Extraction et détection de la géosmine et du 2-méthylisobornéol dans l’eau et les poissons à l’aide de sondes d’extraction par sorption de grande capacité et de GC-MS

Résumé

Ce protocole présente un flux de travail entièrement automatisé pour l’extraction de la géosmine et du 2-méthylisobornéol à partir de l’eau et des tissus de poissons riches en lipides. La méthode permet de détecter précocement ces molécules avant qu’elles n’atteignent les seuils d’odeur. Des données représentatives d’un milieu aquacole sont fournies.

Résumé

La géosmine et le 2-méthylisobornéol sont des composés organiques volatils d’origine microbienne qui se produisent fréquemment dans les systèmes d’aquaculture en recirculation et confèrent des odeurs et des saveurs désagréables aux poissons, même à des concentrations extrêmement faibles. Les méthodes d’analyse existantes pour ces composés chez les poissons ont du mal à atteindre un débit d’échantillons suffisant et ne sont souvent pas automatisées, ce qui nécessite une préparation pratique approfondie. Nous avons développé des méthodes d’analyse de la géosmine et du 2-méthylisobornéol à partir de tissus d’eau et de poissons, respectivement, à l’aide d’une sonde métallique portant une phase d’extraction par sorption de grande capacité. Une détection robuste et quantitative a été obtenue dans l’eau et les tissus des poissons, avec des limites minimales de détection de 1,2 ng/L pour la géosmine et de 1,1 ng/L pour le 2-méthylisobornéol dans l’eau et de 18,1 ng/kg et 13,6 ng/kg, respectivement, dans les tissus des poissons. Ces concentrations étaient bien inférieures aux seuils de détection chez l’homme. Par conséquent, nous avons conclu que ces méthodes pouvaient détecter la géosmine et le 2-méthylisobornéol avant qu’ils ne deviennent perceptibles par l’homme. Contrairement à d’autres techniques d’extraction par sorption à haute capacité, telles que l’extraction par sorption à barre d’agitation, cette technique est entièrement automatisable, ce qui améliore considérablement le débit et évite les erreurs de manipulation manuelle, tandis que la conception durable de la sonde empêche la rupture, comme c’est souvent le cas avec la fibre de micro-extraction en phase solide (SPME). Cette méthode convient à la surveillance des odorisants dans tous les contextes de qualité de l’eau, ainsi qu’à la détection de composés désagréables dans les matrices solides et semi-solides.

Introduction

La géosmine (GSM) et le 2-méthylisobornéol (MIB) sont naturellement présents dans l’eau et les sols en tant que sous-produits du métabolisme microbien ^1,2. Bien qu’ils ne soient généralement pas dangereux pour l’environnement ou la santé humaine, ils confèrent à l’eau des odeurs et des saveurs désagréables de « terre » et de boue, qui sont perceptibles même à des concentrations extrêmement faibles, aussi faibles que 10 et 20 ng/L pour GSM et MIB, respectivement ^3,4. En tant que telle, la présence de ces odorants réduit la qualité perçue de l’eau et est hautement indésirable dans la plupart des contextes. Dans les voies navigables intérieures, les odorants réduisent l’attrait des visiteurs et peuvent susciter des plaintes auprès des autorités environnementales⁵, tandis que dans l’eau potable, les odorants dégagent une odeur et un goût désagréables que les consommateurs trouvent inacceptables⁶. En effet, de nombreux pays ont imposé des limites réglementaires sur les niveaux d’odorant dans l’eau potable, la Chine stipulant 10 ng/L comme concentration maximale GSM autorisée^7.

Les systèmes d’aquaculture en recirculation (SAR) prennent de plus en plus d’importance dans l’industrie de l’aquaculture en tant que moyen de production de poissons. Ces systèmes fonctionnent sur terre et réutilisent continuellement l’eau, réduisant ainsi l’impact environnemental, mais un filtrage intensif de l’eau RAS est nécessaire pour maintenir des conditions optimales pour l’élevage des poissons. Les biofiltres à lit mobile sont colonisés par des microbes en raison de l’abondance de nutriments dans les excréments de poissons et les aliments non consommés⁸. Ces microbes sont bénéfiques pour l’élimination des déchets azotés et des nutriments en excès ; cependant, certaines espèces peuvent produire du GSM, du MIB et d’autres odorants⁴. Ces odorants s’infiltrent ensuite dans l’eau et sont absorbés dans la chair du poisson, où ils peuvent conférer des caractéristiques d’odeur et de saveur désagréables que les consommateurs trouvent répréhensibles. Les valeurs seuils d’odeur dans la chair du poisson dépendent de l’espèce, mais les valeurs pour le saumon atlantique, une espèce commune dans les SAR, sont de 44 à 500 ng/kg pour le GSM et de >900 ng/kg pour le MIB⁴. Par conséquent, les opérateurs de SAR devraient surveiller régulièrement les concentrations de GSM et de MIB dans leurs systèmes pour s’assurer qu’elles n’atteignent pas des niveaux⁴ problématiques. Les poissons affectés peuvent être purgés des composés désagréables avant la récolte pour récupérer la qualité du filet ; Cependant, il s’agit d’un processus coûteux qui oblige l’installation à arrêter la recirculation de l’eau et à faire circuler de l’eau nouvelle dans le système pendant 10 à 14 jours⁹. Étant donné que le GSM et le MIB posent un problème persistant et économiquement coûteux dans un large éventail d’industries, il est logique de réévaluer et d’améliorer les méthodes d’analyse de détection. Idéalement, les opérateurs de SAR devraient être en mesure de surveiller à la fois l’eau du SAR pour identifier les concentrations croissantes de GSM et de MIB avant qu’elles ne deviennent problématiques, et les tissus des poissons pour déterminer si et dans quelle mesure les niveaux de GSM et de MIB ont affecté la qualité du produit.

La plupart des méthodes de détection du GSM et du MIB utilisent la chromatographie en phase gazeuse (GC) avec un spectromètre de masse (MS) ou un détecteur à ionisation de flamme (FID) pour la séparation et la détection, mais la façon dont les odorants sont initialement extraits de la matrice d’eau varie considérablement, de nombreuses méthodes ayant été publiées¹⁰. Le fait qu’une telle variété de méthodes aient été testées et, en fait, qu’elles soient encore utilisées régulièrement, témoigne du fait que chacune d’entre elles présente des inconvénients importants. Ces inconvénients comprennent la nécessité d’un échantillon de grande taille et de grands volumes de solvant comme dans l’extraction liquide-liquide (LLE), une faible sensibilité et une interférence de l’eau comme dans les méthodes basées sur l’espace de tête, ou des problèmes étendus de transfert et de contamination du système comme dans la purge et le piège (P et T).

L’extraction par sorption couvre une gamme de techniques d’extraction dans lesquelles une phase de sorption solide peut être utilisée pour extraire des odorisants de l’espace de tête au-dessus d’un échantillon ou de l’échantillon lui-même par immersion directe¹⁰. Ces techniques sont compatibles avec des volumes d’échantillon plus petits que les autres techniques, ne nécessitent pas de solvants et ne sont généralement pas gravement affectées par les interférences de l’eau. Cependant, la forme la plus courante d’extraction par sorption, la micro-extraction en phase solide (SPME), n’utilise qu’un petit volume de phase sorptive avec une faible capacité pour les analytes, ce qui limite l’efficacité de l’extraction. De plus, les fibres cassantes impliquées peuvent être endommagées ou cassées¹¹, interrompant les flux de travail. L’extraction par sorption par barre d’agitation (SBSE) permet de surmonter ces difficultés grâce à un volume de phase plus important et à une conception plus durable, mais elle n’est pas facilement automatisable, ce qui nécessite un transfert manuel des barres d’agitation dans les échantillons et des échantillons dans des tubes de désorption thermique¹². Dans le contexte du dégrillage régulier de l’eau, où un débit élevé est crucial, ce manque d’automatisation constitue un obstacle important.

L’objectif de notre méthode est d’améliorer les méthodes susmentionnées en ce qui concerne le débit d’échantillons et la capacité globale d’extraction par sorption. Ainsi, nous avons développé une technique utilisant des sondes d’extraction par sorption à haute capacité (HCSE), combinant la capacité élevée d’analyte et la robustesse de la SBSE avec la sélection de phase et l’automatisation de SPME pour l’analyse quantitative à haut débit de GSM et MIB. Avec quelques modifications, la technique peut être appliquée à la fois à des échantillons d’eau et à des échantillons de tissus de poissons homogénéisés. Ici, nous décrivons le protocole dans son intégralité et présentons les données de validation démontrant qu’il est reproductible, linéaire et très sensible. Bien que les échantillons d’aquaculture soient utilisés à des fins de démonstration, le protocole convient à la surveillance des odorisants dans un large éventail de types d’échantillons, y compris les eaux, les sols et diverses denrées alimentaires. Grâce à l’automatisation complète, le protocole est particulièrement avantageux lorsque le nombre d’échantillons est censé être élevé.

Protocole

Les échantillons de poisson ont été prélevés sur des animaux déjà abattus pour la consommation humaine. Par conséquent, aucune autorisation éthique n’était requise.

1. Préparation de l’étalonnage et des étalons internes

1. Préparation de l’étalon d’étalonnage
   1. Préparer la solution mère C1 en ajoutant 10 μL de solution de géosmine et de 2-méthylisobornéol (100 μg/mL) dans une fiole jaugée de 100 mL et en la remplissant au trait avec du méthanol de qualité LC-MS. La solution résultante contiendra chaque analyte à 10 μg/L (ppb).
   2. Préparer les étalons en ajoutant la solution mère de C1 dans le volume indiqué au tableau 1 dans une fiole jaugée de 100 mL et en la remplissant au volume avec de l’eau désionisée.
   3. Fabriquez quotidiennement de nouveaux étalons d’étalonnage, car ils sont extrêmement périssables.
      REMARQUE : Il est important de préparer ces solutions mères fraîches tous les jours.
2. Préparation interne de l’étalon
   1. Préparez la solution mère (I1) en ajoutant 10 mg de 2-isopropyl-3-méthoxypyrazine (IPMP) (pure à >98 %) dans une fiole jaugée de 1 L remplie au trait de méthanol de qualité LC-MS, ce qui donne une substance mère de 10 mg/L.
   2. Pipeter 100 μL de la solution I1 dans une fiole jaugée de 100 mL et remplir au volume d’eau désionisée pour donner la solution I2 (10 μg/L). Injectez 50 μL dans chaque flacon d’échantillon pour atteindre une concentration finale de 100 ng/L.

2. Analyse de l’eau

1. Préparation des échantillons
   1. Placez un flacon de 20 ml pour chaque échantillon d’eau analysé dans le plateau d’échantillon.
   2. À l’aide d’une balance calibrée, peser et placer 2,5 g de NaCl dans chaque flacon d’échantillon à sertir de 20 ml.
      REMARQUE : L’ajout de sel améliore le transfert de la MIB et de la géosmine de l’eau à l’espace de tête.
   3. À l’aide d’une pipette ou d’un distributeur sur bouteille, ajoutez 5 ml d’eau d’échantillon dans chaque flacon d’échantillon à sertir de 20 ml.
   4. Pipeter 50 μL de la solution d’étalon interne I2 sur chaque échantillon, étalon d’étalonnage et tout échantillon d’AQ/CQ, y compris les blancs.
   5. Placez le capuchon sur le flacon et scellez-le à l’aide d’un outil de sertissage pour minimiser la perte d’analyte.
   6. Ne traitez que 1 à 2 échantillons à la fois et scellez rapidement chaque flacon une fois terminé pour minimiser la perte d’analytes volatils.
2. Extraction d’analytes (eau)
   1. Placez le plateau d’échantillonnage sur le support de plateau de l’échantillonneur automatique.
   2. Pour préparer une méthode d’instrument, ouvrez le programme d’instrument et cliquez sur l’éditeur de méthodes.
      1. Créez une méthode en entrant les paramètres suivants dans l’éditeur de méthode (en laissant les autres paramètres à leurs valeurs par défaut) :
      2. Dans « Pré-échantillonnage », réglez le temps d’agitation du flacon à 10 min pour permettre aux analytes de se répartir de l’eau vers l’espace de tête.
      3. Dans « Échantillonnage », réglez la température d’incubation à 65 °C, le temps d’incubation à 30 min et la vitesse de l’agitateur à 400 tr/min.
      4. Assurez-vous que l’option « laver la sonde HiSorb » est activée ; Sinon, la matrice d’échantillon résiduelle peut contaminer le système.
      5. Dans 'Désorption par sonde', réglez le temps de désorption sur 15 min et latempérature de désorption sur 270 °C.
      6. Dans les paramètres du piège, réglez la basse température du piège sur 25 °C et le « débit fractionné » sur 8 mL/min.
   3. Exécutez la méthode de l’échantillonneur automatique en conjonction avec la méthode GC-MS en appuyant sur le bouton Démarrer de chacun des programmes respectifs.

3. Analyse des tissus de poissons

1. Préparation des échantillons
   1. Placez un flacon de 20 ml pour chaque échantillon de poisson analysé dans le plateau d’échantillons.
   2. Homogénéiser les tissus du poisson à l’aide d’un robot culinaire disponible dans le commerce.
   3. À l’aide d’une balance calibrée, peser 1,00 g de tissu de poisson homogénéisé dans chaque flacon.
   4. Pipeter 5 mL de solution saturée de NaCl dans chaque flacon.
   5. Pipeter 100 μL de la solution étalon interne I2 sur chaque échantillon, échantillon d’étalonnage et tout échantillon d’AQ/CQ.
   6. Placez un capuchon sur le flacon et scellez-le à l’aide de l’outil de sertissage du flacon.
   7. Ne préparez que 1 à 2 échantillons à la fois pour réduire la perte de composés semi-volatils et volatils.
2. Extraction d’analytes (poissons)
   1. Placez le plateau d’échantillonnage sur le support de plateau de l’échantillonneur automatique.
   2. Préparez une méthode d’instrument comme suit (en laissant les autres paramètres à leurs valeurs par défaut).
      REMARQUE : Le temps d’agitation du flacon avant l’échantillonnage et la température d’incubation diffèrent de ceux de la section 2.2.2.
      1. Dans 'Pré-échantillonnage', réglez le temps d’agitation du flacon à 20 min.
      2. Dans « Échantillonnage », réglez la température d’incubation à 80 °C, le temps d’incubation à 30 min et la vitesse de l’agitateur à 400 tr/min.
      3. Assurez-vous que l’option « laver la sonde HiSorb » est activée, sinon la matrice d’échantillon résiduelle peut contaminer le système.
      4. Dans « Désorption par sonde », réglez le temps de désorption sur 15 min et la température de désorption sur 270 °C.
      5. Dans les réglages du piège, réglez la basse température du piège à 25 °C et le débit fractionné à 8 mL/min.
         REMARQUE : Une étape de pré-échantillonnage plus longue et plus chaude est nécessaire ici en raison de l’affinité plus élevée du MIB et du GSM pour les tissus de poissons riches en lipides par rapport à l’eau.
   3. Exécutez la méthode de l’échantillonneur automatique en conjonction avec la méthode GC-MS en appuyant sur le bouton Démarrer de chacun des programmes respectifs.

4. Séparation et détection à l’aide de la GC-MS

1. Utilisez les mêmes paramètres GC-MS pour les méthodes d’eau et de tissus de poisson.
2. Assurez-vous que le GC est équipé d’une colonne 5MS, de 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm et qu’il est alimenté avec un gaz porteur d’hélium ultra-pur. Réglez le débit du support à 2 mL/min.
3. Préparez un programme de four GC comme suit : Une température initiale de 60 °C, maintenue pendant 3 min, puis une rampe de température de 10 °C/min à 100 °C, puis de 20 °C/min à 190 °C, puis de 30 °C/min à 280 °C, avec un temps de maintien final de 2 min. La durée totale de fonctionnement est de 16,5 min.
4. Réglez la ligne de transfert entre GC et MS à 280 °C et la source d’ions et le quadruple à 250 °C et 200 °C, respectivement.
5. Pour la détection MS en mode balayage, utilisez une plage de balayage de m/z 50-350.
6. Pour le fonctionnement de surveillance des ions sélectionnés (SIM), utilisez les ions de quantification et de confirmation respectivement m/z 95 et 107 pour MIB, m/z 137 et 152 pour IPMP et m/z 112 et 55 pour GSM.
   REMARQUE : De nombreux logiciels de chromatographie proposent la sélection automatique des pics, mais il est fortement recommandé de vérifier manuellement la sélection des pics pour détecter les erreurs.

Résultats

Optimisation de la méthode

Diverses expériences ont été menées pour s’assurer de l’optimisation de la méthode, notamment une évaluation de transfert, l’optimisation du temps de désorption de la sonde, une évaluation de l’étalon interne, une évaluation de la phase de la sonde, une évaluation de la linéarité et de la répétabilité, et le calcul de la limite de détection de la méthode.

Évaluation du report

Nous avons commencé notre expérience avec une température de désorption de la sonde de 250 °C. Des étalons d’étalonnage ont été préparés, comme le montre le tableau 1. Pour évaluer le carryover, nous avons analysé les normes GSM et MIB à 20 ng/L puis nous avons procédé, dans l’ordre, à un calcul des paramètres GC-MS sans rien injecter dans la colonne (ébauche de colonne), à une désorption du piège de focalisation sans rien transférer de l’injecteur (ébauche de piège), à un chauffage de l’injecteur sans insérer de sonde (ébauche d’injecteur), et une désorption de la sonde sans prélèvement préalable (blanc de sonde). Moins de 1 % de transfert a été observé dans l’ébauche de colonne, l’ébauche de piège et l’ébauche d’injecteur, mais dans l’ébauche de sonde, elle était de 9,35 % et de 3,77 % pour la perfusion GSM et MIB, respectivement (tableau 2). Par conséquent, nous avons déterminé qu’il y avait un transfert significatif de GSM sur la sonde PDMS dans les conditions utilisées.

Optimisation du temps de désorption

Après avoir identifié un transfert sur la sonde PDMS, nous avons cherché à résoudre ce problème en ajustant la température de désorption de la sonde. On s’attendrait à ce qu’une température de désorption de sonde plus élevée augmente le taux de désorption de l’analyte de la sonde, de sorte que la désorption soit plus complète à la fin du temps de désorption de la sonde de 15 minutes. Cependant, une température plus élevée pourrait également favoriser la dégradation de l’analyte et, par conséquent, affecter négativement la sensibilité. Des températures plus élevées peuvent également endommager les matériaux absorbants, de sorte que les températures supérieures à 280 °C doivent être évitées. La rémanence de GSM était significative à la température de désorption de la sonde de 250 °C, mais elle a été considérablement réduite jusqu’à bien en dessous du seuil d’acceptabilité de 5 % lorsque 270 °C était utilisée à la place (figure 1). Cette amélioration a été obtenue sans perte de sensibilité, les zones de pic produites pour l’analyse initiale n’étant pas plus petites à 270 °C que pour des températures de désorption de sonde plus basses (Figure 1). Cela indique que toute augmentation de la dégradation de l’analyte est négligeable.

Utilisation de l’étalon interne

Le composé 2-isopropyl-3-méthoxypyrozine a été largement utilisé comme étalon interne lors de la détection du GSM et du MIB¹³. Nous avons comparé les concentrations calculées de GSM et de MIB avec les concentrations dopées connues, avec et sans correction d’étalon interne. Le taux de récupération sans correction de l’étalon interne a été faible, les concentrations ayant été calculées dans 60 % des concentrations enrichies connues (figure 2). En revanche, avec la correction standard interne appliquée, la récupération a été très bonne, de l’ordre de 100 %. Par conséquent, nous avons appliqué une correction d’étalon interne dans toutes les analyses futures.

Sélection de phase

Dans les analyses SPME, le carbone à large gamme (CWR) et/ou le divinylbenzène (DVB) sont souvent ajoutés au PDMS pour améliorer la sensibilité, mais cela augmente les coûts. Nous avons cherché à comparer les sondes PDMS uniquement avec les sondes triphasées (DVB/CWR/PDMS), en considérant que l’augmentation du volume de phase de la sonde est susceptible d’améliorer la sensibilité par rapport aux fibres SPME. Les données de récupération des sondes PDMS et triphasées (Figure 3) illustrent des performances globalement similaires entre les deux types de sondes, avec des taux de récupération légèrement plus proches de 100 % avec les sondes PDMS. Ainsi, compte tenu des performances légèrement supérieures et des coûts réduits, nous avons effectué toutes les analyses futures avec des sondes PDMS. Il convient de noter que, puisque la sonde collecte les analytes à partir de l’espace de tête et non par contact direct avec la matrice de l’échantillon, la cinétique de la partition GSM / MIB avec le matériau de phase ne doit pas différer entre les échantillons d’eau et les échantillons de poissons.

Validation de la méthode

Une série d’étalonnages portant sur six concentrations d’analytes dans l’eau de 1 à 100 ng/L a été analysée (figure 4). Une excellente linéarité a été obtenue, avec r² de 0,9999 pour le GSM et de 0,9999 pour le MIB. L’erreur type de régression était de 0,43 et 0,37 pour le GSM et le MIB, respectivement. Cela indique que la méthode est adaptée aux analyses quantitatives sur la plage évaluée. Nous avons déterminé la répétabilité à partir de huit répétitions d’étalons de laboratoire contenant du GSM et du MIB à 40 ng/L dans l’eau. Les valeurs RSD étaient de 6,3 % pour le GSM et de 4,8 % pour le MIB, démontrant une reproductibilité remarquable des résultats. Ces répétitions ont été analysées en trois lots distincts à des jours différents, ce qui démontre encore la précision de la méthode. Par conséquent, l’analyse HCSE avec GC-MS est une méthode quantitative et fiable.

Limites minimales de détection (LDM)

La LDM a été calculée conformément au protocole¹⁴ de l’EPA des États-Unis à l’aide d’échantillons d’eau enrichie (n = 10) ou d’échantillons de poissons enrichis (n = 11). La méthode d’extraction et de détection du GSM et du MIB dans l’eau a produit des limites de détection de 1,2 ng/L pour le GSM et de 1,1 ng/L pour le MIB. Ces LDM étaient bien en deçà des valeurs seuils d’odeur humaine d’environ 10 et 20 ng/L, respectivement. Ainsi, la méthode proposée permet de détecter avec confiance et quantitativement l’accumulation de ces molécules odorantes avant qu’elles n’atteignent les seuils sensoriels humains. Les limites de détection pour l’extraction et la détection du GSM et du MIB dans les poissons ont produit des limites de 18,1 ng/kg pour le GSM et de 13,6 ng/kg pour le MIB.

Analyse d’échantillons d’eau provenant de l’aquaculture

Nous avons analysé des échantillons d’eau prélevés dans sept systèmes d’aquaculture en recirculation, avec cinq répétitions (système 3) ou trois répétitions (tous les autres systèmes) évaluées pour chacun. Tous les systèmes d’aquaculture en recirculation analysés, sauf un, contenaient de la géosmine et du MIB à des concentrations supérieures à notre LDM (figure 5), ce qui indique un problème potentiel de qualité de l’eau. Cependant, nous avons noté que dans tous les cas, la MIB était bien en deçà du seuil d’odeur humaine de 20 ng/L, tandis qu’un seul système dépassait le seuil d’odeur GSM de 10 ng/L (système 1, concentration GSM = 12,69 ng/L). Bien que nous ayons détecté des GSM et des MIB dans le système 3, nous notons que la concentration de MIB est inférieure à nos LDM calculées et, par conséquent, la concentration ne peut pas être quantifiée avec confiance. La méthode a démontré une précision impressionnante dans tous les systèmes, malgré l’utilisation d’échantillons d’eau du monde réel, avec très peu de variation de la concentration calculée entre les échantillons répétés dans chaque système (figure 5).

Analyse de tissus de poissons

Les tissus de poisson, riches en lipides, confèrent un fort effet de matrice qui entrave l’extraction du GSM et du MIB au cours de cette méthode. Pour cette raison, des modifications subtiles sont apportées à la méthode pour augmenter l’efficacité de l’extraction, notamment une température d’incubation plus élevée (80 °C) et un temps d’incubation plus long (20 min) par rapport à la méthode d’extraction à l’eau. Les tissus de poissons ont déjà été analysés pour déterminer les concentrations de fond GSM et MIB. Ces mêmes échantillons ont ensuite été enrichis d’une quantité connue de GSM et de MIB et analysés en trois exemplaires pour déterminer le pourcentage de récupération et la précision (figure 6).

Figure 1 : Effet de la température de désorption de la sonde sur le transfert. (A) Un étalon de laboratoire contenant du GSM et du MIB à 20 ng/L a été analysé à l’une des trois températures de désorption de la sonde en trois exemplaires, avec des aires de pic moyennes. Par la suite, chaque sonde a été désorbée deux fois de plus à la température initiale afin d’évaluer le transfert avec des résultats en (B) (GSM) et (C) (MIB). Le report est exprimé en termes de surface de pic en pourcentage de la surface de pic initiale. Les barres d’erreur représentent l’écart-type sur trois répétitions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Utilisation standard interne. Comparaison des données corrigées et non corrigées pour les étalons analytiques à 15 ou 40 ng/L, avec extraction par sondes PDMS uniquement. Les concentrations de l’échantillon ont été corrigées à l’aide de l’IPMP comme étalon interne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Figure 3 : Récupération de l’analyte. Données de récupération des étalons analytiques GSM (à gauche) et MIB (à droite) à 15 ng/L, avec extraction par sondes PDMS uniquement ou triphasées (PDMS, DVB, CWR). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Courbes d’étalonnage analytiques. Régressions linéaires des courbes d’étalonnage pour GSM (ligne continue, r² de 0,9999 ; S = 0,37) et MIB (ligne pointillée, r² de 0,9999 ; S = 0,37). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Application de l’eau pour l’aquaculture. Concentrations de (A) GSM et (B) MIB dans des échantillons d’eau prélevés dans sept systèmes aquacoles (n ≥ 3 pour chaque système). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 

Figure 6 :  Application de tissus de poisson. Les concentrations de GSM et de MIB dans deux échantillons de poissons ont été enrichies en GSM et en MIB (F1 et F2). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom de la solution	Volume de stock C1 ajouté	Volume total	Concentration résultante
Crosse C1	10ul	100ml	10 μg/ml
Cal 1	10 UL	100 ml	1 ng/L
Cal 2	20 UL	100 ml	2ng/L
Cal 5	50 UL	100 ml	5 ng/L
Cal 10	100 UL	100 ml	10 ng/L
Cal 20	200 UL	100 ml	20 ng/L
Cal 50	500 UL	100 ml	50 ng/L
Cal 100	1000 UL	100 ml	100 ng/L
Cal 200	2000 UL	100ml	200 ng/L

Tableau 1 : Étalons d’étalonnage. Étalons de géosmine et de 2-MIB tous fabriqués à partir d’une solution de CRM47525 de géosmine et de 2-méthylisobornéol (100 μg/mL) dans du méthanol diluée dans une solution mère C1 (10 μg/ml) dans du méthanol.

Analyse	Report ( %)
	GSM	MIB
Parcours GC	0.04	0.08
Désorption du piège	0.09	0
Désorption à l’entrée	0	0
Redésorption de sonde	9.35	3.77

Tableau 2 : Évaluation du transfert de sonde. Transfert après extraction, désorption et analyse GC-MS d’un étalon de laboratoire contenant du GSM et du MIB à 20 ng/L, avec un IPMP d’étalon interne à 30 ng/L. Les descriptions des analyses sont données à la section 2.2.1.

Discussion

Le GSM et le MIB sont des composés de mauvais goût présents dans un large éventail de contextes de surveillance de l’eau, et la demande de capacité de test est élevée. De plus, le GSM et le MIB sont perceptibles par l’homme à l’état de traces. Un système analytique idéal doit donc combiner une sensibilité élevée avec un débit élevé pour produire de grands volumes de données de qualité. Nous avons démontré dans les sections précédentes que l’extraction avec des sondes HCSE offre une sensibilité supérieure à ce qui est requis.

La conception robuste des sondes HCSE empêche toute casse, un problème qui peut interrompre les flux de travail SPME. Après l’optimisation de la méthode, nous n’avons rencontré aucune difficulté de contamination ou de transfert du système, qui sont des problèmes courants avec les méthodologies P et T. Cependant, la plus grande contribution au débit élevé de cette méthode est sans aucun doute venue de la plate-forme d’échantillonneur automatique utilisée. Avec ce système, l’analyse s’est poursuivie 24 heures sur 24, avec une intervention manuelle nécessaire pour fournir les échantillons au plateau d’échantillons uniquement. Cela contraste avec d’autres méthodes d’extraction par sorption de grande capacité, telles que SBSE, qui nécessitent une opération manuelle. Bien que SPME soit généralement entièrement automatisé, le débit est limité dans la mesure où l’incubation de l’échantillon suivant ne peut, généralement, commencer qu’une fois que l’échantillon précédent a été injecté dans la colonne GC. En supposant que le temps de cycle du GC est court, le GC peut donc rester inactif pendant que l’échantillon suivant termine l’extraction. Grâce à notre méthode, plusieurs échantillons peuvent subir simultanément un pré-échantillonnage et une extraction, ce qui minimise les temps d’arrêt du GC. Par conséquent, nous avons pu traiter 1,8 échantillon par heure et par système.

Nous avons démontré des LDM de 1,2 et 1,1 ng/L pour le GSM et le MIB, respectivement, dépassant de loin la sensibilité requise. Bien que d’autres techniques telles que P et T, LLE, SBSE et SPME puissent atteindre des LDM plus faibles dans certaines circonstances¹¹, ces augmentations de sensibilité ont une valeur pratique limitée et ne justifient pas la perte des avantages des sondes HCSE décrits ci-dessus. De plus, certaines de ces techniques nécessitent de grands volumes d’échantillons, ce qui entraîne une augmentation de la production de déchets et des coûts de transport. Pour le LLE, les volumes d’échantillon sont généralement de l’ordre de 200 à 500 mL¹⁵, ^{16, 17}, tandis que pour le SPME, le SBSE et le P et T, les valeurs typiques sont de 10 à 100 mL 18,19,20,21,22. Une excellente reproductibilité a été observée avec des valeurs RSD de 6,34 % et 4,82 % pour le GSM et le MIB, respectivement. Ces valeurs sont globalement similaires à celles trouvées dans d’autres méthodes¹¹ et, en particulier, dépassent les DSR dans les méthodes SPME publiées^23,24. Encore une fois, nos faibles valeurs de RSD ont été obtenues avec des volumes d’échantillon de seulement 5 ml, inférieurs à la grande majorité des techniques d’extraction publiées. Ainsi, nous sommes convaincus que les sondes HCSE offrent une sensibilité et une reproductibilité suffisantes, ainsi qu’un large éventail d’avantages qui combinent les meilleurs aspects de toutes les alternatives de premier plan en une seule méthode simple, entièrement automatisée et durable.

La géosmine et le 2-méthylisobornéol sont des composés lipophiles, ce qui représente un défi pour les scientifiques qui tentent d’extraire ces composés du tissu riche en lipides pour l’analyse. Nous avons donc ajusté nos conditions de pré-échantillonnage, en utilisant une procédure de pré-échantillonnage plus longue et plus chaude, afin de faire passer davantage d’analytes de la matrice d’échantillonnage à l’espace de tête. Après avoir fait ces ajustements, nous avons déterminé que la méthode fonctionnait bien pour analyser le GSM et le MIB dans les tissus des poissons. Il convient de noter que pour les échantillons à très forte teneur en lipides, il peut être nécessaire de réduire la masse de l’échantillon utilisé, par exemple à 0,50 g. Il s’agit d’éviter que les lipides ne forment un joint complet sur le dessus de l’eau qui empêche les analytes d’atteindre l’espace de tête.

Cette méthode utilise les principes d’équilibre pour extraire les analytes de l’espace de tête d’un échantillon. Bien que nous utilisions ici des échantillons d’eau et de poissons provenant de l’aquaculture, nous pensons que la méthode est applicable à l’extraction d’odorants à partir de toute matrice solide ou liquide pouvant être homogénéisée et logée dans un flacon d’échantillonnage de 20 ml. Parmi les exemples d’applications, citons la surveillance des eaux et des sols environnementaux, l’analyse de l’eau potable et l’analyse d’aliments tels que les fruits et légumes, ou la vie aquatique non cultivée à la ferme. Dans l’agriculture, le GSM et le MIB se trouvent souvent dans les sols humides et peuvent donner des saveurs désagréables aux cultures qui y sont^{cultivées 2,} par conséquent, les sols et les cultures pourraient être testés via notre méthode pour surveiller les niveaux d’odorants comme une forme de contrôle de la qualité et / ou pour diagnostiquer la source des plaintes malodorantes. De nombreuses eaux environnementales, telles que les rivières et les lacs, connaissent des pics saisonniers de concentration d’odorants en raison de la prolifération d’algues²⁵, et cette méthode offre un moyen à haut débit et très sensible de surveiller l’étendue de ces pics. Cette méthode convient également à la recherche universitaire, par exemple pour mesurer le taux de production d’odorants par les micro-organismes²⁶ ou pour examiner la relation entre les concentrations d’odorants dans l’eau et dans les tissus animaux²⁷. D’autres groupes de recherche ont utilisé le procédé HCSE pour extraire à partir d’une gamme d’échantillons tels que les boissons alcoolisées²⁸, la viande de mouton²⁹, l’huile d’olive³⁰, les milieux de culture cellulaire humaine³¹ et les pistaches³². Ces études ont ciblé d’autres analytes ou sont des études de profilage non ciblées et n’ont donc pas été optimisées pour l’analyse de la GSM et du MIB, mais sont présentées ici car elles offrent des informations générales sur la préparation de divers types d’échantillons pour l’extraction de sondes HCSE.

Bien que la méthode à l’eau décrite soit susceptible de s’appliquer à tous les échantillons d’eau ou à base d’eau avec une modification minimale, l’application à d’autres échantillons solides ou semi-solides peut nécessiter une modification propre à la matrice de la préparation des échantillons (section 3.1) et de l’extraction des analytes (section 3.2). Bien qu’il ne soit pas possible de couvrir tous les scénarios d’échantillonnage ici, nous vous proposons les considérations suivantes. (1) Les échantillons solides doivent être homogénéisés en une poudre fine par râpage, broyage ou mélange afin d’assurer leur représentativité et de fournir la surface maximale possible pour la sortie des analytes. (2) Les échantillons solides à faible teneur en lipides ne doivent pas nécessiter l’ajout d’eau ou de sel, c’est-à-dire qu’il peut suffire de peser 1,00 g dans un flacon et un bouchon. Cela permettra un transfert plus direct des analytes de l’échantillon vers l’espace de tête, sans transfert intermédiaire de la matrice de l’échantillon à l’eau ajoutée. Cependant, cela réduira l’efficacité de l’agitation. Les analystes doivent effectuer des expériences pour déterminer la technique optimale de préparation d’échantillon pour leur matrice d’échantillons. (3) Différentes matrices auront des affinités différentes pour GSM et MIB. Par conséquent, différentes températures d’incubation seront nécessaires pour atteindre l’équilibre de l’analyte en temps opportun. Cependant, certaines matrices peuvent être chimiquement modifiées par la chaleur, de sorte que des interférences sont produites par des réactions chimiques à haute température. Encore une fois, des expériences sont nécessaires pour déterminer la température d’incubation optimale pour un type d’échantillon particulier (remarque : les échantillons à forte teneur en humidité ne doivent jamais être incubés à plus de 90 °C pour éviter que les flacons ne se brisent sous l’effet de la pression de vapeur de l’eau bouillante).

Nous avons développé des méthodes pour la détection de la géosmine et du 2-méthylisobornéol dans l’eau et les tissus des poissons. Les tests sur les normes de laboratoire confirment que les méthodes sont quantitatives et reproductibles, tandis que l’application à des échantillons du monde réel (eau provenant de systèmes d’aquaculture en recirculation, tissus de poissons dérivés de tels systèmes) démontre des performances même dans le contexte d’échantillons complexes et sales. Bien que nous ayons appliqué nos méthodes à des échantillons d’aquaculture, nous suggérons qu’elles conviennent à la surveillance GSM et MIB dans un large éventail de types d’échantillons, y compris l’eau et les matériaux solides ou semi-solides.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pipette 0.5-10uL	Nichipet Air	A21405581
1000uL pointes de pipette	VWR	76322-154
100-1000uL pipette	eppendorf	285612
100mL flacon en verre	VWR	76008-704
10-100uL pipette	Nichipet Air A20814031
10-100uL pointes de pipette	mega	24502-18
10xL Pointes de pipette	VWR	76322-132
20mL Béchers en verre	VWR	10754-698
2-Isopropyl-3-méthoxypyrazine	TCI	I0577	Étalon interne
40 ml Ambre type-1 (Borosilicate) Flacon en verre	Entreprise d’échantillonnage environnemental	0040-0400-QC	Flacon d’échantillonnage d’eau
5mL Pointe de pipette	VistaLab technologies	4058-5102
Balance	VWR	VWR-124B2
Centri 360	Markes	U-CENTRI-1691	Échantillonneur
automatique Chromeleon Version 7.3	Thermo Scientific		GC-MS Logiciel Piège
focalisation	Markes	U-T12ME-2S
Chromatographe en phase gazeuse, Trace 1310	Thermo Scientific	14800403
Colonne GC	Thermo Scientific	26098-1420	TG-5MS
Solution de géosmine et de 2-méthylisobornéol	SIGMA-ALDRICH ou MilliporeSigma	CRM47525
Flacon d’espace de tête, 20 mL	Markes	C-VCC20
Poignée HiSorb	Markes	C-HH-6
Bouchon d’injecteur HiSorb	Markes	C-HSPCCS
HiSorb doublure d’injecteur	Markes	U-LINER-HISORB
Sonde HiSorb, PDMS, version courte	Markes	H1-XXABC
Bouchons de flacons HiSorb	Markes	C-HSPCCS
Laboratoire pelle
Spectromètre de masse, ISQ 7000	Thermo Scientific	ISQ7K-NOVPI
Méthanol	Produits chimiques VWR	BDH1135-4LP
Méthanol, Optima LC-MS grade	Fisher-scientific	A456-4
Joints toriques taille 201	Markes	U-COV201	Pour capuchon d’injecteur HiSorb et stockage HiSorb
Pipette automatique Ovation (100-5000uL)	Technologies VistaLab	213626
Gants d’examen sans poudre Purple Nitrile-Xtra	Kimtech	50602-54
Chlorure de sodium ( sel)	Produits chimiques VWR	BDH9286-2.5K
Adaptateur de commutation (pipeteur automatique)	CUI INC	SMI10-5
Outil de sertissage de flacons	Markes	U-HSVCR
Décapsuleur de flacons	Markes	U-HSVDC
Bateaux de pesage	Grainger	8AG69