Le blanchiment itératif étend la multiplicité grâce à l’utilisation de l’automatisation de la coloration pour les installations centrales

Résumé

Ici, nous décrivons l’application de la méthode IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplicity) à l’aide de colorants tissulaires automatisés disponibles dans le commerce et des considérations d’optimisation pour l’utilisation de réactifs basés sur l’amplification du signal tyramide.

Résumé

IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplicity) est une technique d’imagerie par fluorescence multi-ronde basée sur l’amplification du signal tyramide (TSA) très sensible permettant un examen détaillé de nombreuses biomolécules protéiques dans un seul échantillon de tissu grâce à un blanchiment répété, une recoloration et un co-enregistrement d’image. Malgré son adoption croissante pour générer une immunocoloration hautement multiplexée, la mise en œuvre automatisée d’IBEX par le biais d’un déploiement dans des installations centrales offre de nombreux avantages, notamment une augmentation du débit, de la reproductibilité et de l’efficacité globale du personnel de laboratoire. Ici, nous démontrons l’application réussie d’IBEX sur deux plates-formes d’autocoloration largement utilisées et discutons des considérations d’optimisation importantes pour la conception de panneaux à l’aide de réactions basées sur la TSA pour des échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). Cela inclut la méthodologie de test de la sensibilité de récupération d’anticorps-antigène, une considération importante pour la conception du panel IBEX lors de la détermination de la séquence de développement des anticorps. De plus, nous présentons des approches d’imagerie en aval utilisant des scanners de lames entières disponibles dans le commerce et illustrons l’alignement et l’analyse de la qualité à l’aide d’un logiciel de phénotypage cellulaire disponible dans le commerce. À travers des descriptions détaillées de ces méthodologies et des vidéos d’accompagnement, nous visons à mettre en évidence la polyvalence et la facilité d’IBEX, en offrant des conseils pratiques aux installations de pathologie centrale pour intégrer IBEX dans leurs plateformes de coloration automatisées existantes.

Introduction

IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplicity) est une avancée significative dans l’immunohistochimie fluorescente multi-ronds très sensible basée sur la TSA, permettant une visualisation et une quantification détaillées de nombreuses biomolécules dans un seul échantillon de tissu. En utilisant des cycles répétés de blanchiment et de recoloration, IBEX permet d’examiner des environnements cellulaires complexes avec une profondeur et une clarté inégalées, ce qui en fait un outil puissant dans le domaine de l’immunomarquage et de l’imagerie multiplexée ^1,2.

De nombreuses entités universitaires, gouvernementales et industrielles hébergent des installations de pathologie de base dédiées au soutien d’un large éventail de méthodologies de recherche tissulaire visant à générer des ensembles de données morphomoléculaires qualitatives et quantitatives. Ces noyaux sont des ressources essentielles, fournissant des services spécialisés basés sur les tissus qui permettent aux laboratoires de recherche d’externaliser des processus de pathologie moléculaire complexes et à forte intensité de main-d’œuvre et de consulter directement les pathologistes pour la conception des études, le développement des tests et l’interprétation des données. Pour assurer l’uniformité et réduire la variabilité entre les expériences, ces installations centrales s’appuient régulièrement sur des autocolorants disponibles dans le commerce, des instruments automatisés conçus pour exécuter des protocoles de coloration standardisés avec une reproductibilité et une efficacité élevées³.

Bien que les autocolorants soient devenus l’épine dorsale de l’immunomarquage dans les installations centrales, permettant un débit élevé et des résultats cohérents, ils n’ont pas encore été adaptés pour s’adapter à des avancées plus récentes comme IBEX. De plus, la nécessité d’acquérir des connaissances spécialisées dans la conception de panneaux, en particulier lors de l’utilisation de réactifs basés sur l’amplification du signal tyramide (TSA)⁴, ajoute une couche supplémentaire de complexité, limitant l’adoption plus large d’IBEX dans les flux de travail de recherche de routine. Par conséquent, les chercheurs qui souhaitent tirer parti des capacités d’imagerie multiplexée à haute résolution d’IBEX peuvent souvent être limités par l’équipement existant de leurs installations centrales. Cet écart entre les techniques d’imagerie novatrices et les réalités pratiques des opérations de la plateforme met en évidence un obstacle à l’adoption plus large d’IBEX dans la recherche universitaire. Ce travail vise à surmonter cet obstacle en démontrant l’application réussie d’IBEX sur des plateformes d’autocoloration courantes, en se concentrant sur l’utilisation de réactifs à base de TSA utilisant des tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). Nous discutons d’abord des étapes nécessaires à la construction d’un panneau IBEX à l’aide de colorants basés sur la TSA, et de l’application de la couverture de ces panneaux sur deux autocolorants différents disponibles dans le commerce. Ensemble, ils offrent des conseils pratiques sur les tests de sensibilité de récupération d’anticorps-antigène, discutent des considérations clés pour optimiser la conception des panels et fournissent une méthode alternative pour l’alignement des panels à l’aide de logiciels commerciaux qui peuvent être disponibles et par l’intermédiaire des laboratoires de pathologie de base.

Protocole

1. Construction de panneaux IBEX avec des colorants à base de TSA

REMARQUE : Utilisez toujours une préparation fraîche d’anticorps et de colorants et conservez-la à 4 °C lorsqu’elle n’est pas utilisée.

1. Test de sensibilité à la récupération d’antigènes
   1. Préparation des lames
      1. À l’aide d’un microtome, prélevez trois sections en série pour chaque anticorps à partir du même tissu intégré au FFPE sur trois lames distinctes chargées positivement.
      2. Étiquetez les lames avec l’anticorps à tester, ainsi que le nombre de cycles de prélèvement de l’antigène à tester : 1 cycle, 3 cycles et 6 cycles.
      3. Faites sécher les lames pendant la nuit à température ambiante. Si vous ne travaillez qu’avec des marqueurs de surface, faites cuire les lames à 60 ^°C pendant au moins 20 minutes pour ramollir la cire. Si vous travaillez avec des marqueurs nucléaires, faites cuire les lames à 60 ^°C pendant la nuit.
   2. Préparez le programme sur l’autostainer pour les différents nombres de cycles, en vous assurant qu’il y a trois étapes de lavage entre chaque étape. Voir le tableau 1 pour des exemples de protocoles pour les tests à 1, 3 et 6 cycles.
      REMARQUE : Pour chaque anticorps individuel, assurez-vous d’un temps constant pour l’étape de l’anticorps et l’application du colorant TSA.
      Pour l’application de colorant basé sur la TSA, une alternative au fait de laisser reposer le colorant pendant 3 à 10 minutes à température ambiante est de laisser le colorant incuber pendant 20 minutes à 37 °C.
   3. Chargez les échantillons sur l’autocolorateur et exécutez le protocole pendant le nombre de cycles associé.
   4. Répétez ce processus des étapes 1.1.1 à 1.1.3 pour chaque anticorps à valider et à tester.
   5. Retirez les lames de l’autocolorateur et placez-les dans PBS.
   6. Montez les lames avec un support de montage aqueux (comme pour une cartouche IBEX) et une lamelle de recouvrement #1.5 pour une imagerie optimale.
   7. À l’aide d’un microscope à épifluorescence, imagez la lame à 1 cycle pour le colorant TSA et le DAPI, en notant le temps d’exposition nécessaire pour visualiser le signal.
   8. Répétez cette opération pour les diapositives à 3 cycles et à 6 cycles, en notant le temps d’exposition nécessaire pour visualiser le colorant TSA.
   9. Comparez les temps d’exposition entre les différents numéros de cycle. Voir la figure 1 pour des exemples. Assurez-vous de trois cycles de lavage entre toutes les étapes.
      1. Si le temps d’exposition diminue avec l’augmentation des cycles, placez cet anticorps et ce colorant à une étape ultérieure.
      2. Si le temps d’exposition augmente avec l’augmentation des cycles, placez cet anticorps dans une étape antérieure.
      3. S’il n’y a pas de changement important dans le temps d’exposition, placez cet anticorps à n’importe quelle étape.
      4. Regroupez les anticorps en fonction des exigences du cycle pour le passage initial dans les panels IBEX.
         REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, effectuez cette validation sur tous les marqueurs souhaités pour un panneau IBEX donné. Effectuez cette validation chaque fois que les types de tissus sont modifiés ou lorsque vous travaillez avec des anticorps primaires polyclonaux avec des numéros de lot uniques.
2. Résoudre le problème du saignement du signal d’un colorant spectralement proche en évaluant l’intensité du signal.
   1. Regroupez les anticorps dans des panels IBEX potentiels en fonction du nombre optimal de cycles de récupération, tel que déterminé ci-dessus en groupes de 1, 3 ou 6 cycles.
   2. Préparation des lames
      1. Utilisez un microtome pour créer des coupes en série à partir d’un échantillon FFPE, une pour chaque anticorps à utiliser dans un seul panel IBEX.
      2. Étiquetez chaque lame avec l’un des anticorps à utiliser dans le panel IBEX.
      3. Laissez les lames sécher toute la nuit à température ambiante. Si vous ne travaillez qu’avec des marqueurs de surface, laissez les lames cuire à 60 ^°C pendant au moins 20 minutes pour ramollir la cire. Si vous travaillez avec des marqueurs nucléaires, laissez les lames cuire à 60 ^°C pendant la nuit.
   3. Pour le groupe de cycles 1, 3 et 6, utilisez la configuration à un cycle du Tableau 1. Assurez-vous que trois lavages sont effectués entre toutes les étapes
      1. Modifier le protocole pour chaque anticorps à utiliser avec le temps de coloration optimal.
      2. Utilisez le même temps TSA pour tous les anticorps.
   4. Colorez les échantillons sur l’autocolorer.
   5. Retirez les échantillons et placez les lames dans le PBS.
   6. Montez les lames avec un support de montage aqueux (comme pour une cartouche IBEX) et une lamelle de recouvrement #1.5 pour une imagerie optimale.
   7. Imagez les lames à l’aide d’un microscope à épifluorescence en utilisant un temps d’exposition optimal pour chaque image.
   8. Déterminez l’intensité du signal. Les diapositives avec des temps d’exposition courts ont une intensité de signal très élevée, tandis que les diapositives avec un temps d’exposition long ont une faible intensité de signal.
   9. Utilisez l’intensité du signal ainsi que le numéro de cycle pour développer des panneaux IBEX.
      1. Regroupez les anticorps en fonction du numéro de cycle.
      2. Pour un groupe donné d’anticorps avec un numéro de cycle spécifique, assurez-vous qu’un signal fort n’est pas optiquement proche d’un signal faible afin de minimiser le débordement du signal.
3. Validez les panels IBEX individuels pour vous assurer que chaque panel peut générer le résultat souhaité.
   1. Préparez les diapositives.
      1. À l’aide d’un microtome, créez des sections en série, une pour chaque panneau IBEX multiplex, et étiquetez-les avec l’ordre des panneaux IBEX à utiliser.
      2. Laissez les lames sécher toute la nuit à température ambiante. Si vous ne travaillez qu’avec des marqueurs de surface, laissez les lames cuire à 60 ^°C pendant au moins 20 minutes pour ramollir la cire. Si vous travaillez avec des marqueurs nucléaires, laissez les lames cuire à 60 ^°C pendant la nuit.
   2. Configurez l’autostainer.
      1. Pour le premier panneau, configurez le programme d’autocoloration sans étapes supplémentaires de récupération d’antigène.
      2. Pour le deuxième panel, introduire des étapes de dénaturation supplémentaires avant le premier anticorps égales au nombre d’étapes de dénaturation dans le premier panel. Voir le tableau 2 pour un exemple de panel 1 avec cinq anticorps, et le tableau 3 pour un exemple de panel 2 avec quatre anticorps. Assurez-vous de trois étapes de lavage entre toutes les étapes.
      3. Répétez l’opération au besoin pour des panneaux IBEX supplémentaires, en ajoutant d’autres étapes de dénaturation.
   3. Retirez les lames de l’autocolorateur et placez-les dans PBS jusqu’au moment de les monter.
   4. Montez les lames avec un support de montage aqueux (comme pour une cartouche IBEX) et une lamelle de recouvrement #1.5 pour une imagerie optimale.
   5. Imagez les lames sur un microscope à épifluorescence en utilisant un temps d’exposition optimal pour chaque image et chaque colorant TSA.
   6. Évaluez si tous les panneaux s’affichent correctement. Si c’est le cas, passez à l’imagerie IBEX. Si ce n’est pas le cas, réadressez les cycles d’équilibrage et de récupération du signal.
      REMARQUE : Certains ajustements peuvent être effectués dans un seul panneau pour optimiser le signal et éviter l’effet parapluie. Certains signaux très abondants peuvent bloquer la coloration des signaux en aval. Regardez à l’intérieur d’un panneau donné pour utiliser d’abord les teintures les moins présentes (voir Figure 2).

2. Adaptation IBEX avec des autocolorants utilisant des réactifs TSA et des plateformes d’imagerie de lames entières (Figure 3)

REMARQUE : Pour une comparaison des deux autocolorants validés utilisés et discutés dans le présent protocole, voir le tableau 4.

1. Préparez toutes les diapositives pour l’exécution IBEX.
   1. Utilisez un microtome pour créer des sections FFPE sur une lame chargée positivement. Assurez-vous d’inclure une lame pour chaque échantillon expérimental, des lames de contrôle positives de coupes de tissus connues pour contenir les antigènes à imager, et une lame de contrôle négative dans laquelle le PBS est utilisé à la place de tous les anticorps primaires.
      REMARQUE : Si vous travaillez par lots, incluez un échantillon de contrôle de lot. Un échantillon de contrôle de lot est un bloc de tissu FFPE unique qui est sectionné et inclus dans chaque lot d’échantillons expérimentaux pour être utilisé dans la normalisation et le contrôle de la variation expérimentale entre les lots d’échantillons de coloration. Cela n’est nécessaire que si tous les échantillons ne sont pas traités ensemble.
   2. Laissez les lames sécher toute la nuit à température ambiante. Si vous ne travaillez qu’avec des marqueurs de surface, laissez les lames cuire à 60 ^°C pendant au moins 20 minutes pour ramollir la cire. Si vous travaillez avec des marqueurs nucléaires, laissez les lames cuire à 60 ^°C pendant la nuit.
2. Préparer les anticorps et les colorants pour le premier panel IBEX à imager.
3. Configurez le programme d’autocoloration. Voir le tableau 2 pour un exemple de panneau à 5 marqueurs. Assurez-vous de trois lavages entre chaque étape.
4. Chargez des échantillons et des anticorps dans l’autocolorateur et exécutez le programme de coloration des échantillons.
5. Retirez les lames de l’autocolorateur et appliquez une lamelle à l’aide d’un support de montage aqueux approprié pour l’imagerie multispectrale et d’une lamelle #1.5.
6. Imagez les lames dans les 2 jours suivant la coloration
7. Imagerie de fluorescence sur épifluorescence ou scanner de lames de fluorescence
   1. En commençant par l’échantillon de contrôle positif bien contrôlé, chargez l’échantillon de contrôle positif dans le microscope.
      1. Localiser un signal positif dans l’échantillon pour chacun des différents antigènes à imager.
      2. Réglez le temps d’exposition pour assurer la capture de la plage dynamique de la tache tout en minimisant l’arrière-plan en commençant par une faible exposition et en augmentant progressivement le temps d’exposition jusqu’à ce que le signal soit présent. Faites-le pour chaque colorant individuellement.
         REMARQUE : Testez la présence d’une expression élevée et faible des marqueurs pour assurer la capture de toute la plage dynamique.
   2. Enregistrez les paramètres utilisés pour l’échantillon de contrôle positif et utilisez-les pour toutes les étapes d’imagerie ultérieures.
   3. Chargez et imagez l’échantillon de contrôle négatif et tous les échantillons expérimentaux en utilisant les paramètres déterminés par l’échantillon de contrôle positif.
   4. Vérifiez que les images sont de qualité optimale avant de passer aux étapes suivantes.
8. Retrait de la lamelle
   1. Immergez les lames dans un bocal Coplin avec de l’eau DI. Placez le bocal Coplin dans un bain-marie réglé à 65 °C pendant 15 à 20 minutes pour faciliter le retrait naturel de la lamelle. Par ailleurs, si un milieu d’enrobage à base aqueuse est utilisé ou si le milieu d’enrobage a complètement durci, retirez les lamelles en les trempant dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou dans de l’eau DI pendant la nuit pour permettre aux lamelles de tomber naturellement.
9. Blanchiment avec LiBH₄
   1. Dans une hotte, préparer une solution fraîche de LiBH₄ à une concentration de 1 mg/mL dans de l’eau DI. Faites-en assez pour couvrir chaque échantillon 3 fois.
      REMARQUE : Ne préparez pas plus de 10 ml à la fois en raison de la réaction de LiBH₄ avec l’eau. Utilisez de l’eau DI et non de l’eau Millipore/nanopure pour une activité de blanchiment optimale.
   2. Laissez reposer la solution pendant 20 min. Des bulles se formeront.
   3. Pipeter 1 mL de solution de LiBH₄ sur chaque lame dans une chambre de coloration d’une hotte. Laissez la solution reposer sur la lame pendant 10-15 min.
   4. Retirez le LiBH₄ en le pipetant sur la lame et remplacez-le par 1 ml de LiBH_{4 frais.} Laissez reposer la solution pendant 10-15 min.
   5. Retirez le LiBH₄ en le pipetant sur la lame et remplacez-le par 1 ml de LiBH_{4 frais.} Laissez reposer la solution pendant 10-15 min.
   6. Retirez le LiBH₄ des lames par pipetage et immergez-les dans de l’eau DI ou du PBS pour un stockage à court terme (pas plus de 1 jour).
   7. Dans la journée, passez au prochain cycle de coloration IBEX.
   8. En option : montez les lames à l’eau et effectuez une visualisation rapide sur une lunette d’épifluorescence pour vérifier le succès du blanchiment.
10. Montage humide de la glissière dans l’autocolorateur et deuxième passage de coloration IBEX
    1. Préparez tous les anticorps et les solutions de colorant TSA pour l’autocolorateur.
    2. Pour l’autocolorateur Ventana :
       1. Lorsque vous êtes prêt à commencer la coloration automatique, pipetez environ 1 ml de tampon de lavage de colorant automatique sur la lame pour éviter le dessèchement du support humide.
       2. Chargez les glissières montées à l’eau dans l’autocolorateur.
    3. Pour le Bond Rx :
       1. Placez les tuiles de couverture sur les diapositives.
       2. En haut du carrelage, pipetez 300 μL de tampon de lavage pour permettre à la solution de s’écouler dans l’espace entre l’échantillon et le carreau.
       3. Chargez les échantillons sur l’autocolorateur.
    4. Configurez le programme d’autocoloration en suivant l’exemple du tableau 2 avec N défini sur le nombre d’anticorps dans le panneau.
    5. Retirez les lames de l’autocolorateur et appliquez une lamelle à l’aide d’un support de montage aqueux approprié pour l’imagerie multispectrale et d’une lamelle #1.5.
    6. Imagez les lames dans les 2 jours suivant la coloration en suivant la procédure d’échantillonnage décrite à l’étape 2.7 pour la mise en place de la séance d’imagerie et la collecte des images.
    7. Après l’imagerie, prélever des échantillons d’eau de Javel comme décrit aux étapes 2.8 et 2.9.
11. Répétez l’opération pour tous les panneaux IBEX souhaités.

3. Analyse d’échantillons à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce

1. Effectuez des balayages de lames entières des lames colorées avant de procéder à l’alignement.
2. Si le logiciel le permet, effectuez le démixage spectral à l’aide de la fonction de démixage automatique intégrée aux fonctions de balayage, y compris la suppression des spectres d’autofluorescence. S’il s’agit d’une fonction du logiciel utilisé, sélectionnez l’option de démélange et exécutez en utilisant les paramètres standard et les colorants prédéfinis
   REMARQUE : Un démixage personnalisé peut être généré dans la plupart des logiciels qui permettent le démixage. Pour créer une bibliothèque, des coupes de tissus individuelles colorées avec un seul fluorophore sont ajoutées aux mesures du logiciel. Une région de tissu non coloré ou autofluorescent est également balayée pour caractériser le spectre d’autofluorescence, et celle-ci est sélectionnée avec l’outil d’autofluorescence. Ces spectres sont compilés dans le programme en appuyant sur « préparer l’image », puis exportés vers une bibliothèque de démixage spécifique au projet. Cette bibliothèque est ensuite sélectionnée comme bibliothèque de démixage dans l’option de démixage.
3. Importez les diapositives numérisées dans un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce pour l’alignement.
4. Enregistrement de diapositives de plusieurs tours IBEX
   1. Sélectionnez deux itérations de rondes IBEX à enregistrer.
   2. Faites un clic droit sur les deux et sélectionnez l’option S’inscrire .
   3. Sélectionnez l’enregistrement par défaut avec enregistrement haute résolution pour une première tentative d’enregistrement.
   4. Vous pouvez également sélectionner Enregistrement d’un seul canal dans les options et sélectionner un seul canal cohérent pour toutes les exécutions IBEX.
      REMARQUE : Cette option est utile pour les colorants résistants au blanchiment (voir les matériaux pour lesquels les colorants ne blanchissent pas).
5. Alignement de l’image
   1. Ouvrez l’une des images enregistrées.
   2. Dans l’onglet Outils , sous Enregistrement d’image, sélectionnez Outils d’enregistrement pour ouvrir toutes les images enregistrées.
   3. Dans l’onglet Outils d’enregistrement , sélectionnez la fonction de repère.
   4. Utilisez la fonction de repère pour affiner l’alignement de diapositives entières.
      1. Marquez manuellement les points de repère sur une image de diapositive.
      2. Sur les autres images IBEX, marquez le même point de repère. Le programme permettra de peaufiner le tracé à l’aide du point de repère identifié. Répétez l’opération pour un réglage précis de l’alignement.
   5. Une fois satisfait de l’alignement, fusionnez les glissières à l’aide du Fuse | Fonction de coloration en série.
   6. Répétez ce processus avec toutes les séries d’imagerie IBEX supplémentaires jusqu’à ce qu’une synthèse finale de toutes les images soit terminée.
6. Analyse d’images
   1. Segmentation des cellules
      1. Sous l’onglet Analyse , sélectionnez et ouvrez le module HighPlex, puis sélectionnez le module de phénotypage pour l’identification des cellules.
         1. Chargez tous les marqueurs et commencez par trouver tous les noyaux à l’aide de l’onglet Détection nucléaire du module Highplex . Chargez les marqueurs dans l’onglet Sélection de colorant . Identifiez les cellules à l’aide de la coloration DAPI.
         2. Dans l’onglet Analyser , activez l’outil de réglage en temps réel à l’aide des paramètres clés suivants : Intensité nucléaire minimale définie pour filtrer le signal de fond ; Luminosité maximale de l’image réglée pour contrôler la visibilité globale du signal ; Agressivité définie pour affiner les limites des noyaux détectés.
         3. Réglez soigneusement chaque paramètre pour assurer une segmentation précise.
   2. Détecter le cytoplasme et les marqueurs membranaires.
      1. Accédez à l’onglet Détection de la membrane et du cytoplasme .
      2. Définissez le rayon minimal du cytoplasme sur une valeur appropriée pour l’échantillon et la taille attendue des cellules.
      3. Sous l’option Colorants de membrane , spécifiez quels canaux sont des marqueurs de membrane.
         REMARQUE : Cela devrait permettre une meilleure segmentation des cellules individuelles pour une analyse plus approfondie.
   3. Seuillage des marqueurs et attribution du phénotype
      1. Pour chaque marqueur, définissez les seuils pour les signaux positifs et négatifs. Faites-le sous les onglets générés pour chaque marqueur.
      2. Effectuez le seuillage manuel de chaque marqueur pour identifier les populations.
      3. Vous pouvez également utiliser une approche automatisée basée sur la bio-informatique pour le seuillage. Dans le domaine avancé | Stocker les données de l’objet (cellule), basculez l’option sur Vrai. À l’export | Données d’objet, exportez le jeu de données pour obtenir des informations sur l’expression de marqueur pour chaque cellule identifiée.
      4. Importez ces données dans un logiciel supplémentaire pour une analyse plus approfondie et personnalisée. Le tableau 5 propose des logiciels permettant une analyse plus approfondie.

Résultats

Nous donnons l’exemple d’un panel IBEX utilisant des réactifs basés sur TSA sur l’Autostainer 2 (Figure 4). Chaque marqueur peut être clairement délimité et il y a un minimum de saignement entre les marqueurs. L’image a été collectée à travers deux séries de colorations. L’échantillon est du tissu pulmonaire suite à une infection par Mycobacterium tuberculosis. Les deux panneaux de coloration IBEX ont été alignés à l’aide d’un exemple de logiciel disponible dans le commerce. En utilisant l’approche IBEX avec des réactifs TSA optimisés (comme décrit ici), l’organisation spatiale des cellules immunitaires, des marqueurs inflammatoires et des cellules pulmonaires spécialisées peut être observée et appréciée. Une bonne optimisation permet aux marqueurs d’apparaître facilement avec un minimum d’arrière-plan.

Figure 1 : Test de récupération d’antigène avec un fluorophore avec une émission de 520 nm de deux antigènes différents. RAGE et CD3e ont été imagés en utilisant des temps d’exposition conservés. L’épitope de cet anticorps RAGE est très sensible et sensible à la récupération répétitive de l’antigène, avec une baisse rapide de la sensibilité du test avec des récupérations ultérieures de l’antigène. À l’inverse, la sensibilité du dosage CD3e s’améliore avec plusieurs cycles de récupération d’antigènes. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviation : RAGE = Receptor for Advanced Glycation Endproducts. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemple de l’importance du développement de séquences par rapport à l’effet parapluie. RAGE est un marqueur fortement exprimé dans les cellules AT1 et, en combinaison avec CD31, bloque efficacement l’immunoréactivité du SRAS-CoV-2. Cependant, lorsque l’IHC du SRAS-CoV-2 est effectué en premier, tous les signaux peuvent être visualisés. Barres d’échelle = 25 μm. Abréviations : RAGE = Receptor for Advanced Glycation Endproducts ; AT1 = Alvéolaire de type 1 ; SARS-CoV-2 = Coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère ; IHC = Immunohistochimie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Vue d’ensemble du processus à l’aide d’un équipement de coloration automatisé pour le protocole IBEX. Montage humide pour le tour 2 ou plus du processus de coloration pour éviter que les tissus ne se dessèchent. Abréviation : IBEX = Iterative Bleaching Extends Multiplicity. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Exemple d’IBEX avec des colorants à base de TSA provenant de l’autocolorer 2 sur un poumon infecté par Mycobacterium tuberculosis. Le panneau 1 contient tous les colorants, et le panneau 2 contient les colorants qui se prêtaient à un blanchiment. Une image fusionnée de tous les canaux sur l’ensemble de l’image IBEX du poumon est présentée. Barres d’échelle = 200 μm. Abréviations : IBEX = le blanchiment itératif prolonge la multiplicité ; TSA = Amplification du signal Tyramide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Exemple de protocole de validation des effets du nombre de cycles sur les anticorps pour les tests à 1, 3 et 6 cycles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Un exemple de panel 1 avec cinq anticorps pour l’autocolorateur IBEX pour la validation du panel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Un exemple de panel 2 avec quatre anticorps pour l’autocolorant IBEX pour la validation du panel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Comparaison de deux autocolorants. Tableau résumant les avantages et les inconvénients de l’Autostainer Ventana et du Bond Rx. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Résumé du logiciel pour l’analyse d’images. Tableau résumant certaines des approches d’analyse et des outils logiciels disponibles pour l’analyse des images post-segmentation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Ici, nous présentons des considérations pour l’adaptation du protocole IBEX dans les installations de pathologie de base avec l’application d’un équipement de coloration automatisé et l’optimisation des réactifs basés sur la TSA dans le protocole IBEX. Nous montrons comment optimiser au mieux les cycles répétés de récupération d’antigène et le chargement correct au tour 2 ou plus sur l’équipement automatisé. De plus, nous démontrons une méthode supplémentaire d’alignement à l’aide du logiciel Halo qui peut être disponible dans les installations centrales. Ces approches se sont avérées utiles pour déterminer les différences dans les environnements pulmonaires dans les tissus de primates non humains après des infections par le SRAS-CoV-2⁵.

Un élément clé de ce travail met en évidence la nécessité d’une optimisation approfondie de la conception du panel IBEX avant la coloration des tissus expérimentaux. En particulier, avec l’utilisation de réactifs à base de TSA, certaines considérations qui ne figurent pas dans les méthodes IBEX de base doivent être prises en considération. Le premier est l’impact de plusieurs cycles de récupération d’antigènes sur la sensibilité des anticorps. Avec les réactifs à base de TSA, chaque nouveau développement d’anticorps est précédé d’une dénaturation des anticorps. Certaines paires d’anticorps/antigènes seront sensibles à des cycles supplémentaires de récupération d’antigènes et diminueront la sensibilité du test, tandis que d’autres obtiendront une sensibilité accrue avec une dénaturation répétitive/récupération d’antigènes. Il est important de tester soigneusement chaque anticorps dans le tissu cible avant de concevoir les panels afin de garantir les meilleures pratiques de coloration et d’informer l’ordre séquentiel des anticorps et des colorants fluorescents. Les tampons, y compris à base de citrate (pH 6,0) et de Tris-EDTA (pH 9,0), sont testés pour tous les anticorps afin de déterminer les conditions optimales de récupération de l’antigène. Il s’agit d’évaluer systématiquement chaque tampon afin d’identifier celui qui maximise l’exposition à l’antigène pour un anticorps donné. De plus, la température (p. ex., 20 à 37 °C), le temps d’incubation (généralement de 30 à 60 min) et les conditions de blocage sont optimisés pour réduire les colorations de fond non spécifiques et assurer une liaison spécifique des anticorps primaires et secondaires, si nécessaire. Le blocage avant l’apparition des anticorps primaires et secondaires peut inclure l’utilisation de réactifs bloquants disponibles dans le commerce pour tenir compte de l’autofluorescence spécifique des tissus ou des interactions non spécifiques. D’autres considérations importantes qui doivent être optimisées avant de finaliser les panels IBEX comprennent l’effet parapluie, où le blindage des épitopes peut se produire si l’ordre n’est pas adapté à la question de recherche spécifique posée⁶. Pour éviter le saignement fluorescent, il est typique de placer les cibles antigéniques à expression plus élevée dans les canaux rouges lointains qui ont le moins de saignement et les marqueurs plus faibles dans la gamme 480-520 nm, qui auront le meilleur rapport signal/bruit étant donné que ces colorants fluorescents sont les⁷ plus brillants. Cependant, des précautions doivent être prises aux échantillons de tissus fortement autofluorescents qui peuvent être les plus brillants dans cette gamme ; Nous recommandons de résoudre ce problème en imageant les tissus sans aucun colorant pour traiter les niveaux potentiels d’autofluorescence. Ensemble, ces étapes d’optimisation, prises avec toutes les optimisations et contrôles normaux généralement effectués avec IBEX, peuvent éclairer la conception appropriée des panneaux IBEX avec des réactifs TSA.

Dans cette méthode, nous avons démontré l’utilisation de deux autocolorants courants. Cependant, ces approches pourraient également être appliquées à d’autres méthodes d’autocoloration. L’élément clé ici est l’élimination optimale des lamelles et la charge humide pour des cycles de coloration supplémentaires. De plus, nous ne spécifions aucune configuration de microscope spécifique. Bien que les kits puissent recommander l’utilisation avec certains systèmes d’imagerie pour une numérisation optimale des lames, toute configuration de microscope, en particulier un microscope à épifluorescence avec des cubes de filtre compatibles et une source lumineuse LED à large spectre, devrait fonctionner. Certains colorants nécessitent des détecteurs multispectraux ou des cubes de filtre spécialisés, qui peuvent ne pas être disponibles dans tous les laboratoires et peuvent présenter des défis lorsqu’ils sont utilisés avec des cubes de filtre standard en raison de leur chevauchement spectral. Ces colorants sont mieux séparés à l’aide de systèmes d’imagerie multispectrale ou de filtres très spécifiques. Certains fluorophores se situent en dehors de la gamme des filtres rouges lointains conventionnels (généralement ~700 nm) et nécessitent un cube de filtre ou un détecteur spécialisé capable de capturer des signaux proches infrarouges. Des microscopes spécialisés sont construits avec ces filtres, mais des alternatives sont disponibles. Ceux-ci nécessiteront une optimisation supplémentaire pour déterminer comment les colorants se comportent dans une configuration de microscope donnée.

Le démixage multispectral est fortement recommandé pour l’IHC fluorescent multiplexe, en particulier lorsque vous travaillez avec des tissus sujets à l’autofluorescence, car il sépare efficacement le signal réel du bruit de fond. L’autofluorescence, qui chevauche souvent les spectres d’émission des fluorophores couramment utilisés (en particulier dans les canaux de longueurs d’onde de haute énergie), peut obscurcir ou interférer avec des signaux spécifiques, réduisant ainsi la précision. Le démélange spectral démêle mathématiquement les spectres d’émission qui se chevauchent, isolant les signaux fluorescents réels tout en « nettoyant » l’autofluorescence indésirable. Le démixage spectral est particulièrement utile dans les flux de travail IBEX, où l’obtention des signaux les plus propres possibles est essentielle en raison de la nature itérative du processus de coloration et d’imagerie. Dans IBEX, les signaux provenant de plusieurs cycles de coloration sont imagés, blanchis et empilés les uns sur les autres pour créer une image composite. Toute autofluorescence ou fuite qui n’est pas résolue en un seul tour peut se propager à travers les images empilées, ce qui complique l’analyse en aval et réduit la confiance dans la localisation des marqueurs. Le démixage spectral isole efficacement les signaux de fluorescence véritables de l’autofluorescence de fond, assurant une détection de signal plus propre et plus précise à chaque tour individuel. Cette clarté du signal est essentielle pour générer des images composites fiables où plusieurs marqueurs sont analysés ensemble sur des tours, ce qui permet un phénotypage et une analyse spatiale fiables. La plate-forme d’imagerie utilisée pour ce protocole dispose de capacités de démélange intégrées, mais davantage d’options de démixage sont nécessaires pour la compatibilité avec d’autres plates-formes d’imagerie fluorescente de lames entières.

De plus, l’une des limites de ce travail est la nature exclusive des autocolorants, car leurs réactifs associés et leurs tampons de lavage sont optimisés pour ces systèmes, mais les formulations spécifiques ne sont pas divulguées. De plus, nous nous sommes concentrés exclusivement sur un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce pour l’analyse d’images de lames entières et reconnaissons que le coût des licences logicielles peut constituer un obstacle financier pour certains laboratoires. Le logiciel d’analyse supplémentaire ^8,9 et les options dans R semblent prometteurs ; en particulier, le Bodenmiller Group¹⁰, qui a créé un ensemble de packages qui semble optimal pour les cœurs, dans la mesure où IMCDataAnalysis¹¹ est destiné à un flux de travail reproductible sur l’analyse en aval d’images multiplexées dans R. Cependant, des efforts futurs sont nécessaires pour développer et caractériser des alternatives accessibles et rentables pour l’analyse IBEX de la diapositive entière afin d’assurer une adoption plus large dans les contextes à ressources limitées. De plus, cette approche avec l’utilisation des autocolorants pour IBEX peut être adaptée pour une coloration plus traditionnelle dans IBEX, y compris avec des anticorps primaires conjugués fluorescents, ou avec des anticorps secondaires standard sans colorants à base de TSA si le tissu est de qualité suffisamment élevée et le temps de fixation optimal pour permettre un bon signal.

Dans l’ensemble, nous espérons que ce travail contribuera à l’application de l’IHC fluorescent multiplex basé sur la TSA en utilisant l’équipement de base de pathologie couramment utilisé pour adapter plus largement IBEX à ces environnements. Ce type d’application met vraiment en évidence la polyvalence du protocole IBEX et démontre son utilité même dans des échantillons de tissus difficiles ou dans des approches de grands lots.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kits TSA Alexa pour réactifs de tache	ThermoFisher		Des colorants TSA alternatifs si les filtres de microscopie opale ne sont pas disponibles. Parmi ceux-ci figurent Alexa Fluor 488 (canal bleu/vert), Alexa Fluor 555 ou 568 (canal rouge), Alexa Fluor 647 (canal rouge lointain), Alexa Fluor 750 (proche infrarouge, si équipé de filtres appropriés).
Anticorps Arg1	Signalisation cellulaire	93668	Utilisé dans la Figure 4 à 1:100
Lames matérielles	Leica Biosystems		Ou encore, un profil élevé ou bas dépendra du type de tissu
Anticorps CD11b	Abcam	ab133357	Utilisé dans la Figure 4 à 1:2000
Anticorps CD163	Abcam	ab182422	Utilisé dans la Figure 4 à 1:500
Anticorps CD31	Signalisation cellulaire	77699S	Utilisé dans la Figure 2 à 1:100
Anticorps CD3e	Dako	A045201-2	Utilisé dans la Figure 1 à 1:100
Tool Pot de Coplin	Fischer Scientific	01-816-21	Ou quelque chose de similaire
Enbains de couverture matériels	VWR	v48393-026	Ou quelque chose de similaire
Anticorps CX3CR1	Abcam	ab308613	Utilisé dans la Figure 4 à 1:450
Stain DAPI	Akoya	FP1490
Software FIJI			Utilisé pour mesurer l’intensité du signal
Slide Glissades Fisher Superfront	Fisher Scientific	22-037-246	Ou quelque chose de similaire
Software HALO	Indica Labs		Exemple de logiciel d’analyse d’image disponible commercialement. Utilisé pour aligner et analyser des images.
Anticorps Iba1	Signalisation cellulaire	17191	Utilisé dans la Figure 4 à 1:800
Software inForm	Akoya		Utilisé pour mesurer l’intensité du signal
Anticorps iNOS	Abcam	ab283655	Utilisé dans la Figure 4 à 1:400
Instrument Leica Bond Rx (ou RXm)	Leica Biosystems	21.2201	Appelé « Autostainer 1 » dans le texte. Assurez-vous que tous les réactifs associés sont également disponibles, y compris les boîtes de coloration et les solutions en vrac.  ;
Reagent LiBH4	Sigma-Aldrich	62460-5G-F	Conserver dans un environnement anhydre
Claquement de mantra Instrument	Akoya		Un microscope multispectral à fluorescence est nécessaire pour déverrouiller les colorants. Exemple de microscope pouvant être utilisé pour détecter des colorants d’opale.
Tool Microtome	Leica Biosystems		Ou un modèle similaire avec des accessoires préférés comme des pinceaux
Kit de réactif de coloration Opal IHC 480	Akoya	FP1500001KT	Utilisé dans la Figure 4
Kit Plex Opal IHC 6-plex réactif de coloration	Akoya	NEL821001KT	Les 520 et 620 ne blanchissent pas, comme on les utilise dans les figures 1, 2 et 4
Kit Reactif de coloration Opal IHC 780	Akoya	FP1501001KT	Utilisé dans la Figure 4
Tool Four	Millipore Sigma	Z683329	Ou similaire, cela peut aussi se faire sur autostainer
Anticorps Pancytokératine	Abcam	ab9377	Utilisé dans la Figure 4 à 1:50
Réactif PBS (optionnel)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	Akoya		Imagerie multispectrale de diapositives entières avec démélange spectral embarqué intégré au logiciel
Reagent ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	Ou des supports de montage aqueux similaires
Anticorps ProSP-C n-terminal (ProSPC)	Bioréactifs des Sept Collines	WRAB-9337	Utilisé dans la Figure 4 à 1:250
RAGE < ANTICORPS/>	R& D	MAB1179	Utilisé dans les figures 1 et 2 à 1:50
Tampon réactif	Roche	NC1895692	Pour une utilisation avec l’autostainer Ventana
Anticorps SARS-CoV-2-N	Signalisation cellulaire	68344	Utilisé dans la Figure 2 à 1:1000
Lames TOMO Lames CC d’adhérence CC - WH	Avantik	SKUSL6519-1	Si l’adhérence tissulaire est préoccupante
Instrument Ventana Discovery Ultra	Roche		Appelé « Autostainer 2 » dans le texte. Assurez-vous que tous les réactifs associés sont également disponibles, y compris les boîtes de coloration et les solutions en vrac.  ;
Tampon de lavage réactif	Leica Biosystems	AR9590	Pour une utilisation avec Leica Bond autostainer
Réactif Eau	Fisher Scientific	15-230-147	Le DI est le meilleur, pas le millipore
Bain d’eau Tool	Leica Biosystems	140607020C1	Ou quelque chose de similaire