Summary
Biz yeni bir agaroz jel tabanlı mikroakışkan cihaz kullanarak nöral kök hücreler (NSC'lerde) motilite epidermal büyüme faktörü reseptörleri (EGFR) aşırı ifade artırdığını göstermektedir. Bu teknoloji, insan sinir kök hücreleri gibi hücre kaynakları kıt olan diğer memeli hücre sistemleri, kolayca adapte olabilir ve zaman etrafında dönüş kritik öneme sahiptir.
Abstract
Mikroakışkan teknolojisi makromoleküler deneyleri için yeni bir olgunluk seviyesine ulaşırken, hücre tabanlı deneyleri, hala bir bebek evre 1 . Bu bir hücre uyumlu ve istikrarlı bir mikroçevresinin geleneksel imalat teknikleri ve malzemeleri kullanarak oluşturabilirsiniz zorluk büyük ölçüde. Mikroakışkan cihaz için temel malzemesi olarak, bir roman mikroimalat malzeme, agaroz jel giriş ile bu sorunu çözmek. Agaroz jel, hücre tabanlı deneyleri için ideal bir malzemedir bu nedenle son derece uysal ve gaz geçirgen ve hücrenin hayatta kalabilmesi için gerekli besin ve. Agaroz jel tabanlı cihazlar bakteriyel ve nötrofil hücre göçü 2 okuyan başarılı olduğunu daha önce göstermiştir. Bu raporda, üç paralel mikroakışkan kanalları hakkında 1mm kalınlığında bir agaroz jel membran desenli. Medya / tampon Sabit akımları peristaltik bir pompa kullanarak her iki yan kanallar tutulur. Hücreler için gözlem merkezi kanal tutulur. Yan kanallar besin ve kimyasal madde yandan merkezi kanal, merkezi kanal kimyasal ortamı sürekli difüzyon olduğundan, yan kanallar boyunca akışını kolayca üzerinden kontrol edilir. Bu cihazı kullanırken, biz nöral kök hücre hareketi ile optik çeşitli kimyasal şartlar altında kolay takip edilebilir göstermek ve deney sonuçları, epidermal büyüme faktörü reseptörleri (EGFR) aşırı ifade, sinir kök hücrelerin motilite artırdığını göstermektedir. Nöral kök hücrelerin Motilite, böylece tümörojenik faktörü 3 hücreleri saldırganlık değerlendirmek için önemli bir biyomarker. MGK motilite altında yatan mekanizma Deşifre her iki nöral gelişim bozuklukları ve beyin kanseri kök hücre invazyonu içine içine fikir verecektir.
Protocol
Prosedür
Fibronektin ile slaytları Kaplama
Mikroakışkan cihaz montajı için, önce cam slaytlar fibronektin ile sterilize edin. Coat bir biohood slaytlar kısırlık korumak için. Steril bir PDMS ayırıcı slayt kenarları boyunca hizalayın ve kalıcı bir belirteç ile karşı karşıya yan işareti. Pipet cam slayt bütünlüğü üzerinde PDMS ayırıcı içinde fibronektin bir 5 mg / ml solüsyon (Sigma) 1 ml. Bir saat boyunca rahatsız slaytlar bırakın, daha sonra tamamen bir N 2 tabancası kullanarak kurutun. Slaytlar, daha sonraki deneyler için 4 o C'de saklanabilir.
Cihazın montajı
Tüm cihaz montaj protokolü aşağıdaki yordamları kullanarak, steril koşullar altında biohood yapılır:
- % 70 etanol ile aşağı silme ve N 2 tabanca ile kurutma desenli mikro silikon ana temizleyin. Steril bir PDMS ayırıcı ana kabartma özellikleri çevresinde forseps kullanılarak 1 mm yüksekliğe yerleştirin.
- Agaroz toz 0.3 g (Fisher Scientific) ve 10 ml CO ağırlığındaki cihaz kullanılan agaroz jel hazırlayın 2 50 ml beher bağımsız medya (Invitrogen). YÜKSEK 20 saniyelik bir mikrodalga ısı ve spatula ile karışımı karıştırınız. Çözünmemiş granül varsa, başka bir 10 saniye ve girdap kalan son granül kurtulmak için sıcak karışım karışım ısı. 8 saniyelik bir ısıtma süresi ile bu işlemi tekrarlayın ve sonra 5 saniye.
- Agaroz çözümü hızla PDMS ayırıcı çevrili silikon ana üzerine dökün ve hemen steril bir cam slayt agaroz karışımı kapsayacak. Sağlamak için yaklaşık 2 dakika için slayt bir sabit, hafif basınç uygulayın agaroz jel PDMS ayırıcı olarak aynı sabit 1 mm yükseklik.
- Agaroz jeller sonra, desenli agaroz jel silikon master ve slayt karşı karşıya agaroz jel mikro fibronektin kaplı cam slayt transfer PDMS ayırıcı ile soyulabilir. Rezervuar bölgeye giriş ve çıkış kere mikro delikler 16 gauge enjektör ucu kullanın. 500 ul CO 2 bağımsız medya, mikro kuruma önlemek için slayt desenli agaroz jel ekleyin .
- Cihazda kullanılan akrilik manifoldu% 70 etanol ile yıkayın ve DI su ile durulayın. Agaroz jel içine mikro delikli delikli manifoldu deliklerini. Daha sonra, jel, PDMS ayırıcı ve cihazın metal çerçeve ile fibronektin slayt manifoldu hizalayın. Cihazın içine, vidalarını yerleştirin ve bir tornavida ile direnç noktasına sıkın. Bu cihaz, deforme agaroz mikro ölçüde fazla sıkılmazsa olduğunu sağlamak için yapılır. Cihazın içinde jel kayma olmadığından emin olmak için bir saat sipariş vidalarını sıkın. 1ml bir şırınga yardımıyla mikro sızıntı ve tıkanıklıkları için cihaz test edin. CO 2-bağımsız medya mikro enjekte etmek için şırınga, boru sonunda bir jel yükleme pipet ile Tygon boru ile donatılmıştır . Bir Mikrokanallı medya, medya ilgili girişine enjekte edildiğinde sadece Mikrokanallı çıkış çıkmak için görülmektedir başarıyla oluşmuş sayılır. Şimdi, cihaz kullanıma hazırdır.
Cihaz hücrelerin hazırlanması ve Yayımlamak
Hücreleri (hücre yoğunluğu yaklaşık 100.000 hücre / ml)% 70 confluency ulaştığında, cihazın içine numaralı seribaşı olarak hazırlanır.
Hücrelerin iki DPBS Konu (Invitrogen) yıkar. Hücreleri ayırmak için tripsin-EDTA (Invitrogen) 200 ul ekleyin. Hücreler, tripsin inaktive içeren serum M2 medya 5ml içeren 15 ml santrifüj tüpüne aktarın. 5 dakika için 1000 RPM hücrelerin büyüme ortamı Santrifüj. Süpernatantı kapalı aspire ve hücre pelet DPBS 5 ml tekrar süspansiyon haline getirin. Aynı koşullar altında tekrar DPBS hücreleri santrifüjleyin. Süpernatant tekrar kapalı aspire ve 500 ul CO 2 bağımsız medya hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.
Yerçekimine bağlı akış ile cihazın Mikrokanallı merkezi haline Tohum hücrelerinin süspansiyon. Sırasıyla, hücre süspansiyonu 60 ul ve CO 2 bağımsız orta 20 ul Mikrokanallı merkezinin giriş ve çıkış ekleyin. Hücre adezyon bakmak için bir aydınlık alan mikroskobu altında Mikrokanallı merkezi uyun. Hücreler genellikle 10 dakika sonra yapışır. Hücreleri, uygun bir yoğunlukta kanal alt bağlı kalan hücre süspansiyonu giriş ve çıkışında medya pipeted. Merkezi kanal giriş ve çıkış hem de CO Yeri 60 ul 2-bağımsız medya. Yeri PDMS th üzerinde kapsare merkezine giriş ve çıkış medya merkezi kanal buharlaşmasını en aza indirmek için.
Görüntüleme cihaz hücreleri
Önce cihazın montajı, mikroskop (Olympus X81) üzerinden hava istasyonu, steril peristaltik boru iplik ve peristaltik pompa (Watson-Marlow 205U/CA) ile bağlanmak. PBS 4 RPM hızında boru ile yıkayın. Cihazın montajı sonra, 15 ml santrifüj tüplerine CO 2 bağımsız medya epidermal büyüme faktörü (EGF) (Sigma) çözümleri, uygun konsantrasyonda hazırlar . Vortex EGF çözümleri ve 5 saniye boyunca tüp bağlanabilir. Cihaza karşılık gelen EGF konsantrasyonları ile işaretlenmiş borulama bağlayın. EGF kanal sırt çapında yaygın ve istikrarlı bir kimyasal degrade kurmak için yaklaşık bir saat sürer.
Bir görüntüleme yazılımı, Slidebook, deneysel bir dönemde yaklaşık 5 saat boyunca her 10 dakikada bir dizi görüntü almak için kullanılır. Xy otomatik sahne programlanmış Aynı merkez kanal ve üç merkezi kanallarının toplam iki alt-alanlar (400μm x400μm bir alana sahip her) belirli bir zaman noktasında görüntülü böyle. Farklı merkezi kanalları (genellikle 3 bir vadede) hücreler, tüp üzerinde işaretli farklı EGF konsantrasyonları var.
Malzemeleri ve Ekipmanları
Postnatal fare beyincik 6, 7 dış germinal tabakadan elde edilen hücre hatları: C17.2 hücreleri NSC'lerde . Bu hücre hattı kullanarak, retrovirüs transfeksiyon yöntemi kullanarak diğer iki fare kök hücre hatları geliştirdik. Bu iki stably transfekte hücre hatları (1) wtEGFR - insan vahşi tip EGFR aşırı ifade ettiğini ve (2) ΔEGFR - yapısal olarak aktif EGFR mutant. Algılama kolaylığı için, retrovirüsler ribozomal bağlanma (IRES) ve Yeşil floresan proteini (GFP) için dahili bir site tarafından takip çıkarlarını gen ile bir omurga taşır.
Hücre kültürü: fare C17.2 NSC'lerde ve bunların varyantları M2 medyada 6 plaka (% 10 fetal sığır serumu (FBS) (Invitrogen),% 5 at serumu (HS) (Invitrogen DMEM (Invitrogen) yetiştirilen ) ve% 1 penisilin / streptomisin (Invitrogen).) Hücreler% 80 hava ve% 5 CO 2, 37 ° C'de tutuldu .
Mikroakışkan cihaz: Bir plastik manifoldu, PDMS ayırıcı, ve paslanmaz cihazı yerinde tutmak için bir çerçeve.
Görüntüleme
Ters bir floresan mikroskobu (Olympus IX-81) yoğun bir CCD kamera (Orca, Hamamatsu) ile bağlantılı olarak kullanılır. Mikroakışkan cihaz otomatik bir xyz sahne üzerine monte edilmiştir ve sahne 37 o C lik bir sıcaklık koruyan bir çevre odası tarafından içine Genellikle otomatik xyz sahne kullanarak aynı zamanda noktada filme olacak aynı çip üzerinde 3-4 cihazlar vardır.
Korumak Akış
8 paralel çizgiler (Watson-Marlow 205U/CA) otomatik bir peristaltik pompa, lavabo ve kaynak kanallarının tüm akışını korumak için kullanılır.
Şekil Üç MGK suşlarının çeşitli EGF konsantrasyonlarda 1 Motilite (ebeveyn, wtEGFR ve D EGFR) yörüngeleri 5 saat film izleme (wtEGF 100ng/ml, 4hour hariç) alınan ve tüm parçaları kökeni. karşılaştırma amacı için (0,0) repositioned.
Şekil EGFR ekspresyon seviyesi ve motilite (a) iki görüntü wtEGF NSC'lerde 100ng/ml EGF ile mikroakışkan kanal yüzeyinde 2 Korelasyon. Sol görüntü floresan görüntü ve doğru iletilen bir aydınlık alana görüntü. Ölçekleme çubuğu 100μm ve Kanal genişliği 400 mm. Hücreler ifade GFP parlaklık iki popülasyonun ayrılır. Hücreler mavi daireler sönük, böylece daha az EGFR ekspresyon seviyesi var ve kırmızı daireler hücrelerin brigher, böylece daha yüksek EGFR ekspresyon seviyesi var. (B) düşük ve yüksek EGFR ekspresyon seviyesi ile hücreler Yörüngeler. Bu yörüngeleri dört saat süren bir film alınmıştır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şekil 1 üç MGK suşları, ebeveyn hücreler, wtEGFR ve ΔEGFR (kontrol) yörüngeleri gösterir. Yörüngeleri Her set 5 saat uzunluğunda bir film elde edildi. EGF konsantrasyonu ~ 10 ng ebeveyn hücreler için, hücre motilitesi doruğa ulaştı; wtEGFR hücrelerin, hücre motilite zirve 100ng/ml veya üzeri kaymıştır; beklendiği gibi ΔEGFR hücrelerin, hücre motilite EGF konsantrasyon bağımsız oldu.
100ng/ml wtEGF hücreleri en hareketli hücreler, yaklaşık 1,5 kat, 10 ng ile ebeveyn hücrelerden daha hızlı taşındı. (1) EGFR ekspresyonu üzerinde hücre motilitesini artırır olduğunu gösterir; (2) EGF ligand-reseptör biding olayların sayısı, hücre hareketi üzerinde doğrudan bir etkisi vardır. ΔEGFR hücre hattı, yapısal olarak aktif EGFR mutant. Bu mutant insan glioblastoma ~% 60 görünür. Bu kurucu aktif bir ligand bağımsız kinaz olur kesilmiş bir ekstrasellüler etki alanı vardır. Otofosforilasyon yoğunluğu yabani tip EGFR (wtEGFR) 4 aktive ligand ile karşılaştırıldığında küçük (yaklaşık% 10). Bu temelini gözlem ΔEGF hücreleri ebeveyn ve wtEGFR (AGF yokluğunda) biraz daha yüksek motilite var, ama motilitesi çeşitli EGF konsantrasyonlarda sabit tutulur.
WtEGFR hücreleri GFP (yeşil floresan protein) ve EGFR aynı kopya yapılan bu yana, wtEGFR hücrelerin floresan yoğunluğu EGFR ekspresyon düzeyleri ortaya koymaktadır. Bu bizi doğrudan hücre hareketi ile EGFR protein ekspresyon seviyesi (yeşil floresan yoğunluğu) korelasyon sağlar. Şekil Ve mavi daire içinde hücreler yemek böylece alt EGFR ekspresyon seviyesi, 2 iki hücre popülasyonunun yörüngeleri, kırmızı daire içinde hücreler bu nedenle daha yüksek EGFR ekspresyon seviyesi, daha parlak gösterir. Sonuç yine yüksek EGFR ekspresyon seviyesi, bu hücreler daha hareketli olduğunu göstermektedir.
Geleneksel olarak, NSC'lerde, motilite bir zarından göç hücrelerinin yüzde 5 değerlendirilir Boyden çemberinin testi kullanılarak tespit edilmiştir. Bu nüfus tabanlı bir tahlil, hücre davranış bireysel olarak değerlendirilmesi mümkün değildir. Burada gösterilen mikroakışkan cihaz, bir tek hücre düzeyinde hücre hareketini incelemek için bir fırsat sunar ve iyi kontrollü bir kimyasal ortamda. Canlı hücreler NSC'lerde motilite fenotip ile EGFR protein ekspresyon seviyesi doğrudan ilişkili, ilk kez, bir sağlar. Cihazın küçük boyutlu, insan kök hücreleri gibi hücrelerin kaynakları sınırlı deneyler, için özellikle yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, New York Eyaleti Office Bilim, Teknoloji ve Akademik Araştırma (NYSTAR) (form, İleri Teknoloji hibe Merkezi), ve Nanobiyoteknoloji Merkezi (NBTC) Ulusal bir STC Programı hibeleri ile desteklenen Anlaşması No ECS-9876771 altında Bilim Vakfı ve Amerikan Beyin Tümörü Derneği ve New York Tıp Akademisi (JAB).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
