Établissement d’un modèle de cancer de la coloproctite chez la souris et évaluation de l’effet thérapeutique de la médecine chinoise

Le cancer colorectal (CCR) est une tumeur maligne gastro-intestinale courante, la troisième tumeur maligne la plus fréquente et la deuxième cause de décès dans le monde, représentant 10 % de l’incidence mondiale du cancer et 9,4 % du total des décès liés au cancer ^1,2. Des facteurs génétiques, une inflammation chronique, un régime riche en graisses, le diabète et une flore intestinale anormale sont des facteurs de risque de CCR ^3,4. Parmi eux, les maladies inflammatoires de l’intestin, en particulier la coloproctite ulcéreuse (CU), sont un facteur de risque évident de CCR ^5,6. Le CCR associé à la COLITE ULCÉREUSE (UC-CRC) est un processus de transition de l’inflammation, de l’hyperplasie atypique et du cancer basé sur l’inflammation chronique du colorectum, qui est différent du modèle typique de développement de l’adénome-adénocarcinome du CCR ^7,8. Par rapport à la population générale, le risque de CCR est environ 10 à 40 fois plus élevé chez les patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin⁹.

Actuellement, la chirurgie est toujours le traitement standard du CCR et, selon l’emplacement et le stade de la tumeur, une radiothérapie, un traitement médicamenteux systémique ou une combinaison des deux sont possibles¹⁰. Bien que ces modalités de traitement traditionnelles aient fait de grands progrès, en raison de l’hétérogénéité élevée et du taux de récidive du CCR, le pronostic est mauvais et l’effet du traitement n’est pas idéal^11,12. Par conséquent, la détection précoce, le diagnostic précoce et le traitement complet sont essentiels pour améliorer le taux de survie des patients atteints de CCR, et il est particulièrement important de prêter attention à la transformation de la colite ulcéreuse en CCR. Au fil des ans, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) a attiré beaucoup d’attention dans le traitement de l’UC-CRC ou de la gastrite chronique en raison de ses effets secondaires limités et de son efficacité significative. Sur la base d’un traitement dialectique, les célèbres praticiens de la médecine chinoise de différentes générations ont créé un grand nombre de prescriptions classiques, telles que la décoction Huangqi Jianzhong¹³, la décoction Sijunzi¹⁴ et la pilule Sishen¹⁵.

La décoction de Liujunzi (LJZD) est issue des travaux de Yi Xue Zheng Zhuan compilés sous la dynastie Ming et est une prescription classique de la MTC¹⁶. Comme le montre le tableau 1, le LJZD se compose de six herbes traditionnelles, dont Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.), Loup (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) et Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), qui a pour effet de reconstituer le qi et de renforcer la rate, d’assécher l’humidité et de résoudre les mucosités. Dans la pratique clinique moderne, il est souvent utilisé pour traiter la gastrite chronique, les ulcères gastriques et les ulcères duodénaux. La recherche pharmacologique moderne a montré que la LJZD et la LJZD modifiée ont une valeur d’application élevée dans le traitement adjuvant de la colite ulcéreuse et du cancer du tube digestif 17,18,19.

À l’heure actuelle, il existe de nombreuses façons de construire des modèles murins UC-CRC, mais le modèle murin induit par l’azoxyméthane (AOM)/sulfate de dextran sodique (DSS) est le modèle UC-CRC le plus largement utilisé ; les symptômes cliniques, les observations morphologiques et pathologiques ont prouvé que le modèle est très similaire à l’UC-CRC humaine^20,21. Le principe de base est d’induire d’abord la cancérogenèse avec l’OMA cancérigène chimique, puis d’exposer continuellement les souris à l’environnement de stimulation inflammatoire du DSS pour simuler les dommages continus et la réparation de l’épithélium de la muqueuse intestinale, construisant ainsi un modèle murin UC-CRC²². L’objectif de cette étude est d’établir un modèle murin de CCR-UC par injection intrapéritonéale d’OMA et stimulation cyclique du DSS à court terme et d’évaluer l’effet du médicament et le mécanisme moléculaire de la LJZD sur le CCR-UC afin de fournir une base scientifique pour le traitement du CCR-UC.

La procédure animale a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de médecine chinoise de Changchun (numéro d’enregistrement : 2021214). Des souris C57BL/6J spécifiques exemptes d’agents pathogènes (8 à 10 semaines, poids de 18 à 22 g), mâles et femelles, ont été logées dans des cages ventilées indépendamment à 22 °C et à 65 % d’humidité relative. Les souris ont commencé l’expérience après 7 jours d’alimentation adaptative, au cours desquels elles avaient libre accès à l’eau et à la nourriture.

1. Préparation du médicament

1. Préparation du LJZD
   REMARQUE : Le médicament chinois utilisé a été acheté à l’hôpital affilié de l’Université de médecine chinoise de Changchun et a été identifié comme étant de la médecine chinoise authentique (voir tableau 1).
   1. Mettez Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) dans un pot en céramique spécialisé (voir Tableau des matériaux). Ajouter 1000 mL d’eau distillée et laisser tremper à température ambiante pendant 1 h (voir figure 1A).
   2. Poudre 12 g Réduire en poudre fine avec un moulin et faire tremper dans 300 mL d’eau distillée dans un autre récipient pendant 1 h à température ambiante.
   3. Mélangez la médecine chinoise ci-dessus dans le pot en céramique spécialisé. Faire bouillir le mélange et maintenir à feu moyen jusqu’à ce qu’il ne reste que 300 ml de décoction. Utilisez de la gaze médicale pour filtrer et conservez le filtrat à température ambiante.
   4. Ajouter 1000 mL d’eau distillée et répéter l’opération de décoction ci-dessus une fois de plus. Filtrez à nouveau avec de la gaze médicale. Mélanger le filtrat et le faire bouillir jusqu’à ce qu’il ne reste que 150 ml.
   5. Centrifuger le liquide concentré à 10 000 x g pendant 5 min et concentrer davantage le surnageant obtenu à 30 mL à feu moyen. Transférez le concentré final dans un plat et séchez-le à l’aide d’un four de séchage électrique jusqu’à ce qu’il ne reste que le soluté sous forme de poudre.
   6. Peser le solide ci-dessus et le dissoudre dans de l’eau distillée stérile pour obtenir une solution contenant 22,85 mg de médicament par 0,2 mL (114,16 mg/mL), soit la dose quotidienne des souris.
2. Préparation de l’acide 5-amino-salicylique
   REMARQUE : L’acide 5-amino-salicylique (5-ASA ; voir tableau des matériaux) a un bon effet préventif sur l’UC-CRC, et il a été utilisé comme médicament positif dans cette étude²³.
   1. Dissoudre 64 mg de poudre de 5-ASA dans 200 mL d’eau distillée stérile pour obtenir une solution de 5-ASA à 1,82 mg/mL. La dose quotidienne pour une seule souris était de 0,2 ml.
3. Préparation de la solution d’injection d’AOM
   1. Ajouter 2,5 mL d’eau distillée stérile dans de la poudre d’OMA à 25 mg (voir le tableau des matériaux) et mélanger à l’aide d’un mélangeur vortex (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une solution mère d’OMA à 10 mg/mL, conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
   2. Préparer la solution injectable d’OMA en diluant la solution mère d’OMA avec de l’eau distillée stérile à 10 :1 (1 mg/mL).

2. Mise en place du modèle UC-CRC

REMARQUE : L’expérience a été divisée en 4 groupes : contrôle, modèle, LJZD et groupe 5-ASA, 10 souris dans chaque groupe. À l’exception du groupe témoin, les autres groupes ont été traités avec l’AOM et le DSS.

1. Injection intrapéritonéale de solution injectable d’OMA
   REMARQUE : Après une alimentation adaptative pendant 7 jours, les souris ont reçu une solution injectable d’OMA (1 mg/mL) par injection intrapéritonéale (voir figure 1B).
   1. Tenez la souris avec le ventre vers le haut et la tête légèrement vers le bas. Saisir la peau du dos pour resserrer la peau abdominale et percer la peau à environ 1 cm à droite de l’intersection de la racine des deux cuisses sur la ligne médiane de l’abdomen avec une seringue de 1 mL (voir le tableau des matières).
   2. Poussez l’aiguille de la seringue de 1 ml à une distance de 3 à 5 mm sous la peau, en la maintenant parallèle à la ligne médiane abdominale, et insérez l’aiguille de 0,3 à 0,5 mm dans la cavité abdominale à 45°.
   3. Après que la pointe ait traversé le muscle abdominal, l’opérateur détecte une perte soudaine de résistance. Ensuite, tirez la seringue vers l’extérieur et vers l’arrière pour observer si des infiltrations de liquide se produisent. Sinon, pousser lentement la solution injectable d’AOM dans les souris à 0,1 mL/10 g.
2. Stimulation cyclique d’une solution de SSD à 2 %
   REMARQUE : Chaque souris induite par l’OMA a reçu 500 ml de solution de DSS aux semaines 3, 6 et 9, et les souris ont bu librement pendant cette période.
   1. Préparer une solution de SSD à 2 % en ajoutant 500 mL d’eau distillée stérile à 10 g de DSS (voir le tableau des matières). Mélanger avec un mélangeur vortex et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
   2. Chaque souris induite par l’OMA boit 500 mL de solution DSS à 2 % librement pendant 7 jours les semaines 3, 6 et 9 après l’induction de l’OMA.

3. Traitement médicamenteux

REMARQUE : Les humains adultes ont besoin de 63 g de LJZD par jour. Selon la formule de conversion de la dose expérimentale de médicament chez la souris et chez l’humain, dose expérimentale équivalente pour les souris (mg/kg) = dose humaine (mg/kg)/poids corporel (60 kg) x 9,1, la dose quotidienne des souris était d’environ 9,6 g/kg.

1. Traiter le groupe LJZD et 5-ASA avec 0,1 mL/10 g de la solution préparée de LJZD et de 5-ASA par gavage gastrique à la semaine 7 et à la semaine 15, respectivement.
   1. Pour l’administration intragastrique chez la souris, effectuez la procédure suivante. Tenez la souris dans la main gauche et dans la main droite, tenez l’appareil de perfusion gastrique. Insérez l’aiguille de la seringue dans la bouche et faites-la glisser le long de la paroi arrière du pharynx des souris. Faites glisser le long du pharynx pendant que les souris avalent et continuez à avancer. Lorsqu’il y avait une sensation de résistance et que la seringue pouvait être enfoncée dans le pharynx, retirez l’aiguille et terminez l’injection.
2. Traitez le groupe témoin et le groupe modèle avec la même quantité de solution saline (voir le tableau des matériaux).
3. Traitez les souris de chaque groupe avec un médicament approprié une fois par jour à la même heure pendant la période d’administration.

4. Évaluation du modèle UC-CRC et efficacité de la LJZD

1. Score de l’indice d’activité de la maladie
   REMARQUE : Selon le tableau 2, le score de l’indice d’activité de la maladie (IAD) a été évalué en combinant la perte de poids, la viscosité fécale et le saignement des selles des souris.
   1. Enregistrez quotidiennement le poids des souris depuis le début de l’alimentation adaptative jusqu’à la fin du traitement médicamenteux.
   2. Observez attentivement la consistance fécale de chaque souris expérimentale et notez les selles comme l’une des trois conditions suivantes : selles normales et molles et diarrhée aqueuse.
   3. Enregistrez les saignements fécaux des animaux de laboratoire comme l’une des trois conditions suivantes : pas de saignement, peu de saignements et du sang visible dans les selles.
2. Détection du taux d’IL-6 dans le sérum
   1. Traiter les souris avec LJZD ou 5-ASA pendant 9 semaines. Fixez les souris en saisissant la peau du cou de la souris avec la main gauche et en appuyant doucement sur la table expérimentale pour prendre la position latérale du décubitus. Coupez les moustaches des souris avec des ciseaux. Coupez soigneusement les moustaches des souris avec des ciseaux (voir le tableau des matériaux) pour éviter la contamination du sang.
      REMARQUE : Les souris qui ne pouvaient pas se tortiller librement étaient considérées comme correctement fixées. Si cela ne se produit pas, les souris doivent être réparées.
   2. Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane à 2 %. Stérilisez la peau autour du globe oculaire avec de l’éthanol (voir le tableau des matériaux). Appuyez doucement sur la peau de l’œil sur le côté pour que le globe oculaire soit congestionné et saillant.
   3. Clampez le globe oculaire avec une pince à épiler et retirez les globes oculaires avec précision et rapidement. Laissez le sang s’égoutter dans le tube centrifuge (voir Tableau des matériaux). Dans le processus, appuyez sur le cœur de la souris pour accélérer la collecte de sang.
   4. Conservez le sang prélevé à température ambiante pendant 30 min et centrifugez-le à 3 500 x g pendant 10 min. Prélever le surnageant et détecter le niveau d’IL-6 selon les instructions du kit de détection du contenu en IL-6 (voir le tableau des matériaux).
3. Séparation du tissu colorectal
   1. Euthanasier les souris après prélèvement sanguin en inhalant 5 % d’isoflurane surdosé et luxation cervicale (voir tableau des matières) conformément à l’éthique animale.
   2. Conservez les souris dans un environnement anatomique cryogénique. Immobilisez les souris en position couchée. Coupez les poils du bas-ventre avec des ciseaux et stérilisez-les à l’éthanol.
   3. Pincez le point d’intersection entre les deux racines de la cuisse et la ligne médiane abdominale avec une pince à paupières (voir tableau des matériaux). Coupez une incision transversale d’environ 1 à 1,5 cm avec des ciseaux.
   4. Coupez une incision longitudinale le long de la ligne médiane de l’abdomen à partir du milieu de l’incision transversale vers l’apophyse xiphoïde.
   5. Retirez les tissus péricolorectaux en direction de l’anus pour séparer le colorectum des tissus environnants. Attention à ne pas endommager le colorectum.
   6. Poussez la peau de l’abdomen sur les côtés pour exposer complètement le colorectum. Retirer le colorectum de la cavité abdominale à l’aide d’une pince à paupières et couper les segments de l’anus au caecum (exclure) ; La longueur totale est d’environ 10 cm. Conserver les tissus colorectaux obtenus dans une solution saline à 4 °C.
4. Évaluation de la longueur et du poids du rectum
   1. Extraire la solution saline à 4 °C avec une aiguille de 5 mL (voir le tableau des matières) pour rincer l’intérieur du colorectum. Ensuite, placez le colorectum sur du papier absorbant pour absorber l’humidité du tissu.
   2. Pesez les tissus colorectaux puis placez-les sur du papier A4 pour mesurer leur longueur.
5. Mesurer le nombre de tumeurs dans le colorectum
   1. Coupez le colorectum dans le sens de la longueur pour le déplier complètement et observez le nombre et la taille des tumeurs dans le colorectum.
6. Analyse pathologique du colorectum
   1. Fixer le colorectum dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h. Incorporer le tissu rectal fixé dans de la paraffine fondue et sectionner en continu sur une épaisseur de 5 μm par un microtome de congélation des tissus.
   2. Selon la procédure de Hou et ^al.24, détacher les sections dans du xylène, puis le déshydrater avec des concentrations en série d’éthanol. Après avoir coloré avec une solution d’hématoxyline pendant 5 min, rincez les sections à l’eau pure. Après cela, colorez avec une solution d’éosine à 0,5 % pendant 1 min (voir tableau des matériaux).
   3. Effectuez à nouveau une déshydratation en gradient et un traitement transparent au xylène. Scellez les coupes et observez-les au microscope optique (voir le tableau des matériaux) et photographiez, comme décrit par Xie et ^al.25.
7. Analyse immunohistochimique du colorectum
   1. Déparaffinez et déshydratez les sections selon la méthode ci-dessus. Réparer l’antigène dans les sections avec une technique de réparation thermique à haute pression, comme décrit par Gok et ^al.26.
   2. Faire tremper les sections dans des bloqueurs de peroxydase endogènes à température ambiante pendant 15 min. Scellez les sections avec du sérum de chèvre (voir le tableau des matériaux).
   3. Ajouter l’anticorps primaire ZO-1 (1 :1000), l’occludine (1 :1000) et le KI67 (1 :500 ; voir le tableau des matériaux) dans les sections et incuber toute la nuit à 4 °C. Rincer les sections avec un tampon PBS (voir le tableau des matières), y ajouter un anticorps secondaire à usage général (1 :5000 ; voir le tableau des matériaux) et incuber à 37 °C pendant 30 min.
   4. Ajoutez la solution DAB (voir Tableau des matériaux) aux sections pour le développement des couleurs. Contre-colorez les sections avec une solution d’hématoxyline.
   5. Déshydratez, transparentisez et scellez à nouveau les sections. Observer l’expression des protéines au microscope optique.

La décoction de LJZD a été préparée selon le rapport de composition des médicaments du tableau 1 et la méthode de décoction de la MTC de la figure 1A. Selon le point temporel indiqué à la figure 1B, des souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 1 mg/mL d’OMA le 7e jour, et les souris ont eu libre accès à de l’eau potable contenant 2 % de DSS au cours des 3e, 6e et 9esemaines. Le modèle murin UC-CRC a été établi avec succès à la 15esemaine. Pendant ce temps, les souris ont été traitées par LJZD par gavage de la semaine 7 à la semaine 15. Les données ont montré que par rapport au groupe témoin, le groupe modèle UC-CRC avait une perte de poids significative, qui a été atténuée par le traitement par LJZD (Figure 2A, P < 0,01). À la fin de l’essai, le traitement par LJZD a amélioré le score DAI par rapport au groupe modèle UC-CRC (Figure 2B). Par rapport au groupe témoin, le groupe modèle UC-CRC avait une longueur colorectale plus courte, qui a été augmentée par le traitement LJZD (Figure 2C, D, P < 0,01). Le rapport entre le poids colorectal et le poids corporel reflète le développement du CCR chez la souris, et un rapport plus élevé indique le développement d’une tumeur aiguë27. Par rapport au groupe témoin, l’indice d’organes colorectaux du groupe modèle a été significativement augmenté et le traitement par LJZD a considérablement réduit l’indice d’organes colorectaux (Figure 2E, P < 0,05). De plus, le traitement par LJZD a également inhibé la formation de tumeurs colorectales (Figure 2F, P < 0,01) et le taux de facteur pro-inflammatoire sérique IL-628 (Figure 2G, P < 0,05).

Les résultats pathologiques ont confirmé que par rapport au groupe témoin, les souris du groupe modèle UC-CRC avaient des tumeurs colorectales plus grandes et avaient formé un adénocarcinome, tandis que le traitement par LJZD réduisait la taille et le grade des tumeurs (Figure 3). Les données immunohistochimiques ont démontré que le traitement par LJZD améliorait la fonction de barrière colorectale chez les souris modèles UC-CRC, comme l’indique l’expression élevée des protéines ZO-1 et Occludin29 (Figure 4). En parallèle, le traitement par LJZD a supprimé les niveaux d’expression protéique du marqueur cancéreux KI6730 (Figure 4).

Figure 1 : Préparation de la LJZD et établissement d’un modèle murin de cancer de la coloproctite.( A) Le mélange de Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) et Ban Xia (9 g) traité au gingembre a été immergé dans 1000 mL d’eau distillée à température ambiante pendant 1 h. La poudre de Fuling de 12 g a été trempée dans 300 mL d’eau distillée à température ambiante pendant 1 h. Le mélange des six herbes ci-dessus a été décocté à 100 °C pendant 40 min. (B) Le jour 7, des souris C57BL/6J ont reçu une injection intrapéritonéale de 1 mg/mL d’OMA. Des souris ont reçu de l’eau contenant 2% de DSS ad libitum au cours des 3e, 6e et 9esemaines. De 7 à 15 semaines, des souris ont reçu du LJZD par gavage. Abréviations : AOM, azométhane ; DAI, indice d’activité de la maladie ; DSS, sulfate de dextran sodique ; LJZD, décoction de Liujunzi ; w, semaine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Évaluation du modèle UC-CRC et de l’efficacité de LJZD. (A) LJZD a amélioré le poids corporel chez les souris modèles UC-CRC. (B) LJZD a atténué les scores DAI chez les souris modèles UC-CRC. (C, D) LJZD a augmenté la longueur du colorectum chez les souris modèles UC-CRC. (E) LJZD a réduit l’indice d’organe du colorectum chez les souris modèles UC-CRC. (F) LJZD a inhibé la tumorigenèse colorectale chez les souris modèles de cancer de la coloproctite. (G) LJZD a supprimé le taux sérique d’IL-6 chez les souris modèles UC-CRC. #P< 0,05 et ##P< 0,01, par rapport au groupe témoin ; *P < 0,05 et **P< 0,01, par rapport au groupe modèle. Les données ont été exprimées sous forme de moyenne ±écarts-types (n = 10) et ont été analysées par analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d’un test de Tukey. P < 0,05 indiquait une différence statistiquement significative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Évaluation des caractéristiques pathologiques des tissus colorectaux chez la souris par coloration à l’hématoxyline-éosine. Il n’y avait pas de dommages pathologiques dans le groupe témoin. Le tissu tumoral du groupe modèle UC-CRC était grand et présentait un adénocarcinome et une néoplasie de haut grade, tandis que le groupe de traitement LJZD présentait un tissu tumoral réduit accompagné d’une petite quantité d’adénome local et de néoplasie de bas grade. La flèche noire représente la glande tumorale dysplasique précancéreuse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Effet de LJZD sur la fonction de barrière colorectale et le marqueur de cancer chez les souris modèles UC-CRC. (A) Images immunohistochimiques de ZO-1, Occludin et KI67. (B) Résultats statistiques de l’expression protéique de ZO-1, Occludin et KI67. Le traitement par LJZD a augmenté l’expression des protéines fonctionnelles de la barrière colorectale ZO-1 et de l’occludine, tout en diminuant le niveau du marqueur cancéreux KI67 chez les souris modèles UC-CRC. ## P < 0,01, par rapport au groupe témoin ; ** P < 0,01, par rapport au groupe modèle. Les données ont été exprimées sous forme de moyenne ±écarts-types (n = 10) et ont été analysées par analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d’un test de Tukey. P < 0,05 indiquait une différence statistiquement significative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition et proportion de drogues dans le LJZD.

Tableau 2 : Score de l’indice d’activité de la maladie pour le modèle UC-CRC chez la souris.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.