Prédiction computationnelle des préférences en acides aminés de domaines de liaison à des peptides potentiellement multispécifiques impliqués dans des interactions protéine-protéine

Résumé

Nous décrivons une méthodologie basée sur la diversification des séquences pour estimer les préférences en acides aminés des sites de liaison multispécifiques dans les interactions protéine-protéine (IPP). Dans cette stratégie, des milliers de ligands peptidiques potentiels sont générés et criblés in silico, surmontant ainsi certaines limites des méthodes expérimentales disponibles.

Résumé

De nombreuses interactions protéine-protéine impliquent la liaison de courts segments de protéines à des domaines de liaison aux peptides. Habituellement, de telles interactions nécessitent la reconnaissance de motifs linéaires à conservation variable. La combinaison de régions hautement conservées et plus variables dans les mêmes ligands contribue souvent à la multispécificité de la liaison, une propriété commune des enzymes et des protéines de signalisation cellulaire. La caractérisation des préférences en acides aminés des domaines de liaison aux peptides est importante pour la conception de médiateurs des interactions protéine-protéine (IPP). Les méthodes de calcul sont une alternative efficace aux techniques expérimentales souvent coûteuses et lourdes, permettant de concevoir des médiateurs potentiels qui peuvent ensuite être validés dans des expériences en aval. Ici, nous avons décrit une méthodologie utilisant l’application Pepspec du package de modélisation moléculaire Rosetta pour prédire les préférences en acides aminés des domaines de liaison aux peptides. Cette méthodologie est utile lorsque la structure de la protéine réceptrice et la nature du ligand peptidique sont toutes deux connues ou peuvent être déduites. La méthodologie commence par une ancre bien caractérisée du ligand, qui est prolongée par l’ajout aléatoire de résidus d’acides aminés. L’affinité de liaison des peptides générés de cette manière est ensuite évaluée par l’amarrage des peptides de squelette flexible afin de sélectionner les peptides avec les meilleurs scores de liaison prédits. Ces peptides sont ensuite utilisés pour calculer les préférences en acides aminés et pour calculer éventuellement une matrice position-poids (PWM) qui peut être utilisée dans d’autres études. Pour illustrer l’application de cette méthodologie, nous avons utilisé l’interaction entre les sous-unités du facteur de régulation 5 de l’interféron humain (IRF5), précédemment connu pour être multispécifique mais globalement guidé par un motif court conservé appelé pLxIS. Les préférences estimées en acides aminés étaient cohérentes avec les connaissances antérieures sur la surface de liaison d’IRF5. Les positions occupées par les résidus de sérine phosphorylables présentaient une fréquence élevée d’aspartate et de glutamate, probablement parce que leurs chaînes latérales chargées négativement sont similaires à celles de la phosphosérine.

Introduction

L’interaction entre deux protéines implique souvent la liaison de courts segments d’acides aminés à des domaines de liaison peptidiques, ressemblant à des interfaces protéine-peptide. Les protéines réceptrices impliquées dans de telles interactions protéine-protéine (IPP) ont souvent la capacité de reconnaître un certain ensemble de séquences de ligands qui se chevauchent mais divergent, une propriété connue sous le nom de multispécificité ^1,2. La reconnaissance multispécifique est une caractéristique de nombreuses protéines cellulaires, mais elle est particulièrement remarquable dans les enzymes et les protéines de signalisation cellulaire³. Les protéines qui interagissent avec des sites de liaison multispécifiques ont souvent une combinaison de régions plus ou moins conservées dans leur séquence ^4,5,6. Dans ce scénario, les motifs de séquence les plus conservés sont impliqués dans des interactions moléculaires strictes. À l’inverse, les séquences les plus variables interagissent avec des surfaces permissives dans le site de liaison du récepteur. Habituellement, ces segments moins conservés mais toujours pertinents sur le plan fonctionnel sont des boucles dépourvues de modèles de structure secondaire définis ou ont des conformations encore plus dynamiques, telles que celles typiques des protéines intrinsèquement désordonnées⁷.

L’identification de ligands peptidiques potentiels de sites de liaison est généralement la première étape de la conception de médiateurs capables d’interférer avec les IPP correspondants⁸. Cependant, il est souvent peu probable de trouver un seul résidu d’acide aminé le plus fréquent à la plupart des positions de séquence dans les ligands des sites de liaison multispécifiques. Au lieu de cela, ces sites peuvent avoir des préférences particulières pour une classe spécifique d’acides aminés en fonction de leurs propriétés chimiques, par exemple, les acides aminés acides et chargés négativement tels que l’aspartate ou le glutamate, les acides aminés aromatiques volumineux tels que la phénylalanine ou les résidus plus hydrophobes tels que les acides aminés aliphatiques alanine, valine, leucine ou isoleucine³. Plusieurs méthodes expérimentales peuvent fournir des informations sur les préférences en acides aminés des sites de liaison aux protéines, notamment l’évolution dirigée⁹, la mutagenèse à balayage multi-codons¹⁰ et le balayage mutationnel profond¹¹. Toutes ces méthodes suivent l’approche de la diversification des séquences, qui est basée sur l’introduction de mutations dans les ligands originaux et l’analyse plus approfondie de leur effet sur la fonction de la protéine réceptrice (voir Bratulic et Badran¹² pour une revue complète). Cependant, ces méthodes nécessitent souvent l’étude de grandes bibliothèques de séquences, ce qui les rend plus lourdes, plus coûteuses et plus longues.

Les méthodes informatiques permettant de déduire les préférences en acides aminés des sites de liaison multispécifiques ont le potentiel de contourner les limites des méthodes de laboratoire humide. Parmi celles-ci, l’approche de diversification de séquences in silico évalue l’impact énergétique d’une large gamme de remplacements d’acides aminés dans la séquence de ligands afin de caractériser la plasticité structurale de l’IPP¹³. Cette méthode commence par la structure ou le modèle du ligand peptidique lié au site de liaison du récepteur et introduit ensuite des mutations dans la séquence du ligand. Des fonctions statistiques et de scoring énergétique sont ensuite utilisées pour évaluer l’impact de ces mutations sur la stabilité et l’affinité de liaison. L’ensemble des séquences de ligands les mieux notées résultant de la phase d’évaluation peut ensuite être utilisé pour calculer les préférences en acides aminés. Cette stratégie a le potentiel de traiter un très grand nombre de séquences de ligands de manière efficace. Par conséquent, il peut fournir une inférence plus complète et cohérente des préférences en acides aminés par rapport à celles calculées à partir du nombre plus limité de séquences qui peuvent généralement être traitées dans les approches de laboratoire humide.

L’application Pepspec de la suite de modélisation moléculaire^{Rosetta 14} est un outil qui effectue la diversification des séquences comme une étape clé de son mode de conception peptidique. Cette application nécessite une structure ou un modèle de la protéine réceptrice avec un peptide lié jusqu’à un seul résidu d’acide aminé de longueur, qui est utilisé comme point d’ancrage pour les étapes suivantes. La séquence du peptide lié est ensuite étendue (si nécessaire) et diversifiée pour générer un grand nombre de ligands peptidiques peptidiques présumés. L’affinité de liaison de ces peptides est ensuite évaluée par l’amarrage de peptides de squelette flexible afin de sélectionner ceux dont les scores de liaison sont les mieux prédits. Bien que le principal résultat de cette application soit les meilleurs candidats peptidiques sélectionnés à la fin de la phase de conception, l’ensemble beaucoup plus large de peptides acceptés au cours de cette phase peut également être utilisé pour calculer les préférences en acides aminés du site de liaison cible. Les préférences en acides aminés sont calculées comme la fréquence de chaque résidu d’acide aminé par position de la séquence de ligand, représentée soit par une matrice de poids de position (PWM), soit par un logo de séquence plus visuel.

Dans cet article, nous décrivons un protocole permettant d’estimer les préférences en acides aminés de la surface de liaison d’une protéine réceptrice impliquée dans un IPP. Le protocole se concentre sur les IPP dans lesquels un segment linéaire du ligand protéique est connu pour se lier à la protéine réceptrice, de sorte que le scénario peut être modélisé comme une interface protéine-peptide. Dans ce scénario, les motifs conservés du ligand interagissent généralement avec des poches définies dans le site de liaison du récepteur, bien que l’ensemble du segment du ligand impliqué dans l’IPP puisse contenir des régions moins conservées. La figure 1 présente un organigramme résumant les principales étapes du protocole. Le protocole commence par la structure 3D du complexe protéine-protéine et réduit davantage la protéine ligand au segment potentiel qui interagit le mieux, laissant la protéine réceptrice intacte. Le segment qui interagit le mieux est déduit en utilisant le serveur BUDE Alanine Scan¹⁵, qui effectue une mutagenèse computationnelle par balayage de l’alanine pour identifier les résidus de points chauds entre les deux protéines en interaction. Dans cette approche, les résidus du ligand sont remplacés individuellement par l’alanine, et la variation estimée de l’énergie libre ou de la stabilité du complexe (ΔΔG) est ensuite utilisée pour déduire la pertinence du résidu correspondant pour l’IPP cible. Une fois que le segment qui interagit le mieux est déduit, son complexe avec la protéine réceptrice est utilisé comme structure de base soumise à Pepspec pour effectuer la diversification de la séquence.

Figure 1 : Vue d’ensemble des principales étapes du protocole proposé dans ce travail. Les numéros correspondent aux numéros d’étape dans la section protocole. Les figures ont été faites avec le complexe protéine-protéine utilisé comme exemple décrit dans le texte. Dans ce complexe, la chaîne protéique considérée comme le récepteur est représentée en rose, tandis que la chaîne considérée comme le ligand est représentée en bleu clair avec son segment prédit qui interagit le mieux mis en évidence en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’une des limites du protocole suggéré est l’exigence d’une structure résolue de l’interface protéine-peptide. Le protocole peut également commencer par un modèle de l’interface protéine-peptide cible, bien que les étapes de modélisation spécifiques ne soient pas décrites dans le présent document. De plus, bien que le protocole puisse être exécuté sur un ordinateur personnel exécutant n’importe quel système d’exploitation, un environnement Linux est nécessaire pour les étapes impliquant les applications Rosetta. Un cluster d’ordinateurs est également fortement recommandé pour l’étape de diversification de séquences en raison du grand nombre d’itérations généralement effectuées par Pepspec.

L’application du protocole suggéré est illustrée par l’estimation des préférences en acides aminés de la surface d’attente d’IRF5, un membre de la famille des facteurs de régulation de l’interféron humain (IRF). Nous avons choisi cette protéine comme exemple car, lors de son activation, deux sous-unités se lient pour former un dimère dont la structure est bien caractérisée¹⁶. Dans les dimères IRF, la liaison peut être modélisée comme une interface protéine-peptide dans laquelle une sous-unité fournit la surface de liaison et l’autre interagit à travers une région contenant un court motif conservé appelé pLxIS^17,18. De plus, la liaison aux sous-unités IRF est multispécifique ; Par conséquent, ils peuvent former des homodimères, des hétérodimères et des complexes avec d’autres protéines cellulaires appelées coactivateurs¹⁸.

Protocole

1. Préparation initiale de l’interface protéine-peptide

1. Téléchargement de la structure du complexe protéine-protéine
   1. Accédez à la page d’accueil de la Banque de données sur les protéines (BDP) (https://www.rcsb.org/) et tapez l’ID de la base de données sur la structure du complexe protéine-protéine dans la boîte de recherche principale (Figure 2A). L’ID PDB pour la structure du dimère IRF5, utilisé comme exemple dans ce travail, est 3DSH¹⁹.
   2. Dans la page principale de la structure souhaitée, cliquez sur Télécharger les fichiers (Figure 2B) puis sur Assemblage biologique 1 (PDB - gz) (Figure 2C).
      REMARQUE : Dans la base de données PDB, les structures de nombreux complexes protéiques formés par des monomères identiques sont représentées sous forme d’assemblages biologiques, dans lesquels seule la structure d’un monomère (unité asymétrique) est stockée dans le fichier PDB. La structure du multimère, dans ce cas, le dimère IRF5, doit être téléchargée en tant qu’assemblage biologique contenant deux instances de l’unité asymétrique. Pour faciliter les prochaines étapes de ce protocole, les deux monomères sont d’abord séparés et différents ID de chaîne leur sont attribués.
   3. Ouvrez la structure téléchargée dans UCSF Chimera²⁰ et cliquez sur Outils > l’édition de la structure > Modifier les ID de chaîne. Dans cet exemple, les deux chaînes de l’assemblage biologique sont nommées A. Renommez la deuxième chaîne (étiquetée #0.2) en B et cliquez sur OK.
   4. Cliquez sur Favoris > panneau Modèle , puis sélectionnez le modèle contenant les deux chaînes. Cliquez sur le bouton Grouper/Dissocier pour séparer chaque chaîne dans un modèle différent. Ensuite, sélectionnez les deux modèles et cliquez sur le bouton Copier/Combiner . Entrez un nouveau nom pour le modèle combiné, cochez la case Fermer les modèles source, puis cliquez sur OK.
   5. Cliquez sur Sélectionner > chaîne et confirmez que chaque chaîne du dimère est maintenant identifiée par une lettre différente, à savoir A et B.
   6. Utilisez Fichier > Enregistrer PDB pour enregistrer la structure modifiée dans un autre fichier PDB, qui sera utilisé dans les prochaines étapes du protocole (ici, le nom IRF5_dimer.pdb a été utilisé).

Figure 2 : La page de la banque de données sur les protéines (PDB) pour la structure utilisée comme exemple représentatif dans ce travail. (A) Boîte de recherche pour introduire le code d’accès PDB de la structure cible. (B) Menu pour télécharger la structure en plusieurs formats. (C) Options permettant de télécharger des assemblages biologiques lorsque la structure a été enregistrée en tant qu’unité asymétrique (voir l’étape 1.1.2 pour plus de détails). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Identification du segment cible dans la protéine ligand
   1. Accédez au serveur BUDE Alanine Scan (https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/). Cliquez sur le bouton Choisir un fichier sous Téléchargement de structure et sélectionnez le fichier PDB enregistré à l’étape 1.1.6.
   2. Sur la page suivante, vérifiez que la structure a été correctement chargée (Figure 3A) et entrez un nom pour le travail sur le serveur (Figure 3B).
   3. Définissez les chaînes de la PDB qui seront traitées comme le récepteur (A) et le ligand (B) (Figure 3C). Ensuite, cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse pour soumettre le travail.
   4. Une fois le travail terminé, cliquez sur Afficher les résultats pour ouvrir la page des résultats (Figure 4).
      REMARQUE : Dans la page de résultats, les résidus de la structure du ligand sont colorés en fonction de leur variation estimée de l’énergie libre (ΔΔG), et ceux avec des valeurs plus élevées sont colorés en rouge.
   5. Dans la liste des résidus, sélectionnez le tronçon de résidus prévu pour mieux interagir avec la surface de liaison cible. Assurez-vous que ces résidus regroupent les valeurs les plus élevées pour la différence d’énergie libre (ΔΔG). Dans cet exemple, le segment entre les résidus Leu424 et Ser436 a été sélectionné (mis en évidence par un encadré rouge dans le panneau de droite de la figure 4).
3. Préparation de l’interface protéine-peptide pour la diversification des séquences
   1. Ouvrez le fichier PDB enregistré à l’étape 1.1.6 dans Chimera et vérifiez qu’il ne manque pas d’atomes ou de liaisons dans la structure des sous-unités cibles.
   2. Supprimez toutes les petites molécules, ions et solvants qui ont été cocristallisés avec la structure d’origine. Pour ce faire, cliquez sur Sélectionner > résidus , puis sélectionnez toutes les molécules autres que les acides aminés standard. Ensuite, cliquez sur Actions > Atomes/Liaisons et Supprimer.
   3. Recadrez la chaîne de ligands jusqu’au segment qui interagit le mieux choisi à l’étape 1.2.5. Pour ce faire, cliquez sur Favoris et Séquence , puis sur la chaîne considérée comme le ligand (B). Dans le panneau Séquence , faites glisser la souris pour sélectionner tous les résidus, à l’exception de ceux situés entre les positions 424 et 436. Pour supprimer ces résidus, cliquez sur Actions > Atomes/Liaisons et Supprimer.
   4. Utilisez Fichier > Enregistrer PDB pour enregistrer la structure modifiée dans un autre fichier PDB, qui est utilisé dans les étapes suivantes du protocole (ici, le nom IRF5_interface.pdb a été utilisé).

Figure 3 : Sélection du récepteur et du ligand dans le serveur BUDE Alanine Scan. (A) Représentation graphique du complexe protéine-protéine. (B) Zone de texte pour entrer le nom de la tâche sur le serveur. (C) Panel pour sélectionner de manière interactive les chaînes qui seront considérées comme récepteur et ligand (voir l’étape 1.2 pour plus de détails). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Page de résultats du serveur BUDE Alanine Scan. Le segment potentiel qui interagit le mieux dans la séquence de ligand est indiqué par une case rouge. Dans le panneau de gauche, le résidu avec la contribution énergétique prévue la plus élevée (Leu433) est surligné en vert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Diversification séquentielle

REMARQUE : dans les étapes suivantes, rosetta_main fait référence au répertoire d’installation principal de Rosetta, qui se trouve généralement dans /opt/rosetta_src__bundle/main/, où indique la version de Rosetta installée. En outre, il est supposé que les applications Rosetta sont accessibles à l’ensemble du système ; Si ce n’est pas le cas, le chemin complet vers les exécutables doit être fourni. Lorsqu’ils sont compilés à partir du source, ces exécutables se trouvent dans le répertoire /rosetta_main/source/bin/ .

1. Optimisation initiale des chaînes latérales d’acides aminés
   1. Copiez la structure modifiée enregistrée à l’étape 1.3.4 dans un emplacement Linux accessible par les applications Rosetta.
   2. Utilisez l’application FixBB de Rosetta pour effectuer un reconditionnement de toutes les chaînes latérales d’acides aminés de la structure de base avant la diversification de la séquence. Dans cette opération, l’orientation de toutes les chaînes latérales d’acides aminés est optimisée pour minimiser l’énergie et améliorer la stabilité du complexe. Pour ce faire, exécutez la commande suivante :
      
      REMARQUE : Cette commande génère un fichier PDB nommé d’après la structure d’origine avec un suffixe numérique supplémentaire (IRF5_interface_0001.pdb dans cet exemple).
   3. Pour faciliter l’étape suivante du protocole, renommez le fichier PDB recompressé avec le suffixe _repack à l’aide de la commande suivante :
      mv IRF5_interface_0001.pdb IRF5_repack.pdb
2. Diversification des séquences
   1. Exécutez Pepspec en mode conception pour effectuer l’étape de diversification de séquence réelle à l’aide de la commande suivante :
      
      Les options générales sont les suivantes :
      • -s indique le fichier d’entrée (le fichier PDB recompressé généré à l’étape 2.1.3).
      • -o indique le préfixe pour nommer les fichiers de sortie.
      • - database indique le chemin d’accès à la base de données principale de Rosetta 3.
      • -ex1, -ex2 et extrachi_cutoff sont des options de la bibliothèque de rotamer (voir la documentation Pepspec pour plus de détails).
      • -overwrite indique à l’application d’écraser les sorties préexistantes possibles générées par les itérations précédentes.
      Voici les options relatives à la diversification des séquences en soi :
      • -pepspec :pep_chain indique les chaînes PDB considérées comme ligand ('b' dans cet exemple).
      • -pepspec :native_pep_anchor indique le résidu d’acide aminé utilisé comme ancre (dans cet exemple, le résidu Leu à la position 10 du peptide ligand).
      • -pepspec :n_peptides indique le nombre de structures peptidiques à afficher.
      • -pepspec :no_prepack_prot indique à l’application d’ignorer le reconditionnement dans la structure de base d’entrée (puisque cela a été précédemment effectué à l’étape 2.1).
        REMARQUE : La sortie principale de Pepspec est un répertoire contenant les fichiers PDB pour les peptides résultant de la phase de conception, nommés à l’aide du préfixe de sortie avec le suffixe .pdbs (IRF5.pdbs dans l’exemple). De plus, Pepspec affiche toutes les séquences peptidiques acceptées testées dans le cadre de l’étape de diversification de séquence et leurs scores d’énergie Rosetta correspondants dans un fichier texte délimité par des tabulations nommé d’après le préfixe de sortie, avec l’option . spec (IRF5.spec dans l’exemple). Étant donné que le protocole décrit dans ce travail vise à estimer les préférences en acides aminés plutôt que la conception réelle des peptides, les étapes suivantes utilisent IRF5.spec au lieu des structures PDB dans le répertoire .pdbs .

3. Estimation des préférences en acides aminés

1. Calcul d’un PWM
   1. Pour générer un PWM, utilisez le script gen_pepspec_pwm.py inclus dans la suite Rosetta. Pour exécuter ce script, utilisez la commande suivante :
      
      où:
      • IRF5.spec est le fichier de sortie Pepspec généré à l’étape 2.2.
      • -1 indique qu’il n’y a pas de résidus N-terminaux supplémentaires dans la séquence et, par conséquent, les positions dans le PWM sont basées sur 1.
      • 0.2 indique au script de ne prendre en compte que les 20 % de peptides les mieux notés de la sortie Pepspec (la valeur par défaut est 0.1, correspondant aux 10 %)
      • interface_score indique au script de classer les peptides en fonction du score de l’interface, qui est l’un des différents scores Rosetta inclus dans le fichier de sortie Pepspec.
        REMARQUE : Ce script génère deux fichiers de sortie, l’un pour le PWM calculé (avec le suffixe .pwm ) et l’autre pour les séquences du sous-ensemble de peptides utilisés pour calculer le PWM (avec le suffixe .seq ). Les noms de ces fichiers incluent également le score et la fraction de peptides utilisée pour le classement. Dans cet exemple, ces fichiers sont respectivement nommés IRF5_interface_score_0.2.pwm et IRF5_interface_score_0.2.seq.
2. Génération d’un logo de séquence
   1. Accédez au serveur WebLogo (https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)²¹ et cliquez sur le bouton Choisir un fichier à côté de Télécharger les données de séquence. Téléchargez le fichier contenant les séquences peptidiques générées à l’étape 3.1.1 (IRF5_interface_score_0.2.seq dans cet exemple).
   2. Choisissez le format et la taille du logo souhaités en fonction de la longueur d’entrée. L’exemple utilise le format PDF et une taille de 15 cm x 12 cm. Cliquez sur Créer un logo.

Résultats

Dans cet article, nous avons décrit un protocole permettant de prédire les préférences en acides aminés de la surface de liaison d’IRF5, membre d’une famille de facteurs de transcription connus sous le nom de facteurs régulateurs de l’interféron humain. Ces protéines sont des régulateurs des réponses immunitaires innées et adaptatives et participent à la différenciation et à l’activation de plusieurs cellules immunitaires. Les sous-unités IRF ont des surfaces de liaison hautement plastiques et multispécifiques, capables de former des homodimères, des hétérodimères et des complexes avec d’autres protéines cellulaires^17,18. On pense que la dimérisation est la première étape de l’activation de ces facteurs, et chez la plupart des membres de la famille, elle est déclenchée par la phosphorylation de plusieurs résidus de sérine/thréonine¹⁸. Lors de la dimérisation, chaque monomère interagit avec la surface d’appel de l’autre monomère via un motif hautement conservé appelé pLxIS, situé vers la région C-terminale de leur séquence. L’abréviation pLxIS représente partiellement les préférences en acides aminés de la surface de liaison, qui reconnaît séquentiellement un acide aminé polaire ('p'), suivi de deux positions avec une fréquence élevée de leucine ('L') et d’isoleucine ('I'), séparées par une position occupée par n’importe quel acide aminé ('x') et suivie d’un résidu de sérine phosphorylable (Ser436 dans cet exemple). La phosphorylation de plusieurs résidus de sérine, dont celle du motif pLxIS, favorise la courbure du segment C-terminal d’un monomère et son interaction avec la surface de liaison de l’autre monomère^19,22.

Le protocole décrit ici a commencé avec une structure 3D du dimère^{IRF5 19}, dans laquelle l’un des monomères a été arbitrairement considéré comme le récepteur dans l’IPP, tandis que l’autre a été considéré comme le ligand contenant le motif pLxIS. Pour mieux définir le segment du ligand interagissant avec le site de liaison du récepteur, nous avons effectué une mutagenèse computationnelle à balayage de l’alanine (étape 1.2). Le segment prédit était composé de 13 résidus d’acides aminés des positions 424 à 436, le motif pLxIS commençant à Arg432. La structure du dimère d’origine a ensuite été réduite à un complexe peptide-protéine dans lequel la séquence du monomère considéré comme ligand a été recadrée au segment prédit qui interagit le mieux, tandis que l’autre monomère a été laissé intact (étape 1.3). Cette structure a ensuite été utilisée comme entrée pour la stratégie de diversification des séquences (section 2), désignant le résidu leucine du motif pLxIS (Leu433) comme l’ancrage requis par Pepspec. Ce processus a permis d’obtenir plus de 26 000 ligands peptidiques potentiels. Les 20 % supérieurs de ligands potentiels ayant les meilleurs scores énergétiques (5 280) ont été utilisés pour estimer les préférences en acides aminés de la surface de liaison sous la forme d’un PWM (figure 5A) et d’un logo de séquence (figure 5B) (section 3).

Figure 5 : Préférences en acides aminés de la surface de liaison d’IRF3. (A) PWM indiquant la fréquence de chaque résidu d’acide aminé (rangées) par position dans la séquence de ligands peptidiques (colonnes). (B) Logo de séquence représentant visuellement les fréquences d’acides aminés correspondantes. Les positions de la séquence IRF5 d’origine sont indiquées entre parenthèses sous chaque colonne du logo de la séquence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans le PWM, chaque ligne correspond à un résidu d’acide aminé spécifique, tandis que chaque colonne représente une position dans la séquence. Chaque cellule de la matrice contient la fréquence relative de chaque acide aminé à cette position, pondérée par les fréquences de fond globales. Les logos de séquence sont construits en empilant les lettres d’acides aminés de sorte que la hauteur totale de la pile à chaque position indique la conservation de la séquence globale à cette position. À l’inverse, la hauteur des lettres individuelles à l’intérieur de la pile indique la fréquence de l’acide aminé correspondant. Dans cet exemple, le PWM et le logo de la séquence sont cohérents avec les connaissances antérieures concernant la surface de liaison de l’IRF5, avec une préférence plus élevée pour un acide aminé polaire (glutamate) à la position 432 (« p ») et une très forte préférence pour la leucine et l’isoleucine aux positions 433 et 435, respectivement. Remarquablement, les positions 427, 429 et 436 ont toutes été prédites pour avoir une conservation plus élevée de l’aspartate malgré le fait qu’elles soient occupées par la sérine dans la séquence IRF5 originale. Cette découverte met en évidence l’importance de la phosphorylation de ces positions pour la formation du dimère IRF5 puisque la charge négative dans les chaînes latérales de l’aspartate et du glutamate ressemble à celle de la phosphosérine. En fait, une étude antérieure a rapporté qu’un peptide leurre appelé IRF5D, dans lequel ces résidus de sérine étaient remplacés par de l’aspartate, était capable d’inhiber l’activité²³ d’IRF5. À l’inverse, il a été prédit que la position 425 aurait une très forte préférence pour la sérine, ce qui suggère que le résidu de sérine dans cette position pourrait participer à l’IPP sous sa forme non phosphorylée. En effet, il a déjà été rapporté pour d’autres IRF que la phosphorylation du résidu de sérine équivalent affecte négativement la dimérisation et la liaison à d’autres coactivateurs^16,24.

Discussion

Le présent article décrit un protocole permettant d’estimer les préférences en acides aminés de sites de liaison potentiellement multispécifiques basés sur la diversification de séquences in silico. Peu d’outils informatiques ont été développés pour estimer les préférences en acides aminés des interfaces protéine-peptide 14,25,26. Ces outils ont un caractère prédictif, mais ils diffèrent par les algorithmes de calcul utilisés pour effectuer leurs prédictions et les corrections qu’ils mettent en œuvre pour améliorer la précision. Dans ce travail, nous avons utilisé l’application Pepspec de la suite de modélisation moléculaire^{Rosetta 14}. Bien qu’elle soit principalement orientée vers la conception de peptides, cette application met en œuvre un algorithme de diversification de séquence qui peut être utilisé pour prédire les préférences en acides aminés. À notre connaissance, cet outil est le seul actuellement disponible qui fournit un script intégré pour calculer un PWM directement à partir des résultats de la diversification de séquence. Il est important de noter que le protocole est axé sur les IPP, par conséquent, la structure initiale devrait être un complexe de deux sous-unités protéiques. Avant l’étape de diversification de la séquence proprement dite, la protéine considérée comme le ligand est coupée au segment censé interagir avec la protéine réceptrice, et elle est ensuite traitée comme un peptide. Cependant, le protocole peut également être appliqué aux complexes protéine-peptide, un scénario dans lequel les étapes 1.1 à 1.3 peuvent ne pas être nécessaires. Au cours de l’étape de préparation (section 1), il est également essentiel de corriger les résidus et les hétéroatomes mal formatés, ainsi que de modéliser des segments de la structure complexe pertinents pour le site de liaison cible qui n’ont pas pu être correctement résolus. Ces corrections dépendent de la structure spécifique à l’étude et n’étaient pas nécessaires pour la structure utilisée à titre d’exemple ici.

Les étapes les plus critiques de ce protocole sont celles réalisées avec les applications Rosetta, qui comprennent un reconditionnement initial des chaînes latérales avec FixBB (étape 2.1) et la diversification réelle des séquences avec Pepspec (étape 2.2). Cette étape initiale de reconditionnement, appelée pré-emballage, est explicitement mentionnée comme étant requise par les auteurs de Pepspec¹⁴. Bien qu’elle puisse être réalisée par Pepspec, les auteurs de cette application recommandent vivement d’utiliser l’application FixBB, qui a été spécialement conçue pour optimiser les rotamères à chaîne latérale dans les squelettes protéiques fixes. Dans l’étape de diversification de séquence, il est important de considérer que l’application Pepspec est orientée vers la conception de peptides. Par conséquent, il signale par défaut quelques candidats peptidiques ayant obtenu les meilleurs scores. Étant donné que l’objectif du protocole présenté ici est de générer un grand nombre de ligands peptidiques peptidiques présumés plutôt que quelques candidats ayant obtenu les meilleurs scores, nous avons changé l’option « -pepspec :n_peptides » de 8 (par défaut) à 200 (étape 2.2.1). En utilisant ce paramètre, Pepspec a prédit plus de 20 000 peptides comme ligands potentiels. Cet ensemble de peptides présumés a fourni une vue très large du paysage de liaison du récepteur, qui a ensuite été échantillonné pour les 20 % des peptides les mieux notés pour l’estimation réelle des préférences en acides aminés. Si un nombre inférieur de peptides est transmis à « -pepspec :n_peptides », beaucoup moins de candidats seront acceptés par Pepspec. Dans ce scénario, l’échantillonnage proposé dans le protocole peut capturer de nombreux ligands peptidiques présumés avec des scores d’énergie sous-optimaux, ce qui pourrait entraîner des estimations moins robustes.

L’une des principales limites du protocole présenté dans ce travail est qu’il repose sur la connaissance préalable de la structure de la protéine contenant la surface de liaison. Cependant, cette structure ne doit pas nécessairement être déterminée expérimentalement mais peut être modélisée ab initio ou par modélisation d’homologie¹⁴. De plus, il est également nécessaire de connaître le mode de liaison d’au moins un résidu d’acide aminé (ancre) du ligand peptidique. Cette ancre sera étendue à un certain nombre de résidus via des options d’extension d’ancrage spécifiques de Pepspec pour effectuer la diversification de la séquence. Si l’orientation de l’ensemble du ligand dans le site de liaison est connue, comme c’est le cas de l’exemple représentatif de cette étude, les options liées à l’extension de l’ancre doivent être laissées par défaut (pas d’extension), bien qu’un résidu du peptide doive toujours être spécifié comme ancre pour guider l’algorithme de diversification de séquence. L’application Pepspec ne prend pas en charge l’amarrage de novo d’un éventuel résidu d’ancrage, mais elle peut utiliser comme entrée la sortie d’autres applications d’amarrage ou un modèle d’un complexe protéine-peptide homologue pour effectuer l’amarrage d’ancrage¹⁴ ; Bien que ces scénarios dépassent le cadre de cet article.

Un inconvénient important du protocole suggéré est sa nature prédictive inhérente, qui est directement affectée par la résolution et la précision de la structure initiale ou du modèle du complexe protéine-protéine. Cependant, les auteurs de Pepspec ont déclaré que la précision de cette application a été considérablement améliorée en traitant les coordonnées du squelette d’entrée comme un ensemble de structures plutôt qu’en utilisant une seule structure protéique et en appliquant une normalisation de fond lors du calcul du PWM¹⁴. De plus, le protocole est une alternative aux méthodes expérimentales lourdes et coûteuses pour l’estimation des préférences en acides aminés. Toutes ces méthodes expérimentales reposent sur l’évaluation de grandes banques de séquences obtenues en introduisant des mutations dans la séquence des ligands protéiques, suivie d’une évaluation expérimentale de l’impact de ces mutations (voir Bratulic et Badran¹² pour une revue). Des protocoles de calcul tels que celui proposé dans ce travail permettent de cribler des milliers de ligands peptidiques peptidiques présumés de manière très efficace, fournissant potentiellement un ensemble plus robuste pour l’estimation des préférences en acides aminés 13,14,25. Le protocole que nous proposons peut être appliqué à n’importe quel IPP qui pourrait être réduit à une interface protéine-peptide. De plus, ce protocole peut servir de stratégie initiale pour identifier les médiateurs des IPP, tels que les activateurs ou les inhibiteurs potentiels. Les médiateurs identifiés peuvent être utilisés davantage pour étudier ces IPP en laboratoire, ou ils peuvent être évalués comme des agents thérapeutiques potentiels.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BUDE Alanine Scan Server	Université d’Édimbourg	https://pragmaticproteindesign.bio.ed.ac.uk/balas/	doi : 10.1021/acschembio.9b00560
Logiciel de modélisation Rosetta	Commons	https://www.rosettacommons.org/software	doi : 10.1002/prot.22851
UCSF Chimera	Université de Californie San Francisco		https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ doi : 10.1002/ JCC.20084