Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler et d’identifier les cellules de niche limbique humaines.
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Article de méthode
Isolement et identification des cellules de niche limbique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous rapportons ici une procédure standard pour l’isolement et l’identification des cellules de niche limbique (LNC). Le tissu limbique obtenu à partir d’une banque d’yeux a été utilisé pour l’isolement des LNC. Le tissu a été divisé en 12 morceaux dans des conditions aseptiques et digéré pendant 18 h à 37 °C dans l’incubateur de culture cellulaire à l’aide de la collagénase A pour obtenir des amas cellulaires avec des LNC et des cellules progénitrices de l’épithélium limbique. Les amas de cellules ont ensuite été digérés pendant 15 minutes à 37 °C en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA pour obtenir des cellules individuelles, puis cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) sur une surface plastique recouverte de 5 % de Matrigel. Les cellules ont été transmises à 70 % de confluence, et les LNC ont été identifiés à l’aide de l’immunofluorescence, de la PCR quantitative en temps réel (qPCR) et de la cytométrie en flux. Les LNC primaires ont été isolés et sont passés plus de 12 fois. L’activité de prolifération des LNC de P4 à P6 a été la plus élevée. Les LNC ont exprimé des marqueurs de cellules souches plus élevés que les BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR et PDGFRβ). De plus, les résultats ont montré que les LNC P4 exprimaient uniformément VIM, CD90, CD105 et PDGFRβ, mais pas Pan-CK, qui pourrait être utilisé comme marqueur pour l’identification des LNC. L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’environ 95 %, 97 %, 92 % et 11 % des LNC exprimaient respectivement CD73, CD90, CD105 et SCF, alors qu’ils étaient respectivement de 68 %, 99 %, 20 % et 3 % dans les BMMSC. Le procédé normalisé d’isolement et d’identification des LNC pourrait fournir une base de laboratoire fiable pour l’utilisation généralisée des LNC.
Introduction
L’incidence du déficit en cellules souches épithéliales cornéennes (CESD), également appelé déficit en cellules souches limbiques (LSCD)1, et de la régénération épithéliale cornéenne (CES) devient de plus en plus urgente en raison des infections et des lésions cornéennes. Si elle n’est pas correctement traitée, la CESD peut entraîner une cécité qui nécessite une greffe de cornée. En conséquence, la régénération du CES devient plus importante. Il existe un groupe de cellules de soutien appelées cellules de niche limbique (LNC) qui fournissent un soutien essentiel à la fonction CES. Les cellules souches stromales limbiques ont d’abord été isolées par Polisetty et al.2 et identifiées par Xie et al.3 comme des LNC qui sont localisées dans l’épithélium limbique sous-jacent et le stroma du limbe. Les LNC sont les principales cellules souches de soutien du bord cornéen et, avec la fonction des CSM dérivées de la moelle osseuse (BMMSC), et pourraient être induites à se développer en cellules épithéliales cornéennes et en cellules stromales cornéennes, etc.3,4,5,6,7. Des études antérieures ont montré que les qualités des cellules souches des LNC sont plus primitives que celles desBMMSCs 8, qui sont déjà largement utilisées en clinique. Les LNC pourraient même devenir la prochaine option viable après la CSM, en particulier pour le traitement du CESD. En tant que cellules de soutien importantes pour le CES, les LNC sont également des cellules souches dérivées de la structure de « niche » du limbe. Les LNC peuvent jouer un rôle clé dans la dédifférenciation des cellules épithéliales cornéennes matures (MCEC) en CES9. Cependant, les études sur les LNC sont encore relativement insuffisantes et il n’y a pas de consensus sur la terminologie, l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC. Certains chercheurs ont nommé les cellules souches stromales dérivées de la biopsie limbique10, les cellules souches mésenchymateuses limbiques11, les cellules souches fibroblastiques limbiques 12 et les cellules stromales mésenchymateuses limbiques13. Étant donné que les caractéristiques de croissance des LNC n’ont pas été décrites en détail, et en raison de leurs applications scientifiques et cliniques prometteuses, et qu’elles pourraient être l’un des outils cliniques les plus importants à l’avenir, il est nécessaire de résumer l’isolement, la purification, l’identification et les caractéristiques des LNC.
Selon une étude antérieure14, les LNC sont principalement présents au niveau de l’épithélium limbique sous-jacent et du stroma du limbe. Ce protocole comprend le traitement du tissu limbique à l’aide de la collagénase A, l’obtention d’un cluster composé de LEPC et de LNC, et sa digestion en cellules uniques avec 0,25 % de trypsine-EDTA (TE). Les LNC ont ensuite été sélectivement cultivés dans un milieu de cellules souches embryonnaires modifiées (MESCM) pour être purifiés. Le protocole décrit dans cet article est simple et très efficace pour obtenir des LNC humains en grande quantité.
La procédure détaillée d’isolement, de culture et d’identification du LNC a été enregistrée dans la vidéo pour les scientifiques intéressés par l’étude du LNC, et elle peut être facilement répétée en cas de besoin.
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Protocole
Les tissus Limbus provenant de donneurs âgés de 50 à 60 ans ont été obtenus auprès de la banque d’yeux de la Croix-Rouge de l’hôpital de Tongji (Wuhan, Chine). Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de Tongji et a été mené conformément à la Déclaration d’Helsinki.
1. Isolement
- Obtenir du tissu limbique à partir d’un milieu de stockage cornéen à moyen terme et opérer dans des conditions aseptiques sur un établi ultra-propre.
- Grattez et retirez l’iris et l’endothélium autour de la cornée à l’aide d’une lame ronde chirurgicale stérile.
- Coupez le tissu limbique en douze morceaux de taille égale à l’aide d’une lame chirurgicale laissant 1 mm de part et d’autre de la cornée et de la sclérotique.
- Transférez les tissus du limbe dans une plaque de culture de 3,5 cm, ajoutez 1 mL de collagénase A (2 mg/mL, en milieu DF-12), pour immerger tous les tissus pour la digestion.
- Mettez la plaque dans l’incubateur cellulaire à 37 °C, digérez les tissus limbiques pendant 18 h.
REMARQUE : Les procédures de suivi sont généralement effectuées le deuxième jour. - Préparez une plaque de culture à 6 puits revêtue d’une matrice membranaire basale à 5 % (Matrigel).
- Enduire une matrice membranaire basale à 5 % (dissoute dans le MESCM [Tableau 1]) au fond du puits.
- Préparez des embouts de 200 μL et de 1 mL, un tube centrifuge de 15 mL et une plaque à 6 puits dans un sac stérilisé.
- Placez le sac stérilisé (y compris les embouts et le tube centrifuge) et une nouvelle plaque à 6 puits dans un environnement de -20 °C ou -80 °C pendant 20 minutes. Décongeler la matrice de la membrane basale au réfrigérateur à 4 °C.
- Retirez les pointes pré-refroidies, le tube centrifuge et la plaque à 6 puits de l’environnement à -20 °C ou -80 °C, puis effectuez les opérations suivantes sur l’établi ultra-propre.
- Transférez 50 μL de matrice de membrane basale à 5 % dans 1 mL de MESCM à l’aide d’un embout de 200 μL et mélangez-les doucement et uniformément.
- Transférer la matrice de la membrane basale à 5 % (dissoute dans MESCM) dans un puits d’une plaque de culture à 6 puits à l’aide de l’embout prérefroidi de 1 mL.
- Agitez doucement et horizontalement la plaque de culture à 6 puits, placez la plaque de culture à 6 puits dans l’incubateur cellulaire à 37 °C pendant environ 1 h, puis effectuez l’étape suivante.
- Après 18 heures de digestion, retirez le tissu limbique digéré par la collagénase A, il ne restera que quelques petits amas visibles et des tissus scléraux non digérés.
REMARQUE : La microscopie à fort grossissement révèle un amas composé de nombreuses cellules densément emballées (y compris les LNC). - À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, détacher les amas des tissus scléraux non digérés sous le stéréomicroscope.
- Transférez les grappes dans la plaque de culture de 3,5 cm et plongez-les dans 0,25 % d’ET, puis placez la plaque dans l’incubateur cellulaire pendant 15 min.
- Ajouter 1 mL de MESCM avec 10 % de sérum knock-out pour arrêter la digestion cellulaire et pipeter doucement de haut en bas pour remettre les amas en suspension dans les cellules individuelles à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL.
- Transférez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge de 15 ml et centrifugez à 200 x g pendant 5 min.
- Retirez le surnageant avec précaution sans perturber la précipitation des cellules, puis ajoutez 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension.
- Pipeter de haut en bas 2 à 3 fois jusqu’à ce que la précipitation de la cellule inférieure soit uniformément suspendue dans le MESCM à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, et prendre une suspension de cellules de 20 μL pour le comptage des cellules.
- Transférez la suspension cellulaire sur la plaque à 6 puits revêtue d’une matrice de membrane basale à 5 % à l’aide d’un embout de pipette de 1 mL et augmentez le volume de MESCM à 2,5 mL.
- Secouez doucement la plaque à 6 puits horizontalement pour répartir uniformément les cellules.
- Transférez les cellules dans l’incubateur de culture après avoir été imagées et enregistrées. Observez et photographiez les cellules tous les jours, et changez de support tous les 3-4 jours.
2. Identification de LNC
- Coloration par immunofluorescence
- Digérer les LNC du fond de l’assiette à l’aide de 1 mL 0,25 % TE pendant 5 min dans l’incubateur cellulaire à 37 °C.
- Terminez la digestion en ajoutant 1 mL de MESCM (contenant du sérum knock-out), centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min et aspirez soigneusement le surnageant.
- Ajouter 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension. Préparez une suspension cellulaire de 80 μL (4 × 103 cellules par lame) pour 4 lames (20 μL/lame) et utilisez un système de centrifugation pour déposer les cellules sur des lames de microscope selon les instructions du fabricant.
- Fixez les cellules (collées aux lames à l’étape 3) en utilisant du paraformaldéhyde à 4 % pendant environ 10 min, puis perméabilisez les cellules sur les lames avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min.
- Bloquer les cellules pendant 1 h avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % avant de les incuber avec des anticorps primaires (Pan-CK [1 :1000], Vim [1 :100], CD90 [1 :100], CD105 [1 :200], SCF [1 :100], PDGFRβ [1 :100]) sur un agitateur pendant une nuit à 4 °C. Après l’incubation, éliminer les anticorps primaires non liés en lavant (5 min/lavage, 3x) les lames avec du PBST (PBS + 0,1 % Tween 20).
- Incuber les anticorps secondaires correspondants (anticorps IgG anti-souris de l’âne TRITC [1 :1000], IgG anti-lapin de l’âne FITC [1 :500], IgG 488 anti-souris de l’âne [1 :300], IgG 594 anti-lapin de l’âne [1 :400]) pendant 1 h avec des anticorps IgG non spécifiques appropriés. Retirez l’anticorps secondaire non lié à l’aide de PBST (5 min/lavage, 3x).
- Contre-colorer les noyaux avec 5 μg/mL de DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole) et sceller les lames.
- Effectuer une imagerie par fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence (grossissement : 400x ; Temps d’exposition : 50 ms).
- Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR)
- Prenez le kit d’isolement de l’ARN pour extraire l’ARN total selon les instructions du fabricant.
- Utilisez un kit de transcription d’ADNc de grande capacité pour transcrire 1 à 2 μg d’ARN total en ADNc.
- Effectuez la transcription inverse (42 °C, 2 min ; 50 °C, 85 min) et la qPCR (95 °C, 5 min ; 95 °C, 10 s, 40 cycles) dans une solution de 20 μL contenant de l’ADNc (100 ng), du TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), du Master Mix PCR universel (10 μL) et du ddH2O (jusqu’à 20 μL).
- Utiliser la technique de tomodensitométrie comparative (ΔΔCT)4,9 pour examiner l’expression relative des gènes.
3. Caractérisation du LNC
- Comptage cellulaire (hémocytomètre)
- Digérer les LNC du fond de la plaque en utilisant 0,25 % de TE pendant 5 min dans l’incubateur cellulaire à 37 °C.
- Terminez la digestion en ajoutant 1 mL de MESCM (contenant du sérum knock-out), centrifugez la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min et aspirez soigneusement le surnageant.
- Ajouter 1 mL de MESCM pour remettre les cellules en suspension, puis prélever 10 μL de suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 0,5 mL. Ajouter un volume égal de 0,4 % de solution colorante au bleu de trypan.
- Placez 10 μL de suspension de cellules colorées sur la zone de comptage de l’hémocytomètre et couvrez-la d’une lamelle pour le comptage.
REMARQUE : Le nombre de cellules dans les cinq zones carrées du milieu est défini par « A » ; le nombre de cellules dans 1 mL est calculé comme suit : 5A × 10,4 × 2.
- Examen des marqueurs LNC et BMMSC par cytométrie en flux15
- Détecter l’expression de SCF, CD73, CD90 et CD105 dans les LNC et les BMMSCs à l’aide de la cytométrie en flux 15 (2-4 ×10 6 événements/échantillon, 2 000 cellules ont été obtenues à partir de chacun des échantillons, soit un total de 550 000 cellules qui ont été fermées simultanément).
- Prélever et colorer les cellules à 20-30 °C pendant 15 min dans un tampon bloquant (3 % de BSA et 0,05 % de Tween-20 dans le PBS) à l’aide d’anticorps prémarqués (SCF [1 :50], CD70 [1 :50], CD90 [1 :50] et CD105 [1 :50]) conformément aux instructions de la trousse.
- Effectuez une analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à l’aide d’un cytomètre en flux. Dans cette étude, les logiciels FACS Diva et FlowJo ont été utilisés. Pour chaque échantillon, enregistrez 10 000 événements et analysez les cellules vivantes.
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Résultats
Croissance de LNC
Les LNC ont été isolés avec succès selon la méthode de digestion de la collagénase A (2 mg/mL) du tissu cornéo-scléral, telle que décrite ci-dessus (Figure 1). Conformément à une étude précédemment rapportée3, après la digestion de la collagénase A, des amas ressemblant à des chenilles ont été visualisés au microscope (Figure 2). La proportion de cellules fusiformes augmentait progressivement avec le ...
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Discussion
La transparence cornéenne est généralement maintenue par la disposition et la distribution régulières de petites fibres (25 à 30 nm de diamètre) dans le stroma cornéen, ce qui est crucial pour l’acuité visuelle normale16. Il y a 253 millions de personnes malvoyantes dans le monde, dont 36 millions sont aveugles17. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) considère la cécité cornéenne comme l’un des risques les plus graves pour la vue humaine, représentant 5,1 % de toutes l...
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Déclarations de divulgation
Aucun des auteurs n’a fourni d’informations financières pertinentes.
Remerciements
Merci à Wei Wang, Lingjuan Xu et Rong Liu pour les conseils sur ce travail, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You et Li Guigang pour avoir fourni une partie du matériel, Guanyu Su pour l’écriture du manuscrit, Xiao Zhou, Yihong Xiong et Huatao Xie pour la correction du manuscrit, et Guigang Li pour ses conseils complets. Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82070936, 81470606, 81570819), projet de recherche scientifique sur la santé et la planification familiale de la province du Hubei (n° 133). WJ2017M073), les dix principaux projets de recherche médicale translationnelle de l’hôpital de Tongji (n° 2016ZHYX20), le projet de formation des jeunes pionniers de la médecine dans la ville de Wuhan (n° 2015whzqnyxggrc10), le programme de recrutement de talents mondiaux (G2022154028L), le projet de la Commission nationale de la santé de la province du Hubei en 2022 (WJ2021ZH0005) et la fondation de construction du département des finances du Hubei en 2022 (42000022815T000000102)
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 4',6-Diamidino-2-Phénylindole | ThermoFisher | D1306 | 5&mu ; g/mL |
| d’amphotéricine B | Sigma | V900919 | 1,25 &mu ; g/mL |
| Anti-CD73 | Abcam | ab202122 | 1:50 |
| Albumine sérique bovine | MERCK | A1933-CD105 | |
| Proteintech | 67075-1-Ig | 1:200 | |
| CD105 | Abcam | ab114052 | 1:50 |
| CD90 Proteintech | 66766-1-Ig | 1:100 | |
| CD90 | Abcam | ab307736 | 1:50 |
| Incubateur cellulaire | Shanghai Lishen | K1119K4644 | HF90(HT) |
| Système de centrifugation | StatSpin ; | StatSpin CytoFuge | 12-Collagenase |
| A | Roche | 10103578001 | 2 mg/mL |
| Microscope confocal | Zeiss ; | LSM700-Plaque | |
| de culture | virya | 3500356 | 35 mm |
| DME/F-12 1:1 (1x) ; | cytiva | SH30023.01 | 90 % |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire | ThermoFisher | A16016 | 1:1000 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire | ThermoFisher | 31568 | 1:1000 |
| FACS Diva sofware | BD Biosciences | Tree | Star-Flow |
| Cytometer | BD Biosciences | Becton Dickinson LSRII | - |
| Microscope à fluorescence | olympus | cx31 ; | |
| Gentamicine | Sigma | G1914 | 50 &mu ; g/mL |
| Hémocytomètre | MERCK | Z359629 | Bright-Line |
| Kit de transcription d’ADNc haute capacité | ThermoFisher | 4374966 | |
| Microscope à contraste de phase inversé | ; UOP | DSZ2000X | |
| ITS (insuline, transferrine, sélénite de sodium) | Sigma | I3146 | 5 &mu ; g/mL d’insuline, 5 &mu ; g/mL de transferrine, 5 ng/mL de sélénite de sodium |
| KnockOut SR Sérum de remplacement pour ESC/iPSC | gibco | 10828-028 | 10 % |
| Matrigel | BioCoat | ||
| 356234-Pan-CK | Abcam | ab7753 | 1:1000 |
| Paraformaldéhyde | NoninBio | NBS0135 | 4,00 |
| Paraformaldéhyde | MKBio | MM-1505 | 4 % |
| PDGFR&beta ; | Abclonal | A1444 | 1:100 |
| Instrument de PCR quantitative par fluorescence en temps réel | Applied Biosystems | Step One | Plus-Recombinant |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | 4 ng/mL |
| Facteur inhibiteur de la leucémie humaine recommandée (Lif) | Peprotech | 300-05 | 10 ng/mL |
| RNeasy Mini Kit d’isolement d’ARN | Qiagen | 74104 | - |
| SCF | Bioss | bs-0545R | 1:100 |
| SCF | Abcam | ab52603 | 1:50 |
| Stéréomicroscope | ZEISS | SteREO Discovery. V8 | |
| Lame ronde chirurgicale stérile | Careforde | 29500 | taille 10 |
| TaqMan Gene Expression Assay Mix | Applied Biosystems | 4448489 | |
| Triton X-100 | MERCK | X100 | 0.20 % |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | 0.40 |
| %Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | 0.25 % |
| Tween 20 | MERCK | P9416-Ultra | |
| Clean Bench | LaiTe | LT20200705 | SW-CJ-IFDG |
| Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Vim ; | Abcam | ab92547 | 1:100 |
Références
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