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Article de méthode

Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact

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DOI :

10.3791/67701

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25 juillet 2025

 ,  , 
1Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons des détails sur la réalisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact comme technique supplémentaire pour évaluer la fonction pancréatique endocrine avec réduction des facteurs de confusion possibles.

Résumé

Les méthodes actuelles de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) chez les rongeurs impliquent la périfusion ex vivo ou l’incubation statique d’îlots pancréatiques et de coupes pancréatiques. La perfusion ex vivo et l’incubation statique permettent de prélever plusieurs échantillons rapidement et efficacement. Cependant, ces procédures soumettent les îlots à des traumatismes, à une hypoxie intermittente et à une réduction de la signalisation de l’insuline paracrine, qui peuvent toutes affecter le GSIS. Ces effets négatifs peuvent être minimisés par perfusion à travers le système vasculaire de la souris avec un pancréas intact, ce qui fournit une autre méthode de comparaison pour les différents modèles GSIS. L’épine dorsale de cette procédure de perfusion impliquait i) la ligature des vaisseaux pour isoler le pancréas et ii) la canulation du système vasculaire pancréatique. Ce modèle impliquait sept points de ligature et deux canulations. Le système vasculaire perfusé qui en résultait comprenait l’aorte abdominale inférieure, l’artère cœliaque et l’artère mésentérique supérieure, les affluents ramifiés et la veine porte.

Le perfusat a été introduit dans le système vasculaire à ~2 mL/min par une pompe péristaltique jusqu’à la tubulure PE-50 qui canule l’aorte abdominale inférieure. Les perfusats ont traversé le système vasculaire isolé et ont été collectés par la veine porte via une canulation avec un tube PE-30. Le perfusate a été prélevé sur des intervalles de 3 minutes en séries de 30 minutes pour chaque solution de perfusate de 2,6 mM de glucose, 16,8 mM de glucose et 2,6 mM de glucose avec 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) dans un tampon de bicarbonate de Krebs-Ringer (KRB, 16 mM HEPES et 0,1 % de BSA, pH 7,4). La solution IBMX a été précédée d’une solution normale de glucose de 2,6 mM comme cycle de lavage. Le temps total était de ~1 h pour l’intervention chirurgicale et de 2 h pour le prélèvement du perfusat. Les perfusats ont été congelés jusqu’à ce qu’un test ELISA soit effectué pour mesurer la sécrétion d’insuline.

Cette liste de méthodes espère fournir une base procédurale détaillée pour la mesure de la sécrétion d’insuline par perfusion pancréatique à travers le système vasculaire, ce qui permettra aux chercheurs d’effectuer avec succès la perfusion pancréatique intacte dans leurs laboratoires.

Introduction

La quantification et la compréhension de la fonction des cellules bêta ont été principalement réalisées par le biais de la périfusion ex vivo, de l’incubation statique et, plus récemment, des coupes pancréatiques. Bien que ces procédures permettent d’évaluer les îlots isolés, les deux premières peuvent soumettre les îlots à des facteurs de stress qui ont une incidence sur leur capacité à fonctionner. Dans une étude menée par Rosenberg et al., des îlots canins isolés à l’aide de méthodes standard ont montré une augmentation de l’apoptose des cellules bêta, ce qui a été mis en évidence par la perte de la membrane basale, l’apparition de noyaux pycnotiques et de corps apoptotiques1. Cette étude coïncide avec un autre rapport sur l’isolement des îlots pancréatiques humains où des changements morphologiques décrivant l’apoptose ont été mis en évidence peu de temps après l’isolement des îlotspancréatiques 2,3. L’augmentation de l’apoptose des cellules bêta a entraîné une réduction de la libération d’insuline de ces îlots, ce qui soutient le concept selon lequel l’isolement des îlots les prédispose aux dommages et aux déficiences fonctionnelles.

En plus de l’apoptose, le système vasculaire est perdu avec l’isolement des îlots, ce qui entraîne une altération du transport des nutriments, des métabolites et des hormones 4,5. Cette limitation a conduit à des alternatives telles que la transplantation des cellules des îlots dans l’œil pour maintenir une certaine forme de système vasculaire et d’innervation6. Le changement d’architecture vasculaire lors de l’isolement des îlots crée également un îlot plus compact, différent de ce qui est attendu in vivo 7,8.

Pour ajouter aux différences anatomiques, le comportement des îlots incubés statiquement diffère de celui du pancréas perfusé isolé. Pour les îlots incubés statiquement à faible taux de glucose, 77 % de l’insuline totale libérée (3,31 ng sur un total de 4,34 ng) semblait être présente dans les 30 premières minutes et peu dans la période suivante. Cela contraste fortement avec le pancréas perfusé isolé à de faibles concentrations de glucose, où il y avait pratiquement aucune libération d’insuline à tous les points temporels (<1,8 ng au total)9. Bien que des recherches supplémentaires doivent être menées pour élucider pleinement cette différence à de faibles concentrations de glucose, cette différence dans les données peut représenter une fuite de cellules mourantes hypoxiques, qui a été examinée plus en détail par incubation statique de monocouches de cellules d’îlots. Néanmoins, ces dissemblances entre les méthodes actuelles et les environnements in vivo peuvent entraîner une altération de la validité externe (tableau 1).

En plus de provoquer une hypoxie, la périfusion ex vivo et l’incubation statique impliquent la culture et la séparation des îlots du pancréas dans des boîtes de culture tissulaire pour les maintenir dans un état suspendu. Au cours de ce processus, la collagénase est généralement perfusée à travers le canal pancréatique pour permettre la dissociation du tissu pancréatique. La collagénase se lie aux fibrilles de collagène et les démêle à l’aide de protéases neutres, de gélatinases et de protéases pancréatiques endogènes. Ensemble, ces protéases continuent à digérer jusqu’à ce que les îlots soient libérés de leur matrice extracellulaire et de leurs attaches de cellules acineuses. L’équilibrage de ce mélange de protéases donne des résultats variables à la fois dans la pureté et la fonctionnalité des îlots isolés10. L’efficacité de la collagénase dépend également des caractéristiques animales telles que la souche, l’âge, le poids et le statut diabétique. L’utilisation de ces protéases en conjonction avec des traits spécifiques à l’animal peut endommager les îlots pancréatiques pendant le processus d’isolement. Lors de l’administration de collagénase, ces protéases activent également des enzymes protéolytiques pancréatiques endogènes qui facilitent la digestion de la membrane basale. Cependant, le contrôle de l’activation endogène de l’enzyme pancréatique n’est pas encore possible ; Ainsi, cela peut jouer un rôle dans les dommages causés aux îlots de Langerhans pendant le processus de culture 11,12,13. Un rapport d’Edmonton a montré que l’activité de la protéase endogène influe sur le rendement d’isolement des îlots de Langerhans une fois qu’elle a atteint un niveau d’activité enzymatique suffisant pour l’isolement14,15.

Il a été démontré que les techniques actuelles d’infusion de collagénase (intraductale) pénètrent également à l’intérieur des îlots, ce qui peut entraîner une fragmentation des îlots et, par conséquent, de faibles rendements16. Dans une étude menée par Balamurugan et al., on a constaté que la collagénase se localisait dans les îlots et le tissu acineux du pancréas de souris perfusé, entraînant une inflammation intense et l’activation des voies apoptotiques17. Les îlots qui ont survécu à la phase d’isolement ont également montré une capacité réduite à libérer de l’insuline.

De plus, d’autres facteurs tels que le stress mécanique pendant la préparation des îlots et la nécrose induite par l’hypoxie pendant la culture jouent tous un rôle dans le fonctionnement des îlots18. Ces traits peuvent influencer la viabilité de l’îlot lors de l’isolement du pancréas et, par conséquent, la fonction qui en résulte.

Outre l’isolement et l’évaluation des îlots par périfusion ex vivo et incubation statique, les îlots dans des tranches pancréatiques vivantes sont une autre méthode ex vivo utilisée pour mesurer les réponses des cellules endocrines19. Dans ce système, le stress chimique des procédures d’isolement des îlots est évité. De plus, le microenvironnement des îlots reste intact, ce qui permet d’étudier la physiologie des îlots plus près de son état in vivo 20. À l’instar de la périfusion ex vivo et de l’incubation statique, il s’agit d’une méthode qui continuera à jouer un rôle important dans l’acquisition de connaissances sur le pancréas. Cependant, certaines limitations incluent le stress mécanique lors de la génération des tranches, ainsi que l’absence d’une vue holistique globale d’un pancréas intact pour la pathologie et la physiologie. La tranche représente une région particulière du pancréas, ce qui diminue sa généralisabilité en raison de la diminution de la taille de l’échantillon et de la vue limitée21.

Cet isolement des îlots et d’autres méthodes s’accompagnent de divers points de stress qui peuvent être imposés sur les îlots. Le stress mécanique, l’hypoxie, la suractivité de la protéase et la vue limitée jouent tous un rôle dans le rendement des îlots de Langerhans et la validité externe globale. Ces facteurs peuvent être réduits par la perfusion du pancréas via le système vasculaire de la souris, ce qui minimise tous les facteurs de stress ci-dessus tout en permettant d’examiner les effets d’autres sécrétagogues et agents pharmacologiques présents dans le corps en raison du maintien de l’intégrité cellulaire22. Des études antérieures ont montré l’impact du flux sanguin des îlots sur les niveaux d’insuline plasmatique23 ; À leur tour, les molécules vasoactives comme les peptides d’angiotensine et les agonistes sympathiques, qui modifient le flux sanguin des îlots, modifieraient la fonction des îlots et la libération d’insuline24,25. La perfusion pancréatique permettrait d’évaluer plus en détail comment ces molécules et d’autres molécules différentes peuvent affecter la réponse des cellules endocrines. Ce système espère permettre une plus grande avancée conceptuelle dans notre compréhension de la biologie du pancréas endocrinien en présence d’une diaphonie dans son microenvironnement naturel avec une vascularisation et une innervation intactes. De plus, la perfusion du pancréas intact dans ce protocole permet d’isoler l’organe, réduisant ainsi les facteurs de confusion potentiels d’autres organes comme le foie, qui élimine l’insuline de la circulation, par rapport à la perfusion de la souris entière. La perfusion de la souris entière permettrait de réduire la technique chirurgicale ; Cependant, il faudrait toujours recueillir le perfusat à travers un vaisseau après le pancréas et avant d’atteindre le foie - probablement la veine porte. La collecte de la veine porte continuerait à nécessiter une canulation. Bien que la perfusion entière de souris offre l’avantage de réduire les étapes chirurgicales, il y aurait des limites en raison des facteurs de confusion créés par des organes comme les reins et les poumons produisant des peptides d’angiotensine. Cependant, il s’agirait d’une approche novatrice qui pourrait s’avérer utile lors de l’examen des effets des molécules vasoactives produites à partir d’autres organes sur les îlots pancréatiques, ce qui est la priorité absolue.

La perfusion pancréatique entière a été réalisée avec succès dans le passé par d’autres 7,22,26. Dans ce protocole mis à jour, l’utilisation de souris pose un défi technique accru en raison de leur anatomie plus petite que celle des rats. Cependant, cette procédure démontre avec succès la faisabilité de ce protocole en mettant en évidence un profil de sécrétion d’insuline bien caractérisé à partir du pancréas intact de 3 souris indépendantes.

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Protocole

Toutes les recherches effectuées sur des rongeurs sont conformes aux directives du Centre de recherche sur le diabète Joslin (numéro d’approbation 22-01).

1. Début

  1. Administrer l’anesthésie.
    1. Injecter à jeun un mélange de kétamine/xylazine (~75 mg/kg de mélange de chlorhydrate de kétamine/kg de kétamine (~75 mg/kg de mélange de HCl de kétamine) administré par voie intramusculaire à travers l’une des cuisses postérieures à l’aide d’une aiguille de 28 G pour l’euthanasie.
      REMARQUE : L’utilisation de souris normoglycémiques et à jeun est importante pour réduire les effets de la kétamine ; Cependant, un anesthésique peut être substitué.
    2. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée en pinçant le pied postérieur avec une pince pour vérifier s’il n’y a pas de réflexe.
      REMARQUE : Le manque de réflexe est dénoté par l’absence de mouvement de la jambe pincée.
    3. Administrer une pommade ophtalmique stérile aux yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie et prévenir les ulcères cornéens.
  2. Sécurisez le sujet.
    1. Assurez-vous que la souris est bien fixée et qu’elle restera en place pendant la procédure, que cette expérience se termine grâce à des aimants attachés à des élastiques qui se connectent aux membres avec les aimants attachés à un tableau magnétique.
  3. Nettoyez le site de l’incision.
    1. Assurez-vous que la souris est pulvérisée avec de l’éthanol à 70 % pour éviter la contamination par les poils de la souris,
      REMARQUE : Le rasage de la souris permettrait de réduire les risques de contamination par la fourrure.
  4. Effectuez l’incision.
    1. À l’aide d’une pince ou d’une pince à épiler, pincez à 2-3 cm de l’anus et coupez vers le haut tout en perçant le péritoine avec des ciseaux incurvés.
    2. Créez une incision diagonale de la ligne médiane aux côtes et à la partie latérale de la souris.
    3. Créez une incision identique du côté opposé.
      REMARQUE : L’objectif est de créer une vue adéquate de la cavité abdominale près du rectum jusqu’au diaphragme

2. Ligature

  1. Lister l’artère gastrique.
    1. Déplacez les intestins vers la droite de l’animal à l’aide d’une pince ou d’un doigt émoussé. Soulevez l’estomac pour localiser l’artère et la veine gastriques.
      REMARQUE : L’artère et la veine gastriques ont été identifiées par la visualisation des vaisseaux allant de la partie inférieure de l’œsophage à la partie supérieure de l’estomac.
    2. Prenez une suture 7-0 (sans aiguille) et placez-la sous l’artère gastrique à l’aide d’une pince émoussée en préparation de la ligature.
    3. Créez un nœud de chirurgien et assurez-vous d’une ligature adéquate via un nœud ferme.
      REMARQUE : Le type de nœud n’est pas important ; La prévention du flux sanguin peut être déterminée par un changement de couleur de l’organe ligaturé vers une apparence plus pâle ou l’ablation de l’organe et la surveillance de l’expulsion du sang à partir du point de ligature. La ligature de l’artère gastrique garantit l’absence d’influence du contenu gastrique. Cela réduit également les fuites vers les vaisseaux gastriques et dirige le perfusat vers l’artère cœliaque.
  2. Ligate les vaisseaux rénaux gauches.
    1. Répétez les étapes 2.1.1 à 2.1.3 pour les vaisseaux rénaux gauches.
      1. Identifiez les vaisseaux rénaux gauches en visualisant les vaisseaux rouge vif et violet foncé qui se connectent au rein gauche. Cette étape empêche les fuites vers les vaisseaux rénaux et redirige le perfusat vers l’artère cœliaque.
  3. Lister l’aorte abdominale supérieure.
    1. Répétez les étapes 2.1.1 à 2.1.3.
      1. Identifiez l’aorte abdominale supérieure en visualisant la ligne médiane du vaisseau rouge vif avec les vaisseaux ramifiés de l’artère cœliaque, de l’artère mésentérique supérieure et des vaisseaux rénaux gauches. Effectuez une ligature supérieure à l’artère cœliaque pour réduire les fuites par l’aorte abdominale supérieure et assurer l’écoulement vers l’artère cœliaque et, éventuellement, le pancréas.
  4. Ligature des vaisseaux rénaux droits.
    1. Déplacez les intestins vers la gauche de l’animal. Pincez le tissu/la graisse entourant le rein droit comme levier pour identifier les bons vaisseaux rénaux.
    2. Répétez les étapes 2.1.1 à 2.1.3.
      1. Identifiez les vaisseaux rénaux droits en visualisant les vaisseaux violets/rouge foncé (les deux veines rénales droites avec une artère située en dessous qui n’est pas visible) reliés au rein droit avec connexion à la fois à la veine cave inférieure et à l’aorte abdominale. Cette étape est parallèle à l’étape 2.2 avec les vaisseaux rénaux gauches, ce qui permet d’isoler davantage le pancréas ; Cependant, méfiez-vous de la proximité de ce vaisseau avec la veine cave inférieure.
  5. Lister la partie abdominale de la veine cave inférieure.
    1. Identifiez la partie abdominale de la veine cave inférieure en visualisant un vaisseau violet plus grand avec une connexion ramifiée à la veine rénale droite.
    2. Répétez les étapes 2.1.1 à 2.1.3.
      REMARQUE : Cette étape réduit les facteurs de confusion potentiels du sang passant à la veine porte, où le perfusat sera recueilli.
  6. Lister l’aorte abdominale inférieure, avant la bifurcation (Figure 1)
    1. Répétez les étapes 2.1.1 à 2.1.3.
    2. Après la ligature juste avant la bifurcation, placez un fil de suture sous l’aorte à environ 0,5 cm au-dessus du premier nœud. Utilisez ce fil de suture pour attacher la canulation en place.
    3. Utilisez l’espace entre le fil de suture et la suture ligaturée pour insérer le tube pour la canulation. Cette ligature assure que le perfusat remonte à travers l’aorte abdominale inférieure vers l’artère cœliaque.
  7. Lister la veine porte (Figure 2)
    1. Déplacez les intestins vers la gauche de l’animal pour permettre une bonne visualisation de la veine porte.
    2. Créez une incision dans le diaphragme et les côtes pour créer plus d’espace, au besoin, pour voir la veine porte et pour une traction appropriée pour la ligature et la canulation.
    3. Lissez le vaisseau aussi haut que possible (plus près du foie) pour assurer de l’espace pour la canulation ultérieure.
    4. Placez une seconde suture inférieure à la première mais au-dessus du pancréas. L’étape 2.7.2 fera disparaître le sujet. De plus, cette étape est importante pour permettre la collecte du perfusat et prévenir un reflux potentiel supérieur au point de canulation.

3. Canulation

  1. Canuler l’aorte abdominale inférieure.
    1. Créez une incision de 0,5 à 1,5 mm avec des ciseaux dans l’aorte abdominale inférieure entre le nœud inférieur et la suture supérieure.
    2. En utilisant le nœud le plus bas comme levier, insérez le tube dans l’aorte via l’entaille jusqu’à ce qu’il atteigne la suture la plus supérieure ; Veillez à ne pas les déchirer.
    3. Faites un nœud avec la suture la plus supérieure pour verrouiller le tube en place.
      REMARQUE : Cette étape permet au perfusat de pénétrer dans le système fermé. Une fois les ligatures en place, le perfusat doit se déplacer du point d’entrée dans l’aorte abdominale inférieure jusqu’à l’artère cœliaque, puis les vaisseaux pancréatiques, pour finir par la veine porte hépatique où le perfusat peut être recueilli.
  2. Canuler la veine porte.
    1. Créez une incision de 0,5 à 1 mm dans la veine porte juste après que la veine porte quitte le pancréas.
    2. En tenant le nœud supérieur comme levier avec une pince émoussée dans une main, insérez le tube dans la veine porte à l’aide d’une pince pour saisir le tube avec l’autre main.
    3. Utilisez la deuxième suture pour attacher le tube en place, si possible.
      REMARQUE : Cette étape est le point final du système fermé où le perfusat doit sortir avec l’impact du pancréas sur le liquide présent.

4. Collecte

  1. Effectuer la perfusion.
    1. Avant de placer la tubulure de l’aorte abdominale inférieure, assurez-vous que le système de perfusion a commencé et que le perfusat s’écoule à la vitesse souhaitée (~2 mL/min).
      REMARQUE : Le perfusat doit s’écouler de la canulation de la veine porte et dans un tube de collecte. Un tube d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisé pour faciliter le stockage. Les solutions de perfusat utilisées ici sont 2,6 mM de glucose avec 1,2 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 16,8 mM de glucose et 2,6 mM de glucose avec 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) dans un tampon de bicarbonate de Krebs-Ringer (KRB, 16 mM HEPES et 0,1 % BSA, pH 7,4). La solution de perfusat a commencé par une solution à faible teneur en glucose à une glycémie élevée, puis à une solution à faible teneur en glucose, et s’est terminée par une solution IBX pour le contrôle.
  2. Récupérez le perfusat.
    1. Prélever le perfusat à intervalles de 30 minutes dans des tubes PCR (tubes remplacés toutes les 3 min).
    2. Après chaque intervalle de 30 minutes, changez de solution.
    3. Effectuez un test immuno-enzymatique (ELISA) avec les échantillons. Cela peut être fait ultérieurement s’il est stocké de manière appropriée.

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Résultats

Les résultats après ELISA devraient démontrer une sécrétion d’insuline par le pancréas de souris dans une mesure dépendante des taux de glucose perfusé. En raison de la nouveauté de cette procédure chez la souris, l’analyse du résultat et de son succès dépend de la comparaison avec de multiples autres essais portant sur un pancréas de souris perfusées. Une réponse insulinique biphasique à une concentration élevée de glucose est considérée comme physiologique, telle qu’évaluée chez des suj...

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Discussion

Le protocole décrit ci-dessus vise à créer un système fermé composé du pancréas intact, de deux entrées (cœliaque et artère mésentérique supérieure) et d’une sortie (veine porte hépatique). Tous les autres vaisseaux sont ligaturés pour éviter les fuites lorsque le perfusat est traversé, ainsi que pour assurer l’isolation du pancréas lui-même avec son microenvironnement. Les étapes de ligature de ce protocole permettent également au perfusat de circuler à travers le pancréas sans se rendr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs remercient Christopher Cahill, Jennifer Hollister-Lock, les Dres Susan Bonner-Weir, Kanako Iwasaki, Francesko Hela et Priscila Carapeto pour leurs conseils utiles, leur assistance technique et leur mentorat tout au long de ce projet. Cette recherche a été soutenue par la subvention NIDDK R01 DK132535.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Oxygénateur à membrane de fibresAppareil de Harvard73-3757Permet à l’oxygène d’entrer dans le perfusat
Coussin chauffantBraintree scientifique39OM
Kétamine/xylazinePatterson Vétérinaire78908598
Tableau magnétiqueBraintree scientifique39OM
Aimants avec élastiquesBraintree scientifique39OM
MicroscopieN/AN/APas d’entreprise spécifique
Bouteille d’oxygèneN/AN/APas d’entreprise spécifique
Tubes PCRThermoFisher/InvitrogenAM12225Utilisé pour la collecte du perfusat
Tube PE-30Braintree scientifiquePE30
Tube PE-50Braintree scientifiquePE50
Pompe péristaltiqueN/AN/APas d’entreprise spécifique
Outils chirurgicauxN/AN/APas d’entreprise spécifique
SutureN/AN/APas d’entreprise spécifique

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Perfusion du pancr asvasculature murinemesure de la s cr tion d insulinelots pancr atiquespancr as de souris perfusligature des vaisseauxtechnique de canulationdosage de l insuline par ELISA
Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose par perfusion à travers le système vasculaire de souris avec un pancréas intact
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