Summary
يوفر هذا البروتوكول نهجا لتحسين الصياغة على عوامل الدراسة المختلطة والمستمرة والفئوية التي تقلل من الخيارات الذاتية في بناء التصميم التجريبي. بالنسبة لمرحلة التحليل ، يتم استخدام إجراء تركيب نمذجة فعال وسهل الاستخدام.
Abstract
نقدم نهجا على غرار الجودة حسب التصميم (QbD) لتحسين تركيبات الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) ، بهدف تزويد العلماء بسير عمل يمكن الوصول إليه. يتطلب التقييد المتأصل في هذه الدراسات ، حيث يجب أن تضيف النسب المولية للدهون المؤينة والمساعدة و PEG ما يصل إلى 100٪ ، طرق تصميم وتحليل متخصصة لاستيعاب قيد الخليط هذا. مع التركيز على الدهون وعوامل العملية التي يشيع استخدامها في تحسين تصميم LNP ، نقدم خطوات تتجنب العديد من الصعوبات التي تنشأ تقليديا في تصميم وتحليل تجارب عملية الخليط من خلال استخدام تصميمات ملء الفراغ واستخدام الإطار الإحصائي الذي تم تطويره مؤخرا لنماذج المجموعة ذاتية التحقق (SVEM). بالإضافة إلى إنتاج الصيغ المثلى المرشحة ، يبني سير العمل أيضا ملخصات رسومية للنماذج الإحصائية المجهزة التي تبسط تفسير النتائج. يتم تقييم التركيبات المرشحة المحددة حديثا مع عمليات التأكيد ويمكن إجراؤها اختياريا في سياق دراسة المرحلة الثانية الأكثر شمولا.
Introduction
تشتمل تركيبات الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) لأنظمة توصيل الجينات في الجسم الحي بشكل عام على أربعة دهون مكونة من فئات الدهون المؤينة والمساعدة و PEG1،2،3. سواء كانت هذه الدهون قيد الدراسة بمفردها أو في وقت واحد مع عوامل أخرى غير مخلوطة ، فإن تجارب هذه التركيبات تتطلب تصميمات "خليط" لأنه - بالنظر إلى تركيبة مرشحة - تؤدي زيادة أو تقليل نسبة أي من الليبيدات بالضرورة إلى انخفاض أو زيادة مقابلة في مجموع نسب الدهون الثلاثة الأخرى.
للتوضيح ، من المفترض أننا نقوم بتحسين صياغة LNP التي تستخدم حاليا وصفة محددة سيتم التعامل معها كمعيار. الهدف هو زيادة فاعلية LNP إلى أقصى حد بينما تهدف بشكل ثانوي إلى تقليل متوسط حجم الجسيمات. عوامل الدراسة التي تتنوع في التجربة هي النسب المولية للدهون الأربعة المكونة (المؤين ، الكوليسترول ، DOPE ، PEG) ، نسبة N: P ، معدل التدفق ، ونوع الدهون المؤينة. يسمح للدهون المؤينة والمساعدة (بما في ذلك الكوليسترول) بالاختلاف على نطاق أوسع من النسبة المولية ، 10-60٪ ، من PEG ، والتي ستختلف من 1-5٪ في هذا الرسم التوضيحي. يتم تحديد وصفة الصيغة المعيارية ونطاقات العوامل الأخرى ودقة تقريبها في الملف التكميلي 1. في هذا المثال ، يستطيع العلماء إجراء 23 عملية (دفعات فريدة من الجسيمات) في يوم واحد ويرغبون في استخدام ذلك كحجم للعينة إذا كان يفي بالحد الأدنى من المتطلبات. يتم توفير النتائج المحاكاة لهذه التجربة في الملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3.
نشر Rampado و Peer4 ورقة مراجعة حديثة حول موضوع التجارب المصممة لتحسين أنظمة توصيل الأدوية القائمة على الجسيمات النانوية. نظر كوفمان وآخرون في دراسات تحسين LNP باستخدام تصميمات الفحص العاملي والنهائي6 ؛ ومع ذلك، لا يمكن لهذه الأنواع من التصاميم أن تستوعب قيد الخليط دون اللجوء إلى استخدام "متغيرات الركود" غير الفعالة7 ولا تستخدم عادة عند وجود عوامل الخليط 7,8. وبدلا من ذلك، تستخدم تقليديا "التصاميم المثلى" القادرة على إدراج قيد المخلوط في تجارب عمليةالخلط 9. تستهدف هذه التصميمات وظيفة يحددها المستخدم لعوامل الدراسة وتكون مثالية فقط (في واحدة من عدد من الحواس الممكنة) إذا كانت هذه الوظيفة تلتقط العلاقة الحقيقية بين عوامل الدراسة والاستجابات. ويلاحظ أن هناك تمييزا في النص بين "التصاميم المثلى" و"الصيغ المرشحة المثلى"، حيث يشير الأخير إلى أفضل الصيغ التي يحددها نموذج إحصائي. تأتي التصميمات المثلى مع ثلاثة عيوب رئيسية لتجارب عملية الخليط. أولا ، إذا فشل العالم في توقع تفاعل عوامل الدراسة عند تحديد النموذج المستهدف ، فسيكون النموذج الناتج متحيزا ويمكن أن ينتج تركيبات مرشحة أدنى. ثانيا ، تضع التصميمات المثلى معظم الأشواط على الحدود الخارجية لمساحة العامل. في دراسات LNP ، يمكن أن يؤدي ذلك إلى عدد كبير من عمليات التشغيل المفقودة إذا لم تتشكل الجسيمات بشكل صحيح في أي من طرفي الدهون أو إعدادات العملية. ثالثا ، غالبا ما يفضل العلماء إجراء عمليات تجريبية على الجزء الداخلي من فضاء العامل للحصول على إحساس مستقل عن النموذج لسطح الاستجابة ومراقبة العملية مباشرة في المناطق غير المستكشفة سابقا من فضاء العامل.
يتمثل مبدأ التصميم البديل في استهداف تغطية موحدة تقريبية لمساحة عامل (مقيدة بالمخلوط) بتصميم ملءالفراغ 10. تضحي هذه التصاميم ببعض الكفاءة التجريبية بالنسبة للتصميمات المثلى9 (على افتراض أن مساحة العامل بأكملها تؤدي إلى صيغ صالحة) ولكنها تقدم العديد من الفوائد في المقايضة المفيدة في هذا التطبيق. لا يقدم تصميم ملء الفراغ أي افتراضات مسبقة حول هيكل سطح الاستجابة ؛ وهذا يمنحها المرونة لالتقاط العلاقات غير المتوقعة بين عوامل الدراسة. يعمل هذا أيضا على تبسيط إنشاء التصميم لأنه لا يتطلب اتخاذ قرارات بشأن شروط الانحدار التي يجب إضافتها أو إزالتها عند ضبط حجم التشغيل المطلوب. عندما تؤدي بعض نقاط التصميم (الوصفات) إلى تركيبات فاشلة ، فإن تصميمات ملء الفراغ تجعل من الممكن نمذجة حدود الفشل على عوامل الدراسة مع دعم النماذج الإحصائية لاستجابات الدراسة على مجموعات العوامل الناجحة. أخيرا ، تسمح التغطية الداخلية لمساحة العامل باستكشاف رسومي مستقل عن النموذج لسطح الاستجابة.
لتصور الفضاء الفرعي لعامل الخليط لتجربة عملية الخليط ، يتم استخدام "قطع ثلاثية" مثلثة متخصصة. يحفز الشكل 1 هذا الاستخدام: في مكعب النقاط حيث يسمح لكل مكون بالنطاق من 0 إلى 1 ، يتم تمييز النقاط التي تفي بقيد أن مجموع المكونات يساوي 1 باللون الأحمر. يقلل قيد الخليط على المكونات الثلاثة من مساحة العامل الممكنة إلى مثلث. في تطبيقات LNP التي تحتوي على أربعة مكونات مخلوط ، ننتج ستة مخططات ثلاثية مختلفة لتمثيل مساحة العامل عن طريق رسم اثنين من الليبيدات في وقت واحد مقابل محور "آخر" يمثل مجموع الليبيدات الأخرى.
الشكل 1: مناطق العامل الثلاثي. في مخطط ملء الفراغ داخل المكعب ، تمثل النقاط الرمادية الصغيرة تركيبات لا تتوافق مع قيد الخليط. تقع النقاط الحمراء الأكبر على مثلث مدرج داخل المكعب وتمثل التركيبات التي يتم استيفاء قيد الخليط لها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بالإضافة إلى عوامل خليط الدهون ، غالبا ما يكون هناك عامل عملية مستمر واحد أو أكثر مثل نسبة N: P أو تركيز المخزن المؤقت أو معدل التدفق. قد تكون هناك عوامل فئوية ، مثل نوع الدهون المؤينة أو نوع الدهون المساعدة أو النوع العازل. الهدف هو إيجاد تركيبة (خليط من الدهون وإعدادات عوامل العملية) تزيد من قدر الفاعلية و / أو تحسن الخصائص الفيزيائية والكيميائية مثل تقليل حجم الجسيمات و PDI (مؤشر تعدد التشتت) ، وتعظيم نسبة التغليف ، وتقليل الآثار الجانبية - مثل فقدان وزن الجسم - في الدراسات في الجسم الحي. حتى عند البدء من وصفة مرجعية معقولة ، قد يكون هناك اهتمام بإعادة التحسين نظرا لتغيير في الحمولة الجينية أو عند النظر في التغييرات في عوامل العملية أو أنواع الدهون.
يقدم Cornell7 نصا نهائيا حول الجوانب الإحصائية لتجارب عملية الخليط والخليط ، مع تقديم Myers et al.9 ملخصا ممتازا لموضوعات تصميم وتحليل الخليط الأكثر صلة من أجل التحسين. ومع ذلك ، يمكن لهذه الأعمال أن تثقل كاهل العلماء بالتفاصيل الإحصائية والمصطلحات المتخصصة. يوفر البرنامج الحديث لتصميم التجارب وتحليلها حلا قويا يدعم بشكل كاف معظم مشاكل تحسين LNP دون الحاجة إلى مناشدة النظرية ذات الصلة. في حين أن الدراسات الأكثر تعقيدا أو ذات الأولوية العالية ستظل تستفيد من التعاون مع إحصائي وقد تستخدم تصميمات مثالية بدلا من ملء الفراغ ، فإن هدفنا هو تحسين مستوى راحة العلماء وتشجيع تحسين تركيبات LNP دون اللجوء إلى اختبار عامل واحد في كل مرة (OFAT) غير الفعال11 أو ببساطة الاستقرار على الصيغة الأولى التي تفي بالمواصفات.
في هذه المقالة ، يتم تقديم سير عمل يستخدم برنامجا إحصائيا لتحسين مشكلة صياغة LNP عامة ، ومعالجة مشكلات التصميم والتحليل بالترتيب الذي ستواجهه. في الواقع ، ستعمل الطريقة مع مشاكل التحسين العامة ولا تقتصر على LNPs. على طول الطريق ، يتم تناول العديد من الأسئلة الشائعة التي تنشأ ويتم تقديم توصيات ترتكز على التجربة وفي نتائج المحاكاة12. أدى الإطار الذي تم تطويره مؤخرا لنماذج المجموعة التي تم التحقق من صحتها ذاتيا (SVEM)13 إلى تحسين النهج الهش لتحليل النتائج من تجارب عملية الخليط ، ونحن نستخدم هذا النهج لتوفير استراتيجية مبسطة لتحسين الصياغة. بينما يتم إنشاء سير العمل بطريقة عامة يمكن اتباعها باستخدام حزم برامج أخرى ، فإن JMP 17 Pro فريد من نوعه في تقديم SVEM جنبا إلى جنب مع أدوات الملخص الرسومية التي وجدنا أنها ضرورية لتبسيط التحليل الغامض لتجارب عملية الخليط. نتيجة لذلك ، يتم توفير تعليمات خاصة ب JMP أيضا في البروتوكول.
يستخدم SVEM نفس أساس نموذج الانحدار الخطي مثل النهج التقليدي ، ولكنه يسمح لنا بتجنب التعديلات المملة المطلوبة لتناسب "النموذج الكامل" للتأثيرات المرشحة باستخدام إما الاختيار الأمامي أو الاختيار المعاقب عليه (Lasso) النهج الأساسي. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر SVEM ملاءمة "نموذج مخفض" محسن يقلل من إمكانية دمج الضوضاء (العملية بالإضافة إلى التباين التحليلي) التي تظهر في البيانات. إنه يعمل عن طريق حساب متوسط النماذج المتوقعة الناتجة عن إعادة ترجيح الأهمية النسبية لكل تشغيل بشكل متكرر في النموذج 13،14،15،16،17،18. يوفر SVEM إطارا لنمذجة تجارب عملية الخليط التي يسهل تنفيذها من الانحدار التقليدي أحادي الطلقة وينتج عنه مرشحون أفضل جودة للصياغةالمثلى 12,13. التفاصيل الرياضية ل SVEM خارج نطاق هذه الورقة وحتى الملخص السريع الذي يتجاوز مراجعة الأدبيات ذات الصلة من شأنه أن يصرف الانتباه عن ميزته الرئيسية في هذا التطبيق: فهو يسمح بإجراء بسيط وقوي ودقيق للنقر للتشغيل للممارسين.
يتوافق سير العمل المقدم مع نهج الجودة حسب التصميم (QbD)19 لتطوير الأدوية20. ستكون نتيجة الدراسة فهما للعلاقة الوظيفية التي تربط سمات المواد ومعلمات العملية بسمات الجودة الحرجة (CQAs)21. يناقش Daniel et al.22 استخدام إطار عمل QbD خصيصا لإنتاج منصة RNA: يمكن استخدام سير العمل لدينا كأداة في هذا الإطار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء التجربة الموضحة في قسم النتائج التمثيلية وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر وتم تنفيذ الإجراءات وفقا للإرشادات التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC). تم الحصول على إناث الفئران Balb / C البالغة من العمر 6-8 أسابيع تجاريا. تلقت الحيوانات طعاما قياسيا وماء وتم إيواؤها في ظل ظروف قياسية مع دورات ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة ، عند درجة حرارة 65-75 درجة فهرنهايت (~ 18-23 درجة مئوية) مع رطوبة 40-60٪.
1. تسجيل الغرض من الدراسة واستجاباتها وعواملها
ملاحظة: خلال هذا البروتوكول ، يتم استخدام JMP 17 Pro لتصميم التجربة وتحليلها. يمكن استخدام البرامج المكافئة باتباع خطوات مماثلة. للحصول على أمثلة وإرشادات إضافية لجميع الخطوات التي تم تنفيذها في القسم 1 ، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 1.
- لخص الغرض من التجربة في مستند مختوم بالتاريخ.
- ضع قائمة بالاستجابات الأولية (CQAs) التي سيتم قياسها أثناء التجربة.
- ضع قائمة بأي استجابات ثانوية (على سبيل المثال ، قيود المصب على الخصائص الفيزيائية والكيميائية) التي يمكن قياسها.
- ضع قائمة بمعلمات العملية التي قد تكون ذات صلة بالردود ، بما في ذلك تلك الأكثر صلة بالغرض من الدراسة.
- إذا كانت الدراسة ستستمر على مدار عدة أيام ، فقم بتضمين عامل "حظر" قاطع لليوم.
ملاحظة: يوازن هذا إعدادات العوامل عبر الأيام لمنع التحولات على مستوى اليوم في العملية من الخلط بينها وبين عوامل الدراسة. - حدد العوامل المراد تغييرها وتلك التي يجب أن تظل ثابتة أثناء الدراسة.
ملاحظة: استخدم أدوات تحديد أولويات المخاطر مثل تحليلات تأثيرات وضع الفشل20 لاختيار مجموعة فرعية من العوامل الأكثر صلة (الشكل 2). عادة ، يجب السماح لجميع الدهون بالاختلاف. على الرغم من أنه في بعض الحالات المقيدة بالميزانية ، فمن المعقول قفل PEG بنسبة ثابتة. - حدد نطاقات العوامل المتغيرة والدقة العشرية ذات الصلة لكل منها.
- حدد حجم تصميم الدراسة (عدد الدفعات الفريدة من الجسيمات) باستخدام الحد الأدنى والحد الأقصى للاستدلال. لا يتم احتساب عمليات التشغيل المعيارية للتحكم المضمنة يدويا ضمن حجم التشغيل الموصى به من قبل الاستدلال.
ملاحظة: تفترض الأساليب البحثية التالية أن الاستجابات مستمرة. يفترض الحد الأدنى من الاستدلال أنه سيكون من الممكن إجراء دراسة متابعة ، إذا لزم الأمر ، بالإضافة إلى إجراء عمليات تأكيد للتركيبات المثلى المرشحة. إذا كان من الممكن فقط إجراء عمليات تأكيد ، فمن الأفضل وضع ميزانية لعدد عمليات التشغيل التي تم الحصول عليها من الحد الأقصى للإرشاد. بالنسبة للاستجابات الأولية الثنائية ، اطلب المساعدة من إحصائي لتحديد العدد المناسب من عمليات التشغيل.- الحد الأدنى من الاستدلال: خصص ثلاثة أشواط لكل عامل خليط ، واثنتان لكل عامل عملية مستمر ، وواحد لكل مستوى لكل عامل فئوي.
ملاحظة: بالنسبة للدراسة التي تحتوي على أربعة عوامل دهنية ، واثنين مستمرين ، ومتغير عملية فئوية ثلاثية الاتجاهات ، فإن هذا يؤدي إلى اقتراح (3 × 4) + (2 × 2) + 3 = 19 تشغيل ملء الفراغ. أضف عمليات تشغيل إضافية إذا كان من المحتمل أن يفشل بعضها بسبب مشكلات الصياغة أو القياس. - أقصى قدر من الاستدلال: قم بتشغيل البرنامج لبناء التصميمات المثلى وإدخال المعلمات المطلوبة للترتيب الثاني (بما في ذلك التأثيرات الرئيسية والتفاعلات ثنائية الاتجاه بين جميع التأثيرات والتأثيرات التربيعية لعوامل العملية المستمرة). احسب الحد الأدنى لحجم التشغيل وفقا لخوارزمية البرنامج. أضف 1 إلى النتيجة التي تم الحصول عليها من البرنامج لتحديد الحد الأقصى للإرشاد.
ملاحظة: راجع الملف التكميلي 1 للحصول على إرشادات مفصلة حول تنفيذ هذه الخطوات. تؤدي حالة العينة التي تحتوي على أربعة عوامل دهنية ، ومتغيران مستمران وواحد ثلاثي الاتجاهات للعملية الفئوية ، إلى حجم تشغيل موصى به يبلغ 34 (33 من توصية البرنامج + 1). من المرجح أن يتم استخدام أي عمليات تشغيل تتجاوز ذلك بشكل أفضل لدراسات التأكيد أو المتابعة.
- الحد الأدنى من الاستدلال: خصص ثلاثة أشواط لكل عامل خليط ، واثنتان لكل عامل عملية مستمر ، وواحد لكل مستوى لكل عامل فئوي.
الشكل 2: مخطط السبب والنتيجة. يوضح الرسم البياني العوامل المشتركة في مشكلة تحسين صياغة LNP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. إنشاء طاولة التصميم بتصميم يملأ الفراغ
- افتح JMP وانتقل إلى شريط القائمة إلى DOE > تصميم ملء مساحة > للأغراض الخاصة.
- أدخل إجابات الدراسة (انظر الملف التكميلي 1).
- اختياري: أضف أعمدة للحصول على ردود إضافية، مع الإشارة إلى ما إذا كان سيتم تكبير كل منها أو تصغيره أو استهدافه بالنقر على إضافة استجابة.
ملاحظة: يمكن تعديل هذه الإعدادات لاحقا ولا تؤثر على التصميم. وبالمثل ، يمكن إضافة أعمدة إضافية للاستجابات الإضافية بعد إنشاء جدول التصميم. - أدخل عوامل الدراسة والنطاقات المقابلة. استخدم زر الخليط لإضافة عوامل الخليط، أو الزر مستمر لإضافة عوامل متصلة، أو الزر فئوي لإضافة عوامل فئوية.
ملاحظة: تستخدم دراسة المثال هذه العوامل والنطاقات الموضحة في الشكل 3 ، والتي تشمل النسبة المولية المؤينة (تتراوح بين 0.1 و 0.6) ، والنسبة المولية المساعدة (أيضا بين 0.1 و 0.6) ، ونسبة الكولسترول المولي (بين 0.1 و 0.6) ، والنسبة المولية PEG (من 0.01 إلى 0.05) ، ونوع الدهون المؤينة (والتي يمكن أن تكون H101 ، H102 أو H103). - أدخل عدد عمليات التشغيل المحددة مسبقا للتصميم في حقل عدد مرات التشغيل .
- اختياري: قم بزيادة متوسط حجم الكتلة من الافتراضي 50 إلى 2000 عبر قائمة المثلث الأحمر بجوار رأس تصميم تعبئة الفراغ وفي القائمة الفرعية خيارات متقدمة .
ملاحظة: هذا إعداد لخوارزمية ملء الفراغ التي يمكن أن تؤدي إلى بناء تصميم أفضل قليلا على حساب وقت حسابي إضافي. - قم بإنشاء جدول تصميم ملء الفراغ للعوامل المختارة وحجم التشغيل. انقر على التعبئة السريعة المرنة، ثم انقر على إنشاء جدول.
ملاحظة: يتم عرض أول شوطين من تصميم مثال في الشكل 4. - أضف عمود ملاحظات إلى الجدول لإضافة تعليقات توضيحية إلى أي عمليات تشغيل تم إنشاؤها يدويا. انقر نقرا مزدوجا فوق رأس العمود الفارغ الأول لإضافة عمود، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق رأس العمود الجديد لتحرير الاسم.
- إذا كان ذلك ممكنا ، فقم بدمج عمليات التحكم المعياري يدويا في جدول التصميم. قم بتضمين نسخة متماثلة لأحد معايير التحكم. ضع علامة على اسم المعيار في عمود الملاحظات وقم بترميز صفوف النسخ المتماثل للمعيار القياسي لسهولة التعرف على الرسم البياني.
- أضف صفا جديدا بالنقر المزدوج فوق رأس الصف الفارغ الأول وإدخال إعدادات عامل القياس. قم بتكرار هذا الصف لإنشاء نسخة متماثلة من المعيار. قم بتمييز كلا الصفين وانتقل إلى صفوف > ألوان لتعيين لون لأغراض الرسوم البيانية.
ملاحظة: يوفر النسخ المتماثل تقديرا مستقلا عن النموذج للعملية بالإضافة إلى التباين التحليلي وسيوفر رؤية رسومية إضافية.
- أضف صفا جديدا بالنقر المزدوج فوق رأس الصف الفارغ الأول وإدخال إعدادات عامل القياس. قم بتكرار هذا الصف لإنشاء نسخة متماثلة من المعيار. قم بتمييز كلا الصفين وانتقل إلى صفوف > ألوان لتعيين لون لأغراض الرسوم البيانية.
- إذا تجاوزت أي عمليات تشغيل لعنصر تحكم معياري نطاق عوامل الدراسة ، فقم بالإشارة إلى ذلك في عمود "الملاحظات" للاستبعاد المستقبلي من التحليل.
- تقريب عوامل الخليط إلى الدقة المناسبة. للقيام بذلك،
- قم بتمييز رؤوس الأعمدة لعوامل الخليط ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق أحد رؤوس الأعمدة ، وانتقل إلى عمود صيغة جديد > تحويل > تقريب ... ، وأدخل الفاصل الزمني الصحيح للتقريب ، وانقر فوق موافق.
- تأكد من عدم تحديد صفوف بالنقر فوق المثلث السفلي عند تقاطع رؤوس الصفوف والأعمدة.
- انسخ القيم من الأعمدة المستديرة التي تم إنشاؤها حديثا (Ctrl + C) والصقها (Ctrl + V) في أعمدة الخليط الأصلية. وأخيرا، احذف أعمدة القيمة المقربة المؤقتة.
- بعد تقريب نسب الدهون ، تحقق من أن مجموعها يساوي 100٪ عن طريق تحديد رؤوس الأعمدة لعوامل الخليط ، والنقر بزر الماوس الأيمن فوق أحدها ، والانتقال إلى عمود صيغة جديد > دمج > مجموع. إذا كان مجموع أي صف لا يساوي 1 ، فاضبط أحد عوامل الخليط يدويا ، مع ضمان بقاء إعداد العامل ضمن نطاق العامل. احذف عمود المجموع بعد إجراء التعديلات.
- اتبع نفس الإجراء المستخدم لتقريب عوامل الخليط لتقريب عوامل العملية إلى دقتها.
- قم بتنسيق أعمدة الدهون لعرضها كنسب مئوية بالعدد المطلوب من الكسور العشرية: حدد رؤوس الأعمدة ، وانقر بزر الماوس الأيمن ، واختر توحيد السمات .... في النافذة التالية ، اضبط التنسيق على النسبة المئوية واضبط عدد الكسور العشرية حسب الحاجة.
- إذا تمت إضافة عمليات تشغيل يدوية مثل المعايير، فأعد ترتيب صفوف الجدول عشوائيا: أضف عمودا جديدا بقيم عشوائية (انقر بزر الماوس الأيمن فوق رأس العمود الأخير وحدد عمود صيغة جديد > عشوائي > عادي عشوائي). قم بفرز هذا العمود بترتيب تصاعدي بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق رأس العمود الخاص به ، ثم احذف العمود.
- اختياري: أضف عمود معرف التشغيل . عليك تعبئة هذا التاريخ الحالي واسم التجربة ورقم الصف من الجدول.
ملاحظة: انظر (الشكل 5) للحصول على مثال. - قم بإنشاء مخططات ثلاثية لتصور نقاط التصميم على عوامل الدهون (الشكل 6). أيضا ، افحص توزيع التشغيل على عوامل العملية (الشكل 7): حدد الرسم البياني > المخطط الثلاثي. حدد فقط عوامل الخليط ل X ، التخطيط.
- لفحص التوزيع على عوامل العملية، حدد تحليل > التوزيع وأدخل عوامل العملية لأعمدة Y.
ملاحظة: يجب أن يؤكد عالم الصياغة جدوى جميع عمليات التشغيل. في حالة وجود عمليات تشغيل غير مجدية ، أعد تشغيل التصميم مع مراعاة القيود المكتشفة حديثا.
الشكل 3: دراسة العوامل والنطاقات. تعد لقطات الشاشة للإعدادات داخل البرنامج التجريبي مفيدة لإعادة إنتاج إعداد الدراسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الناتج الأولي لتصميم ملء الفراغ. عند عرض الصفين الأولين من الجدول ، يجب تقريب الإعدادات إلى الدقة المطلوبة مع التأكد أيضا من أن مجموع كميات الدهون هو 1. تمت إضافة المعيار إلى الجدول يدويا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: جدول دراسة منسق. تم تقريب مستويات العوامل وتنسيقها وإضافة عمود معرف التشغيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نقاط التصميم على قطعة أرض ثلاثية. تظهر الصيغ ال 23 كدالة لنسب المؤين والمساعد و "الآخرين" (الكوليسترول + PEG) المقابلة. تمثل النقطة الخضراء في المركز النسبة المولية القياسية 33: 33: 33: 1 من المؤين (H101): الكوليسترول: المساعد (DOPE) :P EG. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: توزيع عوامل العملية غير المخلوطة في التجربة. توضح الرسوم البيانية كيف يتم تباعد عمليات التشغيل التجريبية عبر نوع الدهون المؤينة ونسبة N: P ومعدل التدفق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. تشغيل التجربة
- قم بتشغيل التجربة بالترتيب الذي يوفره جدول التصميم. سجل القراءات في الأعمدة المضمنة في الجدول التجريبي.
- إذا تم إجراء مقايسات متعددة لنفس الاستجابة على دفعة صياغة متطابقة ، احسب متوسطا لهذه النتائج داخل كل دفعة. أضف عمودا لكل قياس فحص إلى الجدول.
- للحصول على متوسط ، حدد جميع الأعمدة ذات الصلة ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق أحد رؤوس الأعمدة المحددة ، واختر عمود صيغة جديد > دمج > متوسط. استخدم عمود المتوسط هذا لتحليل الاستجابة المستقبلية.
ملاحظة: بدون بدء الوصفة من جديد ، تلتقط قياسات الفحص المتكررة فقط تباين الفحص ولا تشكل تكرارات مستقلة.
- للحصول على متوسط ، حدد جميع الأعمدة ذات الصلة ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق أحد رؤوس الأعمدة المحددة ، واختر عمود صيغة جديد > دمج > متوسط. استخدم عمود المتوسط هذا لتحليل الاستجابة المستقبلية.
- قم بتوثيق أي حدوث لهطول الأمطار أو مشاكل التحمل في الجسم الحي (مثل فقدان وزن الجسم الشديد أو الوفاة) باستخدام مؤشرات ثنائية (0/1) في عمود جديد لكل نوع من أنواع المشكلات .
4. تحليل النتائج التجريبية
- ارسم القراءات وافحص توزيعات الردود: افتح Graph > Graph Builder واسحب كل استجابة إلى منطقة Y للمخططات الفردية. كرر هذا لجميع الردود.
- افحص المسافة النسبية بين عمليات تشغيل النسخ المتماثل المرمزة بالألوان، إذا تم تضمين أحدها. وهذا يسمح بفهم التباين الكلي (العملية والتحليلية) في المعيار مقارنة بالتباين الناتج عن التغيرات في إعدادات العامل عبر مساحة العامل بأكملها (الشكل 8).
- حدد ما إذا كان يجب نمذجة الاستجابة الأولية أو ما إذا كان يجب استخدام التحويل بدلا من ذلك. بالنسبة للاستجابات التي تقتصر على كونها إيجابية ولكنها غير محدودة أعلاه (على سبيل المثال ، الفاعلية) ، تناسب كل من التوزيع الطبيعي والتوزيع اللوغاريتمي الطبيعي للنتائج التجريبية. إذا كان التوزيع اللوغاريتمي الطبيعي يتناسب بشكل أفضل مع AICc أقل (معيار معلومات Akaike المصحح) ، فقم بإجراء تحويل سجل لتلك الاستجابة.
- انتقل إلى تحليل توزيع > وحدد استجابة أعمدة Y. في تقرير التوزيع الناتج، انقر فوق المثلث الأحمر بجوار اسم الاستجابة واختر ملاءمة مستمرة > ملائمة عادية وملائمة مستمرة > ملاءمة لوجيتمية من القائمة المنسدلة. في تقرير مقارنة التوزيعات اللاحق ، تحقق من قيم AICc للتأكد من التوزيع الذي يناسب الاستجابة بشكل أفضل.
- لإجراء تحويل سجل، انقر بزر الماوس الأيمن فوق رأس عمود الاستجابة وحدد عمود صيغة جديد > سجل > سجل. عند إنشاء نموذج وحفظ عمود تنبؤ على مقياس اللوغاريتم، قم بتحويل الاستجابة مرة أخرى إلى المقياس الأصلي عن طريق تحديد عمود صيغة جديد > Log > Exp.
- بالنسبة لاستجابات النسبة المحددة بين 0 و 1 ، قارن ملاءمة التوزيع الطبيعي وتوزيع بيتا. إذا كان توزيع بيتا يحتوي على AICc أقل ، فقم بإجراء تحويل logit. في تقرير التوزيع للاستجابة، اختر ملاءمة مستمرة > ملائمة عادية وملائمة مستمرة > ملائمة تجريبية.
- لتحويل logit، انقر بزر الماوس الأيمن فوق رأس عمود الاستجابة في جدول البيانات، وحدد عمود صيغة جديد > التخصص > Logit. بعد بناء النموذج ، احفظ عمود التنبؤ. للعودة إلى المقياس الأصلي، استخدم عمود الصيغة الجديد > التخصص > اللوجستي.
ملاحظة: تحليل SVEM القائم على الانحدار قوي للانحرافات عن الحالة الطبيعية في توزيع الاستجابة. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي هذه التحولات إلى تفسير أسهل للنتائج وتحسين ملاءمة النماذج.
- لتحويل logit، انقر بزر الماوس الأيمن فوق رأس عمود الاستجابة في جدول البيانات، وحدد عمود صيغة جديد > التخصص > Logit. بعد بناء النموذج ، احفظ عمود التنبؤ. للعودة إلى المقياس الأصلي، استخدم عمود الصيغة الجديد > التخصص > اللوجستي.
- رسم بياني للأشواط على مخطط ثلاثي. لون النقاط وفقا للاستجابات (أو الاستجابات المحولة إذا تم تطبيق التحويل): افتح الرسم البياني > المخطط الثلاثي. حدد فقط عوامل الخليط ل X ، التخطيط. انقر بزر الماوس الأيمن فوق أي من الرسوم البيانية الناتجة ، وحدد Row Legend ثم حدد عمود الاستجابة (المحول).
ملاحظة: تلوين النقاط وفقا للاستجابات يعطي منظورا مرئيا مستقلا عن النموذج للسلوك فيما يتعلق بعوامل الخليط. - احذف البرنامج النصي النموذجي الذي تم إنشاؤه بواسطة تصميم تعبئة المساحة.
- بناء نموذج مستقل لكل استجابة كدالة لعوامل الدراسة ، مع تكرار الخطوات التالية لكل استجابة.
ملاحظة: في حالة الاستجابة الثنائية الثانوية (على سبيل المثال ، فشل الصياغة أو موت الفأر) ، قم بنمذجة هذه الاستجابة أيضا. قم بتغيير إعداد التوزيع الهدف من عادي إلى ذو حدين. - بناء نموذج "كامل" يضم جميع التأثيرات المرشحة. يجب أن يتضمن هذا النموذج التأثيرات الرئيسية لكل عامل ، والتفاعلات ثنائية وثلاثية الاتجاهات ، والمصطلحات التربيعية والجزئية التكعيبية في عوامل العملية ، وشروط Scheffé التكعيبية لعوامل الخليط23,24.
ملاحظة: استخدم نفس مجموعة التأثيرات المرشحة لكل استجابة. ستعمل تقنية اختيار نموذج SVEM على تحسين النماذج بشكل مستقل لكل استجابة ، مما قد يؤدي إلى نماذج مخفضة فريدة لكل منها. يوضح الشكل 9 بعض هذه التأثيرات المرشحة. الخطوات الفرعية التالية تفصل هذه العملية.- حدد تحليل > نموذج مناسب.
- تأكد من عدم السماح لعوامل الحظر (مثل اليوم) بالتفاعل مع عوامل الدراسة الأخرى. حدد أي عوامل حظر وانقر فوق إضافة. لا تقم بتضمين هذه العوامل في أي من الخطوات الفرعية اللاحقة.
ملاحظة: من المهم مراعاة عوامل الحظر في النموذج ولكن لا ينبغي السماح لعوامل الحظر بالتفاعل مع عوامل الدراسة الأخرى. الغرض الرئيسي من عوامل الحظر هو المساعدة في التحكم في تباين التجربة وتحسين حساسية التجربة. - تسليط الضوء على جميع عوامل الدراسة. قم بتعديل قيمة حقل الدرجة إلى 3 (يتم تعيينها إلى 2 بشكل افتراضي). انقر فوق مضروب إلى درجة.
ملاحظة: يتضمن هذا الإجراء التأثيرات الرئيسية بالإضافة إلى التفاعلات ثنائية وثلاثية الاتجاهات في النموذج. - حدد فقط عوامل غير المخلوط في نافذة التحديد. انقر فوق وحدات ماكرو > مكعب جزئي.
ملاحظة: يقدم هذا الإجراء تأثيرات تربيعية لعوامل العملية المستمرة وتفاعلها مع العوامل الأخرى غير المخلوطة في النموذج. - اختر فقط عوامل الخليط من قائمة التحديد. انقر فوق وحدات الماكرو > Scheffe Cubic. قم بإلغاء تنشيط خيار عدم الاعتراض الافتراضي (راجع الشكل 9).
ملاحظة: يعد تضمين اعتراض في النموذج خطوة أساسية عند استخدام طرق Lasso وهو مفيد أيضا في سياق التحديد الأمامي. عادة ما يكون الإعداد الافتراضي التقليدي No Intercept في مكانه لأن تركيب اعتراض في وقت واحد مع جميع التأثيرات الرئيسية للخليط ، دون تعديلات مثل نهج SVEM ، غير ممكن مع إجراء انحدار المربعات الصغرى العادي12. - تحديد عمود الاستجابة: قم بتمييز عمود الاستجابة وانقر على Y.
- تغيير إعداد الشخصية إلى الانحدار المعمم. حافظ على ضبط التوزيع على الوضع العادي.
- احفظ إعداد النموذج هذا في جدول البيانات لاستخدامه مع استجابات إضافية بالنقر فوق قائمة المثلث الأحمر بجوار مواصفات الطراز وتحديد حفظ في جدول البيانات.
- قم بتطبيق طريقة التحديد الأمامي SVEM لتناسب النموذج المختزل ، دون تضمين إلزامي للتأثيرات الرئيسية لعامل الخليط ، وقم بتخزين عمود صيغة التنبؤ في جدول البيانات.
- من مربع الحوار ملاءمة النموذج ، انقر فوق تشغيل.
- بالنسبة لطريقة التقدير، حدد تحديد SVEM الأمامي.
- قم بتوسيع قوائم عناصر التحكم المتقدمة > فرض الشروط وقم بإلغاء تحديد المربعات المرتبطة بالتأثيرات الرئيسية للخليط. يجب أن يظل مربع مصطلح الاعتراض محددا فقط. يعرض الشكل 10 الإعداد الافتراضي حيث يتم فرض التأثيرات الرئيسية. لهذه الخطوة، يجب إلغاء تحديد هذه المربعات للسماح للنموذج بتضمين أو استبعاد هذه التأثيرات بناء على إجراء التحديد الأمامي.
- انقر فوق انتقال لتشغيل إجراء تحديد SVEM إلى الأمام.
- ارسم الاستجابات الفعلية من خلال الاستجابات المتوقعة من نموذج SVEM للتحقق من قدرة تنبؤية معقولة. (الشكل 11). انقر فوق المثلث الأحمر بجوار تحديد SVEM الأمامي وحدد مخططات التشخيص > المؤامرة الفعلية حسب المتوقع.
- انقر فوق المثلث الأحمر بجوار تحديد SVEM للأمام وحدد حفظ الأعمدة > حفظ صيغة التنبؤ لإنشاء عمود جديد يحتوي على صيغة التنبؤ في جدول البيانات.
- اختياري: كرر الخطوات المذكورة أعلاه باستخدام SVEM Lasso كطريقة تقدير لتحديد ما إذا كان يتم اقتراح وصفة مثالية مختلفة بعد تنفيذ الخطوات اللاحقة. إذا كان الأمر كذلك ، فقم بتشغيل كلتا الوصفتين كتشغيل تأكيد (تمت مناقشته في القسم 5) لمعرفة أيهما يحقق أفضل أداء في الممارسة12.
- كرر خطوات بناء النموذج لكل استجابة.
- بمجرد حفظ أعمدة التنبؤ لجميع الاستجابات في جدول البيانات، قم برسم تتبعات الاستجابة لجميع أعمدة الاستجابة المتوقعة باستخدام النظام الأساسي لأداة تحديد الإعلانات: حدد الرسم البياني > منشئ ملفات التعريف، وحدد جميع أعمدة التنبؤ التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة ل Y، صيغة التنبؤ، وانقر فوق موافق (الشكل 12).
- تحديد الصياغة (الصيغ) المرشحة المثلى.
- حدد "وظيفة الاستحسان" لكل استجابة ، مع تحديد ما إذا كان ينبغي تعظيم الاستجابة أو تقليلها أو مطابقتها مع الهدف. قم بتعيين أي استجابات أساسية لاستخدام وزن أهمية 1.0 وأي استجابات ثانوية لاستخدام وزن أهمية 0.2. من قائمة المثلث الأحمر لمنشئ ملفات تعريف التنبؤ، حدد التحسين والرغبة > وظائف الرغبة، ثم التحسين والرغبة > تعيين الرغبات. أدخل الإعدادات في النوافذ اللاحقة.
ملاحظة: الأوزان المهمة نسبية وذاتية ، لذلك يجدر التحقق من حساسية الأمثل المجمع للتغيرات في هذه الأوزان ضمن نطاق معقول (على سبيل المثال ، من الترجيح المتساوي إلى الترجيح 1: 5). - أمر منشئ ملفات التعريف للعثور على إعدادات العامل المثلى التي تزيد من وظيفة الرغبة (الشكل 12): من منشئ ملفات التعريف ، حدد التحسين والرغبة > زيادة الرغبة إلى أقصى حد.
ملاحظة: قد تبالغ القيم المتوقعة للاستجابات عند المرشحين الأمثل في تقدير قيمة الاستجابات المنحرفة إلى اليمين مثل الفاعلية ؛ ومع ذلك ، فإن عمليات التأكيد ستوفر ملاحظات أكثر دقة لهذه الصيغ المرشحة. الهدف الرئيسي هو تحديد الصيغة المثلى ( إعدادات الوصفة المثلى). - سجل إعدادات العامل المثلى ولاحظ الأوزان المهمة المستخدمة لكل استجابة: من قائمة منشئ ملفات تعريف التنبؤ ، حدد إعدادات العامل > تذكر الإعدادات.
- حدد "وظيفة الاستحسان" لكل استجابة ، مع تحديد ما إذا كان ينبغي تعظيم الاستجابة أو تقليلها أو مطابقتها مع الهدف. قم بتعيين أي استجابات أساسية لاستخدام وزن أهمية 1.0 وأي استجابات ثانوية لاستخدام وزن أهمية 0.2. من قائمة المثلث الأحمر لمنشئ ملفات تعريف التنبؤ، حدد التحسين والرغبة > وظائف الرغبة، ثم التحسين والرغبة > تعيين الرغبات. أدخل الإعدادات في النوافذ اللاحقة.
- اختياري: بالنسبة للعوامل الفئوية مثل نوع الدهون المؤينة ، ابحث عن التركيبات المثلى المشروطة لكل مستوى عامل.
- قم أولا بتعيين المستوى المطلوب للعامل في ملف التعريف ، ثم اضغط مع الاستمرار على مفتاح Ctrl وانقر بزر الماوس الأيسر داخل الرسم البياني لهذا العامل وحدد قفل إعداد العوامل. حدد التحسين والرغبة > زيادة الرغبة إلى أقصى حد للعثور على الأمثل الشرطي مع قفل هذا العامل في إعداده الحالي.
- قم بإلغاء قفل إعدادات العامل قبل المتابعة ، باستخدام نفس القائمة المستخدمة لقفل إعدادات العامل.
- كرر عملية التحسين بعد ضبط أوزان أهمية الاستجابات (باستخدام التحسين والرغبة > تعيين الرغبات) ، ربما فقط تحسين الاستجابة (الاستجابات) الأولية أو تعيين بعض الاستجابات الثانوية ليكون لها وزن أهمية أكثر أو أقل ، أو تحديد هدف الاستجابات الثانوية إلى لا شيء (الشكل 13).
- سجل المرشح الأمثل الجديد (من قائمة منشئ ملفات تعريف التنبؤ ، حدد إعدادات العامل > تذكر الإعدادات.)
- إنتاج ملخصات رسومية للمناطق المثلى لمساحة العامل: قم بإنشاء جدول بيانات يحتوي على 50000 صف مملوء بإعدادات العوامل التي تم إنشاؤها عشوائيا ضمن مساحة العامل المسموح بها ، جنبا إلى جنب مع القيم المتوقعة المقابلة من النموذج المخفض لكل من الاستجابات ووظيفة الرغبة المشتركة.
- في منشئ ملفات التعريف، حدد جدول إخراج عشوائي. اضبط كم عدد عمليات التشغيل المراد محاكاتها؟ إلى 50000 وانقر فوق موافق .
ملاحظة: يؤدي هذا إلى إنشاء جدول جديد بالقيم المتوقعة للاستجابات في كل صيغة من الصيغ البالغ عددها 50000. يعتمد عمود الرغبة على أوزان الأهمية للاستجابات الموجودة عند تحديد خيار جدول عشوائي للمخرجات . - في الجدول الذي تم إنشاؤه حديثا، أضف عمودا جديدا يحسب النسبة المئوية لعمود الرغبة. استخدم هذا العمود المئوي في المخططات الثلاثية بدلا من عمود الرغبة الخام. انقر بزر الماوس الأيمن فوق رأس العمود الرغبة وحدد عمود صيغة جديد > الاحتمال التراكمي > التوزيعي لإنشاء عمود جديد للاحتمال التراكمي [الرغبة].
- قم بإنشاء الرسومات الموضحة في الخطوات التالية. قم بتغيير نظام ألوان الرسومات بشكل متكرر لعرض التوقعات لكل استجابة ولعمود الاحتمال التراكمي [الرغبة].
- بناء مخططات ثلاثية لعوامل الدهون الأربعة. في الجدول، انتقل إلى رسم بياني > مخطط ثلاثي ، وحدد عوامل الخليط ل X، التخطيط، وانقر موافق. انقر بزر الماوس الأيمن في أحد الرسوم البيانية الناتجة، وحدد وسيلة إيضاح الصف، ثم حدد عمود الاستجابة المتوقعة. قم بتغيير القائمة المنسدلة الألوان إلى Jet.
ملاحظة: يعرض هذا أفضل المناطق وأسوأها أداء فيما يتعلق بعوامل الدهون. يوضح الشكل 14 النسب المئوية لاستصواب المفصل عند النظر في تعظيم الفاعلية (الأهمية = 1) وتقليل الحجم (الأهمية = 0.2) ، مع حساب المتوسط على أي عوامل لا تظهر على محاور المخطط الثلاثي. يوضح الشكل 15 الحجم الخام المتوقع. من المعقول أيضا تقسيم هذه الرسوم البيانية بشكل مشروط على عوامل أخرى ، مثل إنشاء مجموعة مميزة من المخططات الثلاثية لكل نوع من أنواع الدهون المؤينة باستخدام مرشح البيانات المحلية (متوفر من قائمة المثلث الأحمر بجوار Trinary Plot). - وبالمثل ، استخدم Graph > Graph Builder لرسم 50000 نقطة مرمزة بالألوان (تمثل تركيبات فريدة) مقابل عوامل العملية غير المخلوطة ، إما بشكل فردي أو مشترك ، والبحث عن العلاقات بين الاستجابة (الاستجابات) والعامل (العوامل). ابحث عن إعدادات العوامل التي تحقق أعلى قدر من الرغبة. استكشف مجموعات مختلفة من العوامل في الرسومات.
ملاحظة: عند تلوين الرسوم البيانية، استخدم الاحتمال التراكمي [الرغبة] ، ولكن عند رسم الرغبة على المحور الرأسي مقابل عوامل العملية، استخدم عمود الرغبة الخام. يمكن أيضا وضع عمود الرغبة على محور الرسم البياني > تصور Scatterplot 3D جنبا إلى جنب مع عاملين آخرين للعملية لاستكشاف متعدد المتغيرات. يوضح الشكل 16 الرغبة المشتركة لجميع التركيبات التي يمكن تكوينها مع كل نوع من أنواع الليبيدات الثلاثة المؤينة. تستخدم أكثر التركيبات المرغوبة H102 ، مع توفير H101 بعض البدائل التنافسية المحتملة. - احفظ منشئ ملفات التعريف وإعداداته التي تم تذكرها مرة أخرى في جدول البيانات. انقر فوق المثلث الأحمر بجوار منشئ ملفات التعريف وحدد حفظ البرنامج النصي > إلى جدول البيانات ....
- في منشئ ملفات التعريف، حدد جدول إخراج عشوائي. اضبط كم عدد عمليات التشغيل المراد محاكاتها؟ إلى 50000 وانقر فوق موافق .
الشكل 8: قراءات الفعالية المرصودة من التجربة. تظهر النقاط قيم الفاعلية التي لوحظت من 23 شوطا ؛ يتم عرض عمليات التشغيل القياسية المنسوخة باللون الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: حوار البرنامج لبدء التحليل. تم إدخال التأثيرات المرشحة جنبا إلى جنب مع استجابة الفعالية المستهدفة ، ولم يتم تحديد خيار عدم الاعتراض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10. مربع حوار إضافي لتحديد خيارات SVEM. بشكل افتراضي ، يتم إجبار التأثيرات الرئيسية للدهون في النموذج. نظرا لتضمين اعتراض ، نوصي بإلغاء تحديد هذه المربعات حتى لا تفرض التأثيرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: الفعلي حسب المخطط المتوقع. يرسم هذا الشكل الفاعلية المرصودة مقابل القيمة المتوقعة لكل صيغة بواسطة نموذج SVEM. ليس من الضروري أن يكون الارتباط قويا كما هو في هذا المثال ، ولكن التوقع هو رؤية ارتباط معتدل على الأقل والتحقق من القيم المتطرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: ملف تعريف التنبؤ. يظهر الصفان العلويان من الرسوم البيانية شرائح دالة الاستجابة المتوقعة بالصياغة المثلى (كما هو محدد في نهج SVEM). يظهر الصف السفلي من الرسوم البيانية "استصواب" الصيغة المرجحة ، وهي دالة للعمود الأخير من الرسوم البيانية التي توضح أنه يجب تعظيم الفاعلية وتقليل الحجم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 13: ثلاثة مرشحين للصياغة المثلى من SVEM-Forward Selection. يمكن أن يؤدي تغيير ترجيح الأهمية النسبية للاستجابات إلى صيغ مثالية مختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 14: مخططات ثلاثية للنسبة المئوية للاستحسان. يوضح الرسم 50000 تركيبة مشفرة بالألوان حسب النسبة المئوية للرغبة ، حيث يتم تعيين الرغبة بوزن أهمية 1.0 لتعظيم الفاعلية و 0.2 لتقليل الحجم ، تظهر هذه المخططات أن المنطقة المثلى للتركيبات تتكون من نسب مئوية أقل من الدهون المؤينة ونسب أعلى من PEG. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 15: مخطط ثلاثي للحجم المتوقع. يوضح الرسم توقعات الحجم من نموذج SVEM لكل تركيبة من التركيبات البالغ عددها 50000. يتم تقليل الحجم بنسب أعلى من الدهون المساعدة وتكبيره بنسب أقل من المساعد. نظرا لأن العوامل الأخرى تختلف بحرية عبر 50000 تركيبة مرسومة ، فهذا يعني أن هذه العلاقة تنطبق عبر نطاقات العوامل الأخرى (PEG ، معدل التدفق ، إلخ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 16: مخططات الكمان لاستصواب تركيبات تتضمن الأنواع الثلاثة المختلفة من الليبيدات المؤينة. تمثل كل نقطة من النقاط ال 50,000 صيغة فريدة من جميع أنحاء مساحة العامل المسموح بها. قمم هذه التوزيعات هي القيم القصوى للاستصواب التي يتم حسابها تحليليا باستخدام ملف تعريف التنبؤ. H102 لديه أكبر قمة وبالتالي ينتج الصيغة المثلى. يقوم نهج SVEM لبناء النموذج الذي يولد هذا الناتج تلقائيا بتصفية العوامل غير المهمة إحصائيا: الغرض من هذا الرسم البياني هو النظر في الأهمية العملية عبر مستويات العوامل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. تشغيل التأكيد
- قم بإعداد جدول يسرد المرشحين الأمثل الذين تم تحديدهم سابقا (الشكل 17).
ملاحظة: يتم ملء قيم الفاعلية الحقيقية والحجم الحقيقي في الشكل 17 باستخدام وظائف التوليد المحاكاة: في الممارسة العملية ، سيتم الحصول عليها عن طريق صياغة ثم قياس أداء هذه الوصفات.- قم بتضمين عنصر التحكم القياسي مع مجموعة عمليات التشغيل المرشحة التي سيتم صياغتها وقياسها.
- إذا وجد أن أيا من الصيغ من التجربة تسفر عن نتائج مرغوبة ، ربما من خلال التفوق على المعيار ، فحدد الأفضل لإضافته إلى الجدول المرشح وإعادة الاختبار مع الصيغ الجديدة.
ملاحظة: إما إضافة عمليات التشغيل المطلوبة يدويا إلى الجدول المرشح أو استخدام الإعدادات التي تم تذكرها في نافذة منشئ ملفات التعريف إذا كانت عمليات التشغيل هذه من التجربة السابقة. حدد رقم صف التشغيل، وانتقل إلى منشئ ملفات تعريف التنبؤ > > تعيين إعدادات العامل إلى البيانات في الصف، وأدخل رقم الصف. بعد ذلك، اختر منشئ ملفات تعريف التنبؤ > إعدادات العامل > تذكر الإعدادات والتسمية بشكل مناسب (على سبيل المثال، "القياس" أو "أفضل تشغيل من التجربة السابقة"). - انقر بزر الماوس الأيمن فوق جدول الإعدادات التي تم تذكرها في منشئ ملفات التعريف وحدد تحويل إلى جدول البيانات.
ملاحظة: اعتمادا على أولوية الدراسة وميزانيتها ، ضع في اعتبارك تشغيل النسخ المتماثلة لكل عملية تأكيد ، خاصة إذا تم استبدال المعيار. قم بإنشاء وتحليل كل صيغة مرتين ، باستخدام متوسط النتيجة للترتيب. انتبه إلى أي مرشحين لديهم نطاق استجابة واسع عبر النسختين المكررة لأن هذا قد يشير إلى تباين كبير في العملية. - إذا لزم الأمر بسبب قيود الميزانية ، قم بتخفيض الاختيار من المرشحين المحددين لمطابقة الميزانية التجريبية أو لإزالة المرشحين الزائدين عن الحاجة.
- نفذ عمليات التأكيد. بناء الصيغ وجمع القراءات.
- تحقق من الاتساق بين نتائج التجربة الأصلية ونتائج دفعة التأكيد للمعايير أو الوصفات المتكررة الأخرى. إذا كان هناك تحول كبير وغير متوقع ، ففكر في ما قد يكون ساهم في التحول وما إذا كان من الممكن أن تتأثر جميع عمليات التشغيل من دفعة التأكيد.
- قارن أداء التركيبات المثلى المرشحة. استكشف ما إذا كان أي مرشح جديد قد تفوق على المعيار.
- اختياري: أضف نتيجة عمليات التأكيد إلى الجدول التجريبي وأعد تشغيل التحليل في القسم 4.
ملاحظة: توفر الخطوة التالية من سير العمل إرشادات لإنشاء دراسة متابعة مع عمليات التشغيل هذه إذا رغبت في ذلك.
الشكل 17: جدول العشرة المرشحين الأمثل ليتم تشغيلهم كتأكيد. تم ملء الفعالية الحقيقية والحجم الحقيقي من وظائف توليد المحاكاة (بدون أي عملية إضافية أو اختلاف تحليلي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. اختياري: تصميم دراسة متابعة ليتم تشغيلها بالتزامن مع عمليات التأكيد
- تقييم الحاجة إلى دراسة متابعة مع مراعاة المعايير التالية:
- حدد ما إذا كانت الصيغة المثلى تقع على طول أحد حدود العوامل وما إذا كانت التجربة الثانية مطلوبة لتوسيع واحد على الأقل من نطاقات العوامل.
- قم بتقييم ما إذا كانت التجربة الأولية تستخدم حجم تشغيل صغير نسبيا أو نطاقات عوامل كبيرة نسبيا وما إذا كانت هناك حاجة إلى "تكبير" المنطقة المثلى المحددة مع عمليات تشغيل إضافية وتحليل محدث.
- تحقق مما إذا كان يتم إدخال عامل إضافي. يمكن أن يكون هذا مستوى من عامل قاطع مثل الدهون المؤينة الإضافية أو عامل ظل ثابتا في الدراسة الأولية ، على سبيل المثال ، تركيز المخزن المؤقت.
- إذا لم يتم استيفاء أي من الشروط المذكورة أعلاه ، فانتقل إلى الخطوة 7.
- استعد لعمليات تجريبية إضافية يتم تنفيذها بالتزامن مع عمليات التأكيد.
- تحديد حدود العوامل لضمان التداخل الجزئي مع المنطقة من الدراسة الأولية. في حالة عدم وجود تداخل ، يجب تصميم دراسة جديدة.
- تطوير الأشواط التجريبية الجديدة بتصميم يملأ الفراغ. حدد DOE > >تصميم ملء الفراغ للأغراض الخاصة.
ملاحظة: بالنسبة للمستخدمين المتقدمين ، ضع في اعتبارك تصميما مثاليا D عبر DOE > Custom Design. - بعد إنشاء عمليات تشغيل ملء الفراغ ، قم بدمج تشغيلين أو ثلاثة يدويا من التجربة الأصلية التي تقع داخل مساحة العامل الجديد. قم بتوزيع عمليات التشغيل هذه بشكل عشوائي داخل الجدول التجريبي باستخدام الخطوات الموضحة في القسم 2 لإضافة صفوف ثم ترتيب الصفوف عشوائيا.
ملاحظة: سيتم استخدامها لتقدير أي تحول في وسائل الاستجابة بين الكتل. - قم بتسلسل عمليات تشغيل التأكيد ويتم تشغيل ملء المساحة الجديدة في جدول واحد وترتيب التشغيل عشوائيا. استخدم الجداول > Concatenate ثم قم بإنشاء عمود عشوائي جديد وفرزه حسب ترتيب التشغيل عشوائيا، كما هو موضح في القسم 2.
- صياغة وصفات جديدة وجمع النتائج.
- ربط عمليات التشغيل والنتائج التجريبية الجديدة بجدول بيانات التجربة الأصلي، مع تقديم عمود معرف التجربة للإشارة إلى مصدر كل نتيجة. استخدم الجداول > تسلسل وحدد خيار إنشاء عمود المصدر.
- تحقق من أن خصائص العمود لكل عامل تعرض النطاق المجمع على كلتا الدراستين : انقر بزر الماوس الأيمن على رأس العمود لكل عامل وافحص نطاقات خصائص الترميز والمزج ، إن وجدت.
- ابدأ تحليل نتائج التجربة الجديدة.
- أدرج عمود معرف التجربة كمصطلح في النموذج ليكون بمثابة عامل حظر. تأكد من أن هذا المصطلح لا يتفاعل مع عوامل الدراسة. قم بتشغيل البرنامج النصي لمربع الحوار Fit Model المحفوظ في الجدول في القسم 4، وحدد عمود معرف التجربة وانقر فوق إضافة لتضمينه في قائمة التأثيرات المرشحة.
- قم بتشغيل مربع حوار Fit Model هذا على جدول البيانات المتسلسل لتحليل نتائج التجربة الجديدة والدراسة الأولية بشكل مشترك. التزم بالتعليمات السابقة لإنشاء مرشحين محدثين للصياغة المثلى وملخصات رسومية.
- للتحقق من الصحة ، قم بتحليل نتائج التجربة الجديدة بشكل مستقل ، باستثناء نتائج التجربة الأولية. أي تنفيذ الخطوات الموضحة في القسم 4 في الجدول التجريبي الجديد.
- تأكد من أن التركيبات المثلى التي حددتها هذه النماذج تتوافق بشكل وثيق مع تلك المعترف بها في التحليل المشترك.
- راجع الملخصات الرسومية للتأكد من أن كلا من التحليلات المشتركة والفردية للنتائج التجريبية الجديدة تظهر سلوكيات سطح استجابة مماثلة (بمعنى أن هناك علاقة مماثلة بين الاستجابة (الاستجابات) والعوامل).
- قارن التحليلات المجمعة والفردية للنتائج الجديدة مع التجربة الأولية من أجل الاتساق. استخدم هياكل الرسم البياني المتشابهة للمقارنة وافحص الوصفات المثلى المحددة للاختلافات.
7. توثيق الاستنتاجات العلمية النهائية للدراسة
- في حالة تغيير عنصر التحكم القياسي إلى وصفة محددة حديثا بسبب الدراسة ، قم بتسجيل الإعداد الجديد وحدد ملفات التصميم والتحليل التي تسجل أصلها.
- الاحتفاظ بجميع الجداول التجريبية وملخصات التحليل ، ويفضل أن يكون ذلك مع أسماء الملفات ذات الطابع التاريخي ، للرجوع إليها في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم التحقق من صحة هذا النهج عبر كل من أنواع الدهون المصنفة على نطاق واسع: الدهون الكلاسيكية الشبيهة ب MC3 والدهون (على سبيل المثال ، C12-200) ، المشتقة عموما من الكيمياء التوافقية. بالمقارنة مع صياغة LNP المعيارية التي تم تطويرها باستخدام طريقة عامل واحد في كل مرة (OFAT) ، فإن التركيبات المرشحة التي تم إنشاؤها من خلال سير العمل لدينا تظهر بشكل متكرر تحسينات في الفعالية من 4 إلى 5 أضعاف على مقياس لوغاريتمي ، كما هو موضح في قراءات لوسيفيراز كبد الفأر في الشكل 18. يصور الجدول 1 التحسينات المقابلة في تعبير لوسيفيراز كبد الفأر التي لوحظت على أداء التحكم القياسي خلال مرحلتي التحسين (دراسة أولية ودراسة متابعة لاحقة). في المرحلة الأولى ، كان التركيز على تحسين نسب الدهون مع الحفاظ على العوامل الأخرى ثابتة. في دراسة المتابعة ، تم تقديم نوع إضافي من الدهون المساعدة وتم إجراء التحسين مع الأخذ في الاعتبار كل من تكوين نسبة الدهون ونوع الدهون المساعدة. وبالتالي ، تم اختيار نوع الدهون المساعد الذي تم إدخاله حديثا لاستخدامه مع تركيبة الدهون المحسنة المرتبطة به. يشير التحسن الكبير في الفاعلية إلى أن هذه التركيبات المحسنة قد تظهر قدرات هروب إندوزوميةمتفوقة 25.
يمكن استخدام عمليات المحاكاة لإظهار الجودة المتوقعة للمرشح الأمثل الناتج عن هذا الإجراء. في إطار مثال التجربة المستخدمة في البروتوكول ، يمكننا تكرار المحاكاة عدة مرات لأحجام تشغيل مختلفة وتقييم النتائج وفقا لوظيفة توليد العملية المحاكاة. ويرد نص JMP لهذا الغرض في الملف التكميلي 4. على وجه التحديد ، تم إنشاء تصميم لملء الفراغ وتم ملء أعمدة الاستجابة بقيم من وظائف المولد لدينا ، بالإضافة إلى الضوضاء التي تمثل الاختلاف التحليلي والعملية. نحن نلائم هذه الاستجابات المحاكاة مع تقنيات تحليل مختلفة (بما في ذلك SVEM Forward Selection) لإنتاج وصفة مثالية للمرشح المقابل. ثم تتم مقارنة المرشحين من كل طريقة تحليل بقيمة الأمثل الحقيقي من وظائف التوليد. يوضح الشكل 19 متوسط النسبة المئوية للاستجابة النظرية القصوى التي حققتها كل طريقة من طرق التحليل الثلاث باستخدام تصميمات ملء الفراغ للحجم المعطى على المحور الأفقي. النموذج الكامل ، الذي يتضمن جميع التأثيرات المرشحة ولا يقلل من النموذج بناء على الأهمية الإحصائية لتلك التأثيرات ، يؤدي الأسوأ. يتضمن الكثير من العمل الإضافي الذي يذهب تقليديا إلى نماذج الانحدار الملائمة لتجارب عملية الخليط تعديلات (إزالة التقاطع ، وإجبار التأثيرات الرئيسية للخليط ، واستبعاد استخدام تأثيرات الخليط التربيعي النقي ، وما إلى ذلك) المطلوبة لتناسب هذا النموذج الكامل9 ، ومن هذا المنظور ، فإن هذه الإجراءات غير ضرورية12. علاوة على ذلك ، لا يمكن احتواء هذا النموذج حتى يصل حجم التصميم إلى عدد التأثيرات في النموذج. في الأحجام التجريبية الأصغر ، يمكننا ملاءمة طريقة الاختيار الأمامي التقليدية ، والتي تتفوق على النموذج الكامل فيما يتعلق بمتوسط أداء الصيغة المرشحة المثلى لكل حجم تجريبي ثابت. وبالمثل ، فإن تعديل SVEM لنهج الاختيار المسبق هذا يزيد من تحسين أداء المرشحين الأمثل. يكشف هذا المخطط أن استخدام SVEM-Forward Selection12,13 لتحليل تجربة ملء الفراغ المكونة من 24 تشغيلا يحقق نفس متوسط الجودة الذي يتطلب عادة 50 تشغيلا عند تحليله باستخدام نموذج التحديد الأمامي التقليدي (استهداف الحد الأدنى من AICc). على الرغم من أن الأداء الفعلي سيختلف من عملية إلى أخرى ، إلا أن هذه المحاكاة - جنبا إلى جنب مع النتائج المنشورة على SVEM12،13،16،17،26 - توضح إمكانات إجراء النمذجة هذا لتحسين الصياغة.
الشكل 18: تحسن في تعبير لوسيفيراز الكبد بعد جولتين من التجارب. تظهر الجولة 0 قراءة لوسيفيراز الكبد للصياغة المعيارية. تظهر الجولة 1 قراءة لوسيفيراز الكبد بعد التجربة الأولى التي تعمل على تحسين النسب المولية للدهون المكونة ل LNP. تظهر الجولة 2 قراءة لوسيفيراز الكبد بعد التجربة الثانية مما يزيد من تحسين النسب المولية المكونة مع مراعاة نوع إضافي من الدهون المساعدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 19: جودة الصيغة المثلى كدالة للحجم التجريبي والنموذج الإحصائي. يمثل المحور الرأسي النسبة المئوية للرغبة القصوى النظرية ، ويمثل المحور الأفقي حجم تصميم ملء المساحة. تظهر كل نقطة متوسط أكثر من 150 محاكاة. يمثل الخط الأزرق (المثلثات) النموذج الكامل (بدون أي إزالة للتأثيرات غير المهمة إحصائيا) ، ويمثل الخط الكهرماني (الدوائر) نموذج الاختيار الأمامي التقليدي القائم على AICc (مع اعتراض وبدون تأثيرات رئيسية للخليط قسري) ، ويمثل الخط الأخضر (مثلثات رأسا على عقب) نموذج الاختيار الأمامي القائم على SVEM (مع اعتراض وبدون تأثيرات رئيسية للخليط الإجباري). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مستدير | معرف الجسيمات | تعبير لوسيفيراز في الكبد (فوتون / ثانية) |
| 0 | معيار التحكم | 8.E+06 |
| 1 | الأمثل على نسب الدهون | 2.E+09 |
| 2 | الأمثل على نسب الدهون ونوع الدهون المساعد | 8.E+10 |
الجدول 1: التحسين المنهجي في تعبير لوسيفيراز من خلال تحسين تصميم التجربة (DOE). يوضح هذا الجدول التحسن الكبير في التعبير عن لوسيفيراز ، مع تحسن يصل إلى 10000 ضعف على مقياس الفوتون / الثانية ، من المعيار الأولي إلى "المرشح الأمثل" النهائي.
الملف التكميلي 1: 04APR2023 ملخص.docx - توفر هذه الوثيقة سجلا للدراسة بما في ذلك الغرض منها ، والردود التي تم تقييمها ، والعوامل التي تم أخذها في الاعتبار ، والعدد الإجمالي لعمليات التشغيل المنفذة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - ملف JMP مع التجربة المحاكاة ونتائجها. يتضمن هذا الملف أيضا نصوص تحليل مرفقة متوافقة مع JMP 17 Pro. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - ملف Excel يتضمن التجربة المحاكاة ونتائجها ، وهو مناسب للقراء الذين قد لا يستطيعون الوصول إلى JMP. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 4: محاكاة الخليط 20DEC22.jsl - هذا برنامج نصي JMP 17 Pro يستخدم لمحاكاة تجارب صياغة LNP وتقييم أداء طرق التحليل المختلفة. يستخدم البرنامج النصي نهج SVEM-Forward Selection (بدون اعتراض) ، وهو أسلوب التحليل الرئيسي المستخدم في سير العمل هذا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتيح البرامج الحديثة لتصميم وتحليل تجارب عملية الخليط للعلماء تحسين تركيبات الجسيمات النانوية الدهنية في سير عمل منظم يتجنب تجارب OFAT غير الفعالة. يلغي نهج نمذجة SVEM الذي تم تطويره مؤخرا العديد من تعديلات الانحدار الغامضة واستراتيجيات تقليل النموذج التي ربما تكون قد صرفت انتباه العلماء في السابق باعتبارات إحصائية غريبة. بمجرد جمع النتائج ، يقدم إطار تحليل SVEM نهجا أسهل في التنفيذ ويميل إلى إنتاج نماذج أفضل من مناهج النمذجة التقليدية13. علاوة على ذلك ، فإن التحليلات الرسومية التي تستند إلى صيغ التنبؤ لكل استجابة يمكن تفسيرها بسهولة من قبل العلماء ، مما يعطي ملخصا واضحا للسلوك الهامشي للاستجابة على العوامل الفردية بالإضافة إلى مجموعات صغيرة من العوامل دون الحاجة إلى تفسير تقديرات المعلمات شديدة الارتباط من نموذج الانحدار. وهذا يسمح للعلماء بالتركيز على تقييم الأهمية العملية عبر عوامل الدراسة بعد أن يزيل SVEM تلقائيا التأثيرات غير المهمة إحصائيا.
تم استخدام سير العمل في الممارسة العملية لتغيير تكوين الدهون ومعلمات الصياغة بشكل منهجي مثل نسبة N / P ومعدل التدفق ونسبة الخلط للتحسين واختيار أفضل أنواع الدهون المساعدة وأنواع الدهون المؤينة وأنواع المخزن المؤقت. تتضمن الأهداف عبر هذه الأمثلة عادة تعظيم الفعالية في الجسم الحي أو في المختبر وتغليف حمولات مختلفة مثل mRNA أو DNA للأهداف ذات الصلة في الجسم الحي مثل خلايا الكبد ، أو في بعض الأحيان عبر أنواع متعددة من الخلايا في حالة التطبيقات في المختبر. بالنسبة لتطبيقات محددة ، قد نحتاج إلى موازنة الخصائص الفيزيائية الحيوية مثل الحجم ، و PDI ، وإمكانات زيتا ، ونسبة التغليف أثناء فحص الفعالية في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الهدف هو العثور على تركيبة قوية ، ولكن جيدة التحمل ، وبالتالي قد نقوم بتضمين استجابات مثل التغير في وزن الجسم ، أو استجابة السيتوكين ، أو استنباط إنزيمات الكبد مثل AST / ALT في التحليل. ظهرت أنماط من العديد من تجارب LNP. والجدير بالذكر أن التغيرات في النسبة المولية للدهون المؤينة ونسبة N / P يبدو أنها تؤثر بشكل كبير على تغليف الحمض النووي الريبي. علاوة على ذلك ، يبدو أن التغييرات في النسبة المولية PEG تؤثر على استقرار الجسيمات ، كما يتضح من التأثيرات على الحجم و PDI. بشكل عام ، يميل وجود فائض من PEG في قلب LNP إلى أن يكون له تأثير ضار على الفاعلية في الفئران.
تكون تحسينات الأداء ملحوظة بشكل خاص عند استهداف أكثر من استجابة واحدة: حتى لو كان أداء المعيار جيدا بالفعل فيما يتعلق بالاستجابة الأولية (على سبيل المثال ، الفاعلية) ، فإن تحسين المفاصل عادة ما يحافظ على السلوك أو يحسنه فيما يتعلق بالاستجابة الأولية مع تحسين السلوك في نفس الوقت فيما يتعلق بالاستجابات الأخرى (تقليل PDI أو الحجم أو فقدان وزن الجسم). نحن نتحقق من صحة هذه التحسينات من خلال عمليات التأكيد ، حيث نقوم بإعداد ومقارنة الصيغة المعيارية مباشرة (ربما مع تكرار) والتركيبات المرشحة الجديدة.
تحتوي مرحلة تصميم سير العمل هذا على عدة خطوات حاسمة. أولا ، تأكد من إدخال العوامل ونطاقاتها بشكل صحيح في منصة تصميم ملء الفراغ. ثانيا ، استخدم الرسومات والمعرفة بالموضوع لتأكيد جدوى كل صياغة ناتجة قبل بدء التجربة. أخيرا ، قم بتنفيذ التجربة باتباع الترتيب العشوائي المحدد في جدول التصميم. يساعد الالتزام بهذا التسلسل على منع المتغيرات المشتركة غير المقاسة - مثل ترتيب إنتاج التركيبة أو درجة الحرارة المحيطة - من إرباك العوامل قيد الدراسة. تصميمات ملء الفراغ أسهل في البناء - مع احتمال أقل لخطأ المستخدم من تصميمات عملية الخليط المثلى ، والتي تتطلب قرارات إضافية أثناء الإعداد قد تحبط المستخدمين عديمي الخبرة وتثنيهم عن استخدام التجارب المصممة. ومع ذلك ، بعد العمل من خلال هذا البروتوكول ، قد يستفيد العلماء من قراءة إضافية حول كيف يمكن للتصميمات المثلى أن تحل محل تصميمات ملء الفراغ في البروتوكول ، كما هو موضح في الفصل 6 من Goos and Jones (2011) 27. خاصة بالنسبة لدراسات المتابعة التي "تكبير" منطقة مثالية - حيث يكون هناك قلق أقل بشأن الفشل على طول حدود الخليط - يمكن أن تكون التصميمات المثلى D أكثر كفاءة من تصميمات ملء الفراغ.
وبالمثل ، فإن مرحلة تحليل سير العمل هذا لها عدة خطوات حاسمة. أولا، تأكد من أن النموذج يحدد مجموعة مناسبة من التأثيرات المرشحة، بما في ذلك التفاعلات، بدلا من التأثيرات الرئيسية (من الدرجة الأولى) للعوامل فقط. ثانيا ، استخدم SVEM Forward Selection كإطار عمل للنمذجة. ثالثا ، قم بتعطيل خيار No Intercept الافتراضي وتجنب فرض تأثيرات الخليط الرئيسية. أخيرا ، قم بتعيين وظائف الرغبة للاستجابات بشكل صحيح قبل بدء التحسين. بالنسبة للمستخدمين الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى SVEM ، فإن أفضل طريقة هي استخدام التحديد الأمامي التقليدي (استهداف الحد الأدنى من AICc) لمشكلة الانحدار12. يذكر البروتوكول أنه من الممكن أيضا استخدام SVEM Lasso: في المتوسط ، يعطي هذا النهج نتائج مماثلة ل SVEM Forward Sselection ، على الرغم من أنه بالنسبة لمجموعات بيانات معينة ، قد ينتج النهجان صيغا مثالية مختلفة قليلا يمكن مقارنتها بعمليات التأكيد12. ومع ذلك ، سيعطي SVEM Lasso نتائج نمذجة رديئة إذا ارتكب المستخدم خطأ سهلا يتمثل في نسيان تعطيل خيار No Intercept الافتراضي12: لهذا السبب ، استخدمنا SVEM Forward Selection كطريقة افتراضية ، لأنها أكثر قوة لهذا الخيار.
القيد الأساسي لهذه الطريقة هو أنه ستكون هناك دراسات عرضية ذات تعقيد أكبر ستستفيد من مساعدة إحصائي للتصميم والتحليل. الحالات التي تكون فيها ميزانية التشغيل محدودة أكثر من المعتاد (أقل من الحد الأدنى من الاستدلال) ، تكون الاستجابات ثنائية ، وهناك عدد كبير من العوامل الفئوية أو مستويات عامل فئوي واحد ، حيث يكون هدف البحث هو النظر في إزالة واحد أو أكثر من عوامل الخليط من الوصفة ، أو عندما تكون هناك قيود إضافية على مساحة العامل يمكن تناولها بشكل مختلف من قبل إحصائي ، مثل استخدام تصميمات12,28 المثلى أو الهجينة أو عن طريق إضافة هيكل إضافي إلى التصميم. على وجه التحديد ، يمكن تشكيل تصميم هجين عن طريق إنشاء تصميم يملأ الفراغ مع معظم عمليات التشغيل المدرجة في الميزانية ثم "زيادة" التصميم مع عمليات التشغيل المتبقية (عادة 2-4) باستخدام معيار D الأمثل. نهج هجين آخر هو إنشاء تصميم ملء الفراغ على الخليط (الدهون) والعوامل المستمرة (العملية) ، ثم بعد ذلك لإضافة أي عوامل فئوية باستخدام التخصيص "الأمثل" لمستويات العوامل. ومع ذلك ، فقد تم تطوير نهج تصميم ملء الفراغ المبسط المتبع في البروتوكول على مدى السنوات القليلة الماضية في عملية إجراء العشرات من تجارب تحسين صياغة LNP ، ونعتقد أنه يوفر نهجا قويا سيعمل بنجاح في معظم الحالات مع منح العلماء الثقة في قدرتهم على الاستفادة من التجارب المصممة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد استخدمت استراتيجية التصميم التجريبي التي يقوم عليها سير العمل هذا في طلبي براءة يكون أحد المؤلفين مخترعا فيهما. بالإضافة إلى ذلك ، Adsurgo، LLC هي شريك JMP معتمد. ومع ذلك، تم تطوير هذه الورقة ونشرها دون أي شكل من أشكال الحوافز المالية أو التشجيع أو أي حوافز أخرى من أحزاب اللقاء المشترك.
Acknowledgments
نحن ممتنون للمحرر والحكام المجهولين على الاقتراحات التي حسنت المقالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JMP Pro 17.1 | JMP Statistical Discovery LLC |
References
- Dolgin, E. Better lipids to power next generation of mRNA vaccines. Science. 376 (6594), 680-681 (2022).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Huang, X., et al.
- Rampado, R., Peer, D. Design of experiments in the optimization of nanoparticle-based drug delivery systems. Journal of Controlled Release. 358, 398-419 (2023).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15, 7300-7306 (2015).
- Jones, B., Nachtsheim, C. J. A class of three-level designs for definitive screening in the presence of second-order effects. Journal of Quality Technology. 43, 1-15 (2011).
- Cornell, J. Experiments with Mixtures: Designs, Models, and the Analysis of Mixture Data. Wiley Series in Probability and Statistics. , Wiley. (2002).
- Jones, B. Proper and improper use of definitive screening designs (DSDs). JMP user Community. , https://community.jmp.com/t5/JMP-Blog/Proper-and-improper-use-of-Definitive-Screening-Designs-DSDs/bc-p/546773 (2016).
- Myers, R., Montgomery, D., Anderson-Cook, C. Response Surface Methodology. , Wiley. (2016).
- Lekivetz, R., Jones, B. Fast flexible space-filling designs for nonrectangular regions. Quality and Reliability Engineering International. 31, 829-837 (2015).
- Czitrom, V.
- Karl, A., Wisnowski, J., Rushing, H. JMP Pro 17 remedies for practical struggles with mixture experiments. JMP Discovery Conference. , (2022).
- Lemkus, T., Gotwalt, C., Ramsey, P., Weese, M. L. Self-validated ensemble models for design of experiments. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 219, 104439 (2021).
- Gotwalt, C., Ramsey, P. Model validation strategies for designed experiments using bootstrapping techniques with applications to biopharmaceuticals. JMP Discovery Conference. , (2018).
- Xu, L., Gotwalt, C., Hong, Y., King, C. B., Meeker, W. Q.
- Ramsey, P., Levin, W., Lemkus, T., Gotwalt, C. SVEM: A paradigm shift in design and analysis of experiments. JMP Discovery Conference Europe. , (2021).
- Ramsey, P., Gaudard, M., Levin, W. Accelerating innovation with space filling mixture designs, neural networks and SVEM. JMP Discovery Conference. , (2021).
- Lemkus, T.
- Juran, J. M. Juran on Quality by Design: The New Steps for Planning Quality into Goods and Services. , Free Press. (1992).
- Yu, L. X., et al. Understanding pharmaceutical quality by design. The AAPS Journal. 16, 771 (2014).
- Simpson, J. R., Listak, C. M., Hutto, G. T. Guidelines for planning and evidence for assessing a well-designed experiment. Quality Engineering. 25, 333-355 (2013).
- Daniel, S., Kis, Z., Kontoravdi, C., Shah, N. Quality by design for enabling RNA platform production processes. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1213-1228 (2022).
- Scheffé, H.
- Brown, L., Donev, A. N., Bissett, A. C. General blending models for data from mixture experiments. Technometrics. 57, 449-456 (2015).
- Herrera, M., Kim, J., Eygeris, Y., Jozic, A., Sahay, G. Illuminating endosomal escape of polymorphic lipid nanoparticles that boost mRNA delivery. Biomaterials Science. 9 (12), 4289-4300 (2021).
- Lemkus, T., Ramsey, P., Gotwalt, C., Weese, M. Self-validated ensemble models for design of experiments. ArXiv. , 2103.09303 (2021).
- Goos, P., Jones, B. Optimal Design of Experiments: A Case Study Approach. , John Wiley & Sons, Ltd. (2011).
- Rushing, H. DOE Gumbo: How hybrid and augmenting designs can lead to more effective design choices. JMP Discovery Conference. , (2020).
