösa upp ROCK-hämmaren i sterilt vatten till en koncentration av 10 mM (tabell 1). Alikvotera stamlösningen i volymer på 100–200 μl och förvara vid -20 °C för att undvika frys-tina cykler.
- Gör en 100 mg/ml stamlösning av L-askorbinsyra genom att lösa 5 g L-askorbinsyra i 50 ml sterilt vatten och förvara vid -20 °C (tabell 1). Tillsätt 6,25 ml glutamin och 305 μl L-askorbinsyralösning i 500 ml avancerad DMEM/F12 för att göra ett LaSR-medium24 (tabell 1). Förvaras vid 2-8 °C i upp till 2 veckor.
- Bered CHIR99021-lösning genom att lösa CHIR99021 i outspädd dimetylsulfoxid (DMSO) till en slutlig koncentration av 10 mM (tabell 1). Alikvotera lösningen i volymer på 100–200 μl för att undvika frys-tina cykler och förvara vid -20 °C i upp till 1 år. Förvara alikvoter av stamlösningen vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Bered DMEM / F12-10-medium genom att tillsätta 50 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum till 450 ml DMEM / F12. Förvara mediet vid 2-8 °C i upp till 1 månad (tabell 1).
- Bered flödesbuffert-1 genom att tillsätta 33,3 ml 7,5 % bovint serumalbumin (BSA) till 467 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS) (tabell 1). Förvaras vid 2-8 °C i upp till 6 månader.
- Bered matrisbelagda plattor med 12 brunnar i basalmembranet genom att alikvotera 2,5 mg matrisgel i 50 ml centrifugrör för förvaring vid -20 °C i upp till 6 månader. Tillsätt 30 ml kall Dulbeccos modifierade Eagles medium/näringsblandning F-12 (DMEM/F12), som har förvarats i kylskåp (4 °C), i röret. Blanda försiktigt genom pipettering tills gelen har tinat och tillsätt sedan 500 μl av lösningen till varje brunn på 12-brunnsplattan. Placera plattan i en inkubator (37 °C, 5%CO2) i minst 1 timme.
- Sådd av singulariserade hiPSC och expansion för EPC-differentiering (dag -3 till dag -1)
- Börja differentiering när hiPSC-kolonierna i en 6-brunnsplatta inte visar någon spontan differentiering och har lämplig densitet för passaging, vanligtvis cirka 80% sammanflöde (2,5-3,5 x 106 celler). Noggrant övervaka spontant differentierade celler under mikroskopet för att säkerställa om flera passager krävs för att eliminera icke-differentierade celler. Se anmärkningen nedan, steg 1.4.15, för information om cellodlingsmedium och extracellulär matris.
- Aspirera mediet och tillsätt 1 ml dissociationsreagens till brunnarna och inkubera i 5-7 minuter vid 37 °C. Dissociera och singularisera cellerna genom att pipettera dissociationsreagenslösningen försiktigt över brunnarnas ytor två eller tre gånger.
- Överför de fristående cellerna till ett 15 ml rör innehållande 4 ml hiPSC-underhållsmedium och suspendera cellerna ordentligt. Reservera en alikvot på 10 μl för cellräkning.
- Pelletera cellerna genom centrifugering i 5 minuter vid 200 x g vid 20-25 °C. Räkna cellerna och beräkna den erforderliga volymen för att uppnå en lämplig densitet av hiPSC (75-400 x 103 per brunn) i en matrisbelagd platta med 12 brunnar i basalmembran (steg 1.1.1).
- Aspirera beläggningslösningen från brunnarna och tillsätt 1 ml hiPSC-medium innehållande 10 μM ROCK-hämmare i varje brunn (1:1 000 spädning). Efter centrifugering aspirerar supernatanten och dissocierar pelleten i 1 ml hiPSC-medium.
- Tillsätt erforderlig volym hiPSC, bestämd i steg 1.2.4, till varje brunn på 12-brunnsplattan. Två till fyra 12-brunnsplattor kan vara tillräckliga för att skilja en hiPSC-klon åt. Se steg 1.2.4 för att bestämma antalet plattor som krävs för såddceller.
- Placera plattan i en inkubator (37 °C, 5%CO2). Fördela cellerna jämnt genom att försiktigt skjuta plattan fram och tillbaka och sedan sida till sida i inkubatorn.
- Följande dag (dvs. dag -2), byt ut mediet mot 2 ml hiPSC-underhållsmedium som saknar ROCK-hämmare. Nästa dag (dag -1), byt ut mediet mot 2 ml färskt hiPSC-underhållsmedium.
- Induktion av EPC med glykogensyntaskinas 3 (GSK-3)-hämmaren CHIR99021 (dag 0 till dag 5)
- På dag 0, ersätt hiPSC-underhållsmediet i varje brunn med 2 ml LaSR-medium innehållande 8 μM CHIR99021.
- På dag 1, sug upp mediet och tillsätt 2 ml färskt LaSR-medium innehållande 8 μM CHIR99021.
- På dag 2, 3 och 4, ersätt mediet med 2 ml färskt LaSR-medium som saknar CHIR99021.
- Magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) för att rena CD31+ EPC (dag 5)
- På dag 5 aspirerar mediet och tillsätter sedan 1 ml dissociationsreagens till varje brunn innan det inkuberas i 6–8 minuter vid 37 °C.
- Dissociera och singularisera cellerna med en mikropipett och passera genom en 40 μm cellsil för att filtrera suspensionen i ett 50 ml rör innehållande 10 ml DMEM / F12-10-medium. Filtrera cellsuspensionen som samlats upp från mer än två 12-brunnsplattor i minst två 50 ml rör.
- Stoppa matsmältningsreaktionen genom att tillsätta DMEM / F12-10 medium (upp till 50 ml). Pipettera noggrant och reservera 10 μL för räkning av celler. Pelletera cellerna genom centrifugering i 5 minuter vid 200 x g vid 20-25 °C.
- Efter avlägsnande av supernatanten, tillsätt 10 ml DMEM / F12-10-medium och överför cellsuspensionen till färska 15 ml rör. Pelletera cellerna genom centrifugering i 5 minuter vid 200 x g vid 20-25 °C.
- Aspirera supernatanten och suspendera den igen till flödesbuffert-1 med en densitet av 1,0 x 107 celler per 100 μL buffert.
- Tillsätt FcR-blockerande reagens i förhållandet 1:100 och inkubera i 5 minuter innan du tillsätter fluoresceinisotiocyanatet (FITC)-märkt CD31-antikroppen utspädd 1:200. Inkubera suspensionen i 30 minuter i mörker vid 20-25 °C.
- Tillsätt 10 ml flödesbuffert-1, reservera 10 μL av suspensionen för flödescytometrianalys för att bestämma fraktionen av CD31 + -celler (figur 2).
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 200 x g i 5 min vid 20-25 °C. Ta sedan bort supernatanten och suspendera igen till en densitet av 1,0 x 107 celler per 100 μL flödesbuffert-1-lösning. Tillsätt FITC-urvalscocktailen (5 μL per 100 μL cellsuspension). Blanda noggrant genom pipettering och inkubera i mörker i 15 min vid 20-25 °C.
- Tillsätt 5 μL magnetiska nanopartiklar per 100 μL cellsuspension, pipettera väl och inkubera i mörker i 10 minuter vid 20-25 °C.
- Överför cellsuspensionen till ett 5 ml flödescytometrirör och tillsätt flödesbuffert-1 för att uppnå en total volym på 2,5 ml. Placera flödescytometriröret i magneten i 5 minuter.
- I en kontinuerlig rörelse, invertera magneten och dekantera cellsuspensionen innehållande celler som inte var märkta med FITC-CD31-antikroppen. Håll magneten och röret i inverterat läge i 2-3 s och ta sedan bort den återstående vätskan. Aspirera eventuella droppar på rörkanten innan du återför röret till upprätt läge.
- Plocka upp flödescytometriröret från magneten och tillsätt 2,5 ml flödesbuffert-1 för att tvätta de återstående CD31 + -cellerna. Resuspendera cellerna genom att försiktigt pipettera cellerna upp och ner två eller tre gånger. Placera flödesröret i magneten i 5 minuter.
- Upprepa steg 1.4.11-1.4.12 tre gånger och sedan steg 1.4.11 en gång till för totalt fyra tvättar.
- Ta bort flödesröret från magneten och tillsätt den angivna mängden av ett lämpligt medium (t.ex. humant endotelialt serumfritt medium [hECSR] för förlängd EC-kultur eller frysmedium för frysning) till röret för att resuspendera de renade CD31 + -cellerna. Reservera två 10 μl alikvoter av suspensionen, en för cellräkning och den andra för att utföra flödescytometrianalys för att bedöma renheten hos CD31 + -celler i post-MACS-prover (figur 2). Om flödescytometer inte är tillgänglig omedelbart, förvara alikvoten vid 4 °C tills analys.
- Om nästa steg (genom steg 2) inte kan utföras omedelbart, frys CD31 + EPC vid denna punkt. För expansion och selektiv passaging av EPC, fortsätt till steg 2.
OBS: Vitronectin25-belagda plattor med 12 brunnar och det mer stabila hiPSC-underhållsmediet (mTeSR plus) kan användas i stället för matrisbelagda plattor med basalmembran och hiPSC-underhållsmedium (mTeSR1). För beredning av vitronektinbelagda plattor med 12 brunnar, späd vitronektin med utspädningsbuffert till en slutlig koncentration på 10 μg/ml och överför sedan 500 μl av den utspädda lösningen till varje brunn på plattorna med 12 brunnar. Låt plattorna stå vid 20-25 °C i minst 1 timme. Såningsdensiteten för singulariserade hiPSC är jämförbar med den som används för matrisbelagda plattor med basalmembran. Ändring av odlingsmediet eller matrissammansättningen kan påverka spridningen och spontan differentiering av hiPSC, vilket vanligtvis kräver 1-2 veckor för att anpassa sig till nya odlingsförhållanden. Om det mer stabila hiPSC-underhållsmediet används för hiPSC-underhåll kan detta medium användas för EPC-differentiering istället för hiPSC-underhållsmediet. I detta fall bör det mer stabila hiPSC-underhållsmediet bytas dag -2 för att avlägsna ROCK-hämmare, och utbytet på dag -1 kan hoppas över.
2. Utvidgad endotelcellodlingsmetod (EECM) för att differentiera hjärnans mikrovaskulära endotelcellliknande celler (BMEC-liknande celler) och glattmuskelliknande celler (SMLC)
- Beredning av kollagenbelagda plattor och reagenser
- Förbered kollagenbelagda 6-brunnsplattor genom att lösa upp 5 mg kristalliserat kollagen typ IV i 5 ml sterilt vatten. Inkubera över natten vid 4 °C före alikvotering och lagring vid -20 °C. Späd kollagen IV alikvoter 1:100 i sterilt vatten för att producera 10 μg / ml lösningar och tillsätt 1 ml 10 μg / ml kollagen IV-lösningar till varje brunn av 6-brunnsplattorna. Inkubera plattorna i minst 30 minuter vid 37 °C. Plattorna kan förvaras vid 37 °C i upp till 1 vecka.
- Bered en stamlösning av human fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF2) genom att lösa upp 500 μg FGF i 5 ml Dulbeccos PBS, tillsätt 7,5 % BSA till en slutlig koncentration på 0,1 % och alikvotera stamlösningen till 20–200 μl volymer. Dessa kan förvaras vid -20 °C i upp till 3 månader (tabell 1). Stamlösningar kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 månad. Undvik frys-tina cykler. Bered hECSR-medium genom att tillsätta 2 ml B-27-tillskott och 20 μL FGF2 i 98 ml hECSR-medium (tabell 1). hECSR-mediet kan förvaras vid 2-8 °C i upp till 2 veckor.
- Bered frysmedel för EPC, EECM-BMEC-liknande celler och SMLC genom att tillsätta 15 ml fetalt bovint serum, 5 ml DMSO och 25 μL ROCK-hämmarelösning till 30 ml hECSR-medium (tabell 1). Frysmedlet kan förvaras vid 2-8 °C i upp till 2 veckor.
- Sådd EPC för utökad endotelcellsodling
- Ta bort kollagenlösningen från 6-brunnsplattorna. Överför sedan 1,0-2,0 x 10 5 renade CD31 + EPC i 2 ml hECSR-medium innehållande5 μM ROCK-hämmare (1: 2 000 utspädning). Placera plattan i en inkubator (37 °C, 5%CO2). Fördela cellerna jämnt genom att försiktigt skjuta plattorna fram och tillbaka och sedan från sida till sida.
- Nästa dag, ta bort hECSR-mediet innehållande ROCK-hämmare och tillsätt 2 ml färskt hECSR-medium utan ROCK-hämmare. Byt hECSR-medium varannan dag tills 100% sammanflöde uppnås.
OBS: Om ett regelbundet utfodringsschema inte kan upprätthållas under en helg kan mediet bytas ut på kvällen den sista arbetsdagen i veckan och igen tidigt på morgonen efter helgen.
- Selektiv passage för att rena EECM-BMEC-liknande celler och SMLC
- Ta bort hECSR-mediet från 6-brunnsplattorna som innehåller en blandning av EC-populationer och icke-EC-populationer. Tillsätt 1 ml dissociationsreagens till varje brunn.
- Övervaka cellmorfologin noggrant under ett mikroskop. När ECs (men inte icke-ECs) verkar ljusa och runda (vanligtvis inom 2-5 min), lossa dem genom att knacka på plattans kant. De flesta icke-ECs förblir fästa vid plattan.
- Samla upp de lösryckta EC-ämnena med hjälp av en mikropipett, var noga med att undvika att suspendera icke-EC-extrakten. Överför ECs till ett 15 ml eller 50 ml centrifugrör innehållande 4 ml DMEM/F12-10 per 1 ml dissociationsreagens.
- Tillsätt 2 ml hECSR-medium till brunnarna som innehåller de återstående anslutna icke-EC-medlen för att etablera SMLC. Placera plattan i inkubatorn.
- Pipettera EC-suspensionen i centrifugröret för att blanda noggrant och reservera 10 μl suspension för cellräkning. Centrifugera de återstående cellerna i 5 minuter vid 200 x g vid 20–25 °C. Ta bort supernatanten från pelleten och tillsätt 2 ml hECSR-medium per 1,0-2,0 x 105 EC.
- När kollagen IV-lösningen avlägsnas från en ny 6-brunnsplatta, tillsätt 2 ml EC-suspension till varje brunn, följt av inkubation vid 37 °C med 5%CO2. För att jämnt fördela cellerna i plattan, flytta den försiktigt fram och tillbaka och från sida till sida på inkubatorhyllan.
- Byt ut hECSR-mediet varannan dag tills ECs når 100% sammanflöde.
- Upprepa steg 2.3.1-2.3.7 tills ett rent EG-monolager erhålls. Om följande steg inte kan utföras, frys CD31+ EC-skivorna (se steg 2.4.2). Om du vill analysera EC-funktioner fortsätter du till steg 3.
OBS: I allmänhet behövs två eller tre selektiva passager för att erhålla nästan rena kulturer av ECs som är lämpliga för funktionella analyser, och vi betraktar dessa celler som EECM-BMEC-liknande celler. Efter mer än fem eller sex passager saktar cellproliferationen vanligtvis, även om denna variabel beror på hiPSC-linjen. - För att odla SMLC, byt ut hECSR-mediet varannan dag. För att samla SMLC-konditionerat medium (CM), passera det uppsamlade mediet genom ett 0,22 μm filter vid varje mediebyte. CM kan användas för att uppreglera VCAM-1-uttrycket av EECM-BMEC-liknande celler. Slå samman SMLC-CM tills SMLC når 100% sammanflöde.
- EPC, EECM-BMEC-liknande cell och SMLC kryokonservering och upptining
- För att frysa EPC, efter den slutliga MACS-tvätten (steg 1.4.13), suspendera EPC: erna i frysmedium snarare än hECSR-medium med en densitet av 1,0-2,0 x 106 celler / ml. Fördela 1 ml av cellsuspensionen i kryorör. Placera kryorören i en frysanordning med kontrollerad hastighet och överför dem snabbt till -80 °C. För långvarig lagring, flytta rören till en flytande kvävetank 24 till 48 timmar efter frysning.
- För att frysa EECM-BMEC-liknande celler och SMLC, efter avlägsnande av mediet från brunnar, tillsätt dissociationsreagens (1 ml / brunn) och inkubera plattan vid 37 ° C med 5% CO2 tills cellerna lossnar (5-7 min och 20-30 min för EECM-BMEC-liknande celler respektive SMLC). Samla upp cellerna i ett 15 ml eller 50 ml centrifugrör innehållande 4 ml DMEM/F12-10 per 1 ml dissociationsreagens.
- Pipettera noggrant för att blanda och reservera 10 μl av cellsuspensionen för cellräkning. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 200 x g i 5 min vid 20-25 °C. Ta bort supernatanten och suspendera cellerna noggrant i frysmedium till en densitet av 1,0-2,0 x 106 celler/ml. Fördela 1 ml av cellsuspensionen i färska kryorör.
- Placera kryorören i en frysanordning med kontrollerad hastighet och överför dem omedelbart till -80 °C. För långvarig lagring kan rören överföras till en flytande kvävetank 24 till 48 timmar efter frysning.
- För upptining av EPC, EECM-BMEC-liknande celler och SMLC, rulla injektionsflaskor med kryorör mellan händerna eller inkubera i ett 37 ° C vattenbad tills cellerna är nästan helt tinade. Tillsätt 500 μL DMEM/F12-10 och överför försiktigt cellsuspensionen till ett 15 ml rör innehållande 4 ml DMEM/F12-10-medium. Tvätta kryoröret en gång genom att tillsätta 1 ml DMEM / F12-10 och centrifugera sedan cellerna vid 200 x g i 5 minuter vid 20-25 ° C.
- Aspirera supernatanten och resuspendera pelleten i 2 ml hECSR-medium innehållande 5 μM ROCK-hämmare (1:2 000 spädning) till en densitet av 1,0–2,0 x 10 5 celler per 2 ml för EPC och 2,0–3,0 x 105 celler per 2 ml för EECM-BMEC-liknande celler och SMLC:er. Fördela cellsuspensionen mellan brunnarna på de kollagenbelagda 6-brunnsplattorna efter aspirering av kollagenlösningen.
- Flytta försiktigt plattorna fram och tillbaka, sedan från sida till sida, på hyllan i en inkubator vid 37 °C, 5 %CO2 för att jämnt fördela cellerna i brunnarna.
- Nästa dag, byt ut mediet mot färskt hECSR-medium som saknar ROCK-hämmare. Byt hECSR-medium varannan dag tills 100% sammanflöde uppnås. Fortsätt sedan till selektiv passaging för EPC (se steg 2.3) och funktionella analyser för EECM-BMEC-liknande celler (se steg 3). Innan molekylär karakterisering och funktionella analyser utförs bör EECM-BMEC-liknande celler vara 100% sammanflytande, vilket vanligtvis uppnås 2-3 dagar efter upptining.
3. Validering av EECM-BMEC-liknande celler och SMLC
- Permeabilitetsanalys för spårämnen med små molekyler
- Bedöm EECM-BMEC-liknande cellbarriärintegritet genom att mäta natriumfluoresceinpermeabilitet, som beskrivs av Nishihara et al.26. Frö de EECM-BMEC-liknande cellerna på filterinsatser för att utveckla kompletta monolager och mäta permeabiliteten hos natriumfluorescein.
- Immunofluorescensfärgning för att bedöma nyckelmolekyler.
- För immunofluorescensfärgning för att övervaka uttrycket av korsningsmolekyler, vidhäftningsmolekyler eller cytoskeletala proteiner från EECM-BMEC-liknande celler i monolager eller SMLC, använd kammarglas, 96-brunnsplattor eller membran med insatsfilter. Bedöm EECM-BMEC-liknande celluttryck av adhesionsmolekyler på cellytan med eller utan inflammatorisk cytokinstimulering, som beskrivs av Nishihara et al.26.
- Flödescytometri för att analysera uttrycket av cellyteadhesionsmolekyler på EECM-BMEC-liknande celler
- Använd flödescytometri för att bedöma det semikvantitativa uttrycket av cellyteadhesionsmolekyler som är involverade i immuncellsmigration till CNS, inklusive ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, P-selectin, E-selectin, CD99 och trombocytendotelcellsadhesionsmolekyl-1 (PECAM-1), som beskrivs av Nishihara et al.26. Odla EECM-BMEC-liknande celler med SMLC-konditionerat medium i närvaro och frånvaro av inflammatoriska cytokiner i 16-18 timmar.
- Immuncellsadhesionsanalys under statiska förhållanden för att bedöma uttrycket av funktionella adhesionsmolekyler
- Använd den metod som beskrivs av Nishihara et al.26 för att bestämma om cellytans vidhäftningsmolekyler i de EECM-BMEC-liknande cellerna är funktionella.
- Kortfattat, frö de EECM-BMEC-liknande cellerna på en kammare glida vid 5,5 x 104 / cm2 och växa till sammanflöde. Cirka 24 timmar senare, ändra odlingsmediet till SMLC-konditionerat medium i närvaro eller frånvaro av proinflammatoriska cytokiner och inkubera de EECM-BMEC-liknande cellerna i ytterligare 16 timmar.
- På dagen för experimentet tinas kryokonserverade immunceller (t.ex. T-celler eller mononukleära celler i perifert blod [PBMC]) med T-celltvättbuffert (tabell 1) och etikett med fluorescerande färgämnen (t.ex. cellspårarfärger) i T-cellmedium (tabell 1). Optimering av odlingsmediet för immuncellerna bör skräddarsys för den specifika typen av immunceller som studeras.
- I ett 16-brunnskammarglas lägger du till 2 x 104 Th1-celler till de EECM-BMEC-liknande cellerna. Specifikt, när man arbetar med effektor T-celler såsom Th1-celler, har det observerats att de uppvisar större bindning till EECM-BMEC-liknande celler jämfört med PBMC (Nishihara. et al. [2022]). Följaktligen måste antalet PBMC som ska läggas till de EECM-BMEC-liknande cellerna vara högre jämfört med rena effektor T-celler.
- Inkubera immuncellerna med monolagret av EECM-BMEC-liknande celler i 30 minuter i migrationsanalysmedium (tabell 1). Efter 30 minuter, tvätta glaset försiktigt, två gånger genom att doppa i en burk innehållande Dulbeccos PBS och fixera sedan med 2,5% glutaraldehydlösning vid 4 °C i 2 timmar.
- Efter fixering, tvätta bilden två gånger genom att nedsänka i en burk som innehåller Dulbeccos PBS och montera med ett täckglas. Därefter förvärva fluorescensmikroskopibilder av mitten av monolagret på objektglasen för att räkna immunceller bundna till EECM-BMEC-liknande cellmonolager.
Representative Results
Analys av permeabilitet
Permeabiliteten för natriumfluorescein beräknades genom att mäta fluorescensintensiteten hos mediet som samlats in från den nedre kammaren vid 15, 30, 45 och 60 minuter. Totalt 150 μl medium provtas vid varje tidpunkt och den saknade volymen på 150 μl ersätts med hECSR-medium. Fluorescensintensiteten avläses med hjälp av en fluorescerande plattläsare (485 nm excitation/530 nm emission) och korrekta signaler, spelvolymer och permeabilitet beräknas med hjälp av en tidigare beskriven formel18 (tabell 2). Det rekommenderas att bekräfta om fluorescensintensiteten hos natriumfluorescein ökar med tiden. Flera filter - minst tre exemplar - bör användas för en analys för att säkerställa reproducerbarhet. För friska kontrollhärledda EECM-BMEC-liknande celler bör natriumfluoresceinpermeabiliteten (376 Da) vara under 0,3 x 10-3 cm/min. För att bekräfta bildandet av ett konfluent EECM-BMEC-liknande cellmonolager bör immunofluorescensfärgning för junctionala proteiner i de EECM-BMEC-liknande cellerna i varje filter som används i permeabilitetsanalyserna utföras efter denna analys.
Immunofluorescens färgning
Immunofluorescensfärgning av EECM-BMEC-liknande cellkorsningsmolekyler, inklusive claudin-5, ockludin och VE-cadherin1, användes för att bedöma cellmorfologi och närvaron av kontinuerliga och mogna korsningar (figur 4). Monolagren av EECM-BMEC-liknande celler på membranen i filterinsatserna fixerades med kall metanol (-20 °C) i 20 s, blockerades med blockerande buffert (tabell 1) och inkuberades sedan med primära och sekundära antikroppar. De EECM-BMEC-liknande cellerna uppvisade spindelliknande former och sicksackformade korsningar, vilka båda är karakteristiska morfologiska egenskaper hos BMEC27. Stimulering av EECM-BMEC-liknande celler sådda på kammarglas med proinflammatoriska cytokiner, såsom tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) och interferon-γ (INF-γ) (0,1 ng / ml TNF-α + 2 IE / ml IFN-γ) utspädd i SMLC-härledd konditionerat medium, uppreglerade uttrycket av vidhäftningsmolekyler, såsom ICAM-1 och VCAM-128 (figur 5). Representativa bilder av glatta muskelcellmarkörer, inklusive α-glatt muskelaktin (SMA), kalponin och glatt muskelprotein 22-alfa (SM22a)29, visas i figur 6. SMLC sådda på kammarglaset fixerades med 4% paraformaldehyd i 10 minuter, blockerades med blockerande buffert och inkuberades sedan med primära och sekundära antikroppar.
Flödescytometrianalys av cellytans adhesionsmolekyluttryck av EECM-BMEC-liknande celler
Representativa resultat för cellyteuttryck av endoteladhesionsmolekyler på EECM-BMEC-liknande celler visas i figur 7. Stimulering med proinflammatoriska cytokiner, som TNF-α och INF-γ, uppreglerade cellyteuttrycket av flera vidhäftningsmolekyler, inklusive ICAM-1, VCAM-1 och P-selectin. Odling av EECM-BMEC-liknande celler med SMLC-konditionerat medium förstärkt endotelialt VCAM-1-cellytuttryck. Effekten av induktion av VCAM-1-cellyteuttryck kan variera mellan satser av SMLC-konditionerat medium. Det rekommenderas att flera partier konditionerat medium som skördats från SMLC, som härrör från samma hiPSC-källa, lagras vid differentiering av SMLC, för att kontrollera vilken sats som inducerar lämpligt uttryck av VCAM-1.
Adhesionsanalys av immunceller under statiska förhållanden
Antalet bundna immunceller korrelerade med uttrycksnivån av funktionella vidhäftningsmolekyler på ytan av EECM-BMEC-liknande celler. Stimulering med inflammatoriska cytokiner uppreglerade uttrycket av endoteladhesionsmolekyler och främjade det ökade antalet immunceller som vidhäftade EECM-BMEC-liknande cellmonolager (figur 8). Det aktuella experimentet demonstrerade funktionaliteten hos vidhäftningsmolekyler på EECM-BMEC-liknande celler, vilket gör denna modell lämplig för att studera immuncell-EC-interaktioner.
Figur 2: Rening av CD31+ EC. Punktdiagram med representativa flödescytometridata från spridningsgrindning av ECs och FITC-märkt CD31-färgning av cellpopulationer före (steg 1.4.7) och efter (steg 1.4.14) MACS. MACS förbättrar renheten hos CD31 + EPC i befolkningen. Förkortningar: SSC = sidospridning; FSC = framåtriktad spridning; FITC = fluoresceinisotiocyanat, MACS = magnetisk aktiverad cellsortering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: EECM-BMEC-enskiktspermeabilitet (10–3 cm/min) beräknat utifrån natriumfluoresceins råfluorescensintensitet. Den linjära lutningen för spelvolymen beräknas med linjär regression för varje filter (figur 3A). Permeabiliteten för natriumfluorescein beräknas med hjälp av två formler (figur 3B). (A) Den linjära lutningen av spelvolymen i förhållande till tiden beräknades med hjälp av linjär regression för filter 1 (mc1) och blankfiltret (mf). M c1 och m f är koefficienter för Xc1 respektive Xf. B) Formel för beräkning av fluoresceinpermeabilitet (Pe) med användning av mc och mf (formel 1). Pe-enheter konverterades med hjälp av ytan på ett filter (Formel 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: EECM-BMEC-liknande celler visar mogna cellulära korsningar. Immunofluorescensfärgning för claudin-5, ockludin eller VE-cadherin (rött) i EECM-BMEC-liknande celler odlade på membran av insatsfilter. Kärnor färgades med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå). Färgning utfördes på exakt samma filterinsatser som användes för permeabilitetsanalyserna. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Uttryck av endoteladhesionsmolekyler av EECM-BMEC-liknande celler. Immunofluorescensfärgning utfördes på EECM-BMEC-liknande celler odlade på membran av filterinsatser i närvaro av SMLC-härledd CM. Immunfärgning för ICAM-1 eller VCAM-1 (röd) visas för icke-stimulerade och 1 ng / ml TNF-α + 20 IE / ml IFN-γ stimulerade EECM-BMEC-liknande celler. Kärnor färgades med DAPI (blå). Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Karakterisering av SMLC. Immunocytokemi av α-glatt muskelaktin (SMA), kalponin eller glatt muskelprotein 22-Alpha (SM22a) (rött) för SMLC odlade på kammarglas visas. Kärnor färgades med DAPI (blå). Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Endotelcellytuttryck av adhesionsmolekyler på EECM-BMEC-liknande celler. Resultat av flödescytometrianalys av EC surface adhesion molekyluttryck på EECM-BMEC-liknande celler visas. EECM-BMEC-liknande celler odlades med användning av SMLC-härledda konditionerade medier. Blå, röda och grå linjer i histogramöverlagringarna visar det icke-stimulerade (NS) tillståndet, 1 ng / ml TNF-α + 20 IE / ml IFN-γ-stimulerat tillstånd respektive isotypkontroll. Cellyteuttrycket av endoteladhesionsmolekyler, inklusive intercellulär adhesionsmolekyl 1 (ICAM-1), ICAM-2, vaskulär celladhesionsmolekyl 1 (VCAM-1), P-selectin, E-selectin, CD99 och trombocytendotelcelladhesionsmolekyl-1 (PECAM-1) utvärderades. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Adhesion av immunceller på EECM-BMEC-liknande celler. (A) Bilder av fluorescerande märkta vidhäftande immunceller på icke-stimulerade (NS) och 0,1 ng / ml TNF-α + 2 IE / ml IFN-γ-stimulerade (TNF-α + IFN-γ) EECM-BMEC-liknande cellmonolager. Bilderna motsvarar brunnarnas centrum. Skalstapel = 50 μm. (B) Antalet fluorescerande märkta immunceller på monolager av NS och TNF-α + IFN-γ-stimulerade EECM-BMEC-liknande celler. Adherenta immunceller/synfält (FOV) räknades automatiskt med hjälp av FIJI-programvara. Punkter representerar antalet bifogade T-celler. Staplar visar medelvärdet och felstaplar visar standardavvikelsen (SD) för åtta försök. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Uppgifter om specifika reagenser för testerna. Namnet och den exakta mängden ingredienser för varje specifikt reagens beskrivs. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Exempel på rådata för fluorescensplattläsaren för Pe-beräkning. Siffror i fetstil är den råa fluorescensintensiteten hos natriumfluorescein mätt med en plattläsare. För att noggrant analysera data är det nödvändigt att ta bort bakgrundssignalen från de råa värdena och redogöra för eventuell signalförlust till följd av provtagning av bottenkammaren och därefter korrigera signalen. Till exempel, efter att ha subtraherat bakgrunden, uppvisar 15 minuters provet en signal på 100 relativa fluorescensenheter (RFU) och 30 minuters provet uppvisar en signal på 150 RFU. Den korrigerade signalen vid 30 min är (150 RFU + de saknade värdena vid 15 min [100 RFU x 150 μL/1,500 μL]), vilket är 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU. Frigångsvolymen = (1 500 x [S B,t])/(S T,60 min), där 1 500 är volymen på bottenkammaren (1 500 μL), S B,t är den korrigerade signalen vid tiden t och ST,60 min är signalen från den övre kammaren vid 60 min. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Kritiska punkter och felsökning
Innan EPC-differentiering påbörjas bör forskare se till att inga spontana celldifferentieringshändelser har inträffat i hiPSC-kulturerna. Frånvaron av spontant differentierade celler och användningen av rena hiPSC-kolonier är avgörande för att erhålla reproducerbara resultat. HiPSC-sådddensiteten dag -3 är viktig för att erhålla en hög renhet av CD31 + EPC efter MACS. Såningstätheten för varje hiPSC-linje och varje passage kan kräva optimering. Beroende på hiPSC-linjen och passagenumret kan sådddensiteten variera mellan 75 x 10 3 till 400 x 10 3 hiPSC per brunn på en 12-brunnsplatta (20-100 x 103/cm2). Den minsta densitetskontrollpunkten för hiPSC är celldensiteten dag 2. HIPSC:erna bör nå 100 % sammanflöde senast dag 2. Om hiPSC: erna inte flyter samman dag 2 kommer renheten hos CD31 + EPC efter MACS vanligtvis att vara ganska låg. I detta fall kan hiPSC-sådddensiteten ökas. Om ett stort antal differentierande celler lossnar från plattan runt dag 3 till dag 5 kan den initiala hiPSC-sådddensiteten minskas. 7-8 μM CHIR99021 är enligt vår erfarenhet den optimala koncentrationen för hiPSCs-linjerna som används här, men koncentrationen kan behöva optimeras för andra hiPSC-linjer som kan reagera annorlunda på inhibitorbehandlingen. Renheten hos CD31+ EPC bör bekräftas före och efter MACS. Innan MACS fortsätter bör den försorterade cellblandningen vara >10% CD31 + -celler. CD31 + cellprocent på <6% resulterar vanligtvis i <80% EPC efter MACS. Optimering av den initiala sådddensiteten och/eller CHIR99021-koncentrationen behövs i denna situation.
För framgångsrik selektiv passaging och generering av rena EC-monolager är renheten efter MACS hos CD31 + EPC avgörande. Om renheten efter MACS är <90 % rekommenderas en eller två ytterligare tvättar (steg 1.4.11-1.4.12). Helst bör renheten efter MACS vara >95%. EPC-sådddensiteten på kollagenbelagda plattor bör optimeras enligt hiPSC-linjen för att uppnå 100% sammanflöde inom 3-7 dagar. Att vänta tills EC: erna är 100% sammanflytande leder vanligtvis till framgångsrik selektiv passage. Men även för 100% sammanflytande EC: er lossnar vissa hiPSC-linjers SMLC också tidigt. I detta fall kan selektiv passaging vid lägre sammanflöde (t.ex. ≤80%) vara effektivt. Om vissa SMLC lossnar tidigare än EC, kan ECs ofta inte räddas från den blandade EC-SMLC-populationen. I detta fall kan det vara till hjälp att förkorta aktiveringstiden för dissociationsreagenset vid passerande ECs och repetitiv selektiv passaging. Användningen av ett kommersiellt dissociationsreagens snarare än trypsin som ett dissociationsreagens är fördelaktigt för selektiv passaging, eftersom trypsin inte tillåter separat frigöring av EC och SMLC. Våra permeabilitetsanalyser med hjälp av spårämnen för små molekyler och testning av täta korsnings- och adhesionsmolekyluttrycksnivåer indikerar att EPC, EECM-BMEC-liknande celler och SMLC kan lagras i flytande kväve i minst 2 år.
Metodens betydelse och begränsningar
Metoden skiljer CD31+ EPC från hiPSC genom användning av kemiska GSK-3-hämmare för att aktivera Wnt/β-cateninsignalering. Efter positivt urval av CD31 + EPC av MACS odlas EPC i ett definierat endotelmedium som främjar differentiering i blandade endotel- och SMLC-populationer. Selektiv passaging av dessa blandade populationer med olika vidhäftningsegenskaper möjliggör separation av EC från SMLC. Efter en eller två passager uppvisar EECM-BMEC-liknande celler barriäregenskaper och uttryck av endoteladhesionsmolekyler som rekapitulerar de hos primära humana BMEC. Samodling med SMLC eller deras supernatanter inducerar det cytokininducerade uttrycket av VCAM-1.
In vivo upprätthåller BBB CNS-homeostas genom att etablera låg paracellulär och transcellulär permeabilitet hos molekyler, genom transport av näringsämnen via specifika transportörer och kontroll av immuncellshandel i CNS. För studier av BBB är en lämplig modell som visar respektive molekyler och funktioner av intresse nödvändig. Produktion av EECM-BMEC-liknande celler med definierade reagens och prover från patienter eller friska försökspersoner ger en skalbar human BBB-modell. Fördelarna med en modell som använder EECM-BMEC-liknande celler jämfört med andra BBB-modeller är: 1) en morfologi och endotelial transkriptomprofil30 som liknar den hos primära humana BMEC; 2) förekomsten av mogna snäva korsningar; 3) önskvärda barriäregenskaper; och 4) det robusta uttrycket av endoteladhesionsmolekyler, inklusive ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- och P-selectin, CD99, melanomcelladhesionsmolekyl (MCAM) och aktiverad leukocytcelladhesionsmolekyl (ALCAM)22. Således är denna modell särskilt användbar för att studera interaktioner mellan immunceller och BMEC. Även om permeabiliteten hos spårämnen med små molekyler är högre för EECM-BMEC-liknande celler än den som tidigare rapporterats för iPSC-härledda BMEC-liknande celler14,15, jämför barriäregenskaperna ganska bra med dem som beskrivs för primära humana BMEC. Denna likhet indikerar att EECM-BMEC-liknande celler sannolikt är en bra in vitro-modell av BBB. E-selectin-uttryck på EECM-BMEC-liknande celler under fysiologiska förhållanden måste beaktas när denna modell används för att studera icke-inflammerade BBB som saknar konstitutivt E-selectin-uttryck in vivo31. I vår tidigare studie visade vi att EECM-BMEC-liknande celler kunde fenokopiera BBB, vilket observerats i hjärnan hos MS-patienter med avseende på störda snäva korsningar. Detta resulterar i en högre permeabilitet hos små molekyler och ökat uttryck av funktionell vidhäftningsmolekyl, vilket förmedlar ökad vidhäftning och transmigration av immunceller över de BMEC-liknande cellerna32. Vidare visade vi att aktiveringen av Wnt/β-cateninsignalering kan förbättra störningen av trånga korsningar och ökat VCAM-1-uttryck i MS-härledda EECM-BMEC-liknande celler32. Dessa resultat indikerar att modellen verkligen är användbar för att studera BBB: s roll i neuroimmunologiska sjukdomar, såsom MS.
Sammantaget är EECM-BMEC-liknande celler ett lovande verktyg för fördjupad förståelse av patofysiologiska mekanismer på BBB-nivå och som ett verktyg för att utveckla nya terapeutiska mål för BBB-stabilisering. I framtiden kan modellen tillämpas för att studera BBB-dysfunktion i ett bredare spektrum av sjukdomar och kan öppna vägar för nya terapeutiska metoder.
Disclosures
BE fick ett anslag från Biogen för att studera utökad dosering av natalizumab på T-cellsmigration över blod-hjärnbarriären och ett anslag från CSL Behring för att undersöka den molekylära grunden för dysfunktion i blod-hjärnbarriären vid neurologiska störningar. HN och BE är uppfinnare av de provisoriska amerikanska patentansökningarna avseende EECM-BMEC-liknande celler (63/084980 och 63/185815).
Acknowledgments
HN stöddes av Uehara Memorial Foundation, ett ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS under det gemensamma forskningsprogrammet som genomfördes i samarbete med SNSF (JRPs) Grant No. JPJSJRP20221507 och KAKENHI Grant No. 22K15711, JST FOREST Program (Grant Number JPMJFR2269, Japan), YOKOYAMA Foundation for Clinical Pharmacology Grant No. YRY-2217, ICHIRO KANEHARA FOUNDATION, Narishige Neuroscience Research Foundation, NOVARTIS Foundation (Japan) för främjande av vetenskap och YAMAGUCHI UNIVERSITY FUND. BE stöddes av Swiss MS Society och Swiss National Science Foundation (bidrag 310030_189080 och ZLJZ3_214086) och Strategic Japanese-Swiss Science and Technology Programme (SJSSTP) bidrag IZLJZ3_214086.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm Syringe filter | TPP | 99722 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Falcon | 352196 | |
| 40 μm Falcon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round-bottom tube | SPL | 40005 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| 96-Well plate, round bottom | SPL | 34096 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-500ml | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| B-27 Supplement (503), serum free | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | STEMCELL Technologies | ST-07183 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Chamber slides | Thermo Fischer Scientific | 178599 | |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| Corning tissue culture plates (12-well) | Corning | 3512 | |
| Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
| Cryo tube innercap 2.0 mL | Watson | 1396-201S | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 31053-028 | |
| Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium) | Thermo Fisher | 14190250 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) | Thermo Fischer Scientific | 11320074 | |
| EasySepFITC Positive Selection Kit II | STEMCELL Technologies | 18558 | |
| EasySepMagnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS | Sigma | E8008-100ML | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Thermo Fischer Scientific | 10270106 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Ficoll-Paque PLUS | Sigma-Aldrich | GE17144002 | |
| FIJI software (Version 2.0.0) | Image J, USA | ||
| FlowJo version10 | BD | ||
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| HCL | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
| Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Thermo Fischer Scientific | 11111-044 | |
| Human fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Tocris | 233-FB-500 | |
| iPS human induced pluripotent stem cells | Riken RBC | HPS1006 | |
| Kanamycin Sulfate (100x) | Thermo Fischer Scientific | 15160-047 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-Glutamine 200 mM (1003) | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| MEM NEAA (1003) | Thermo Fischer Scientific | 11140-035 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| mTeSR Plus-cGMP | STEMCELL Technologies | ST-100-0276 | |
| mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 104005 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
| Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| Recombinant Human IL-2 | BD Biosciences | 554603 | |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI medium 1640 | Thermo Fischer Scientific | 21875-034 | |
| Scalpel | FEATHER | 2975-11 | |
| Skim milk | BD Biosciences | 232100 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | 71290 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 11360-039 | |
| Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated | Corning | 3401 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vitronectin XF | STEMCELL Technologies | 078180 | |
| Water, sterile, cell culture | Sigma-Aldrich | W3500 |
References
- Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372 (2019).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).
- Marchetti, L., Engelhardt, B. Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation. Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).
- Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).
- Nishihara, H., Engelhardt, B. Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective. Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).
- Pan, Y., Nicolazzo, J. A. Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety. British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).
- Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
- Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
- Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Scientific Reports. 10 (1), 12358 (2020).
- Lecuyer, M. A., et al. Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32 (2018).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9 (2017).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Praca, C., et al. Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells. Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).
- Al-Ahmad, A. J. Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25 (2019).
- Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
- Lu, T. M., et al. Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118 (2021).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
- Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
- Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).
- Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development. Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).
- Gastfriend, B. D., et al. Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells. eLife. 10, e70992 (2021).
- Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo. Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).
- Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
