Method Article

Comprendre les changements de la morphologie mitochondriale à l’aide de micrographies à fluorescence dynamiques et tridimensionnelles

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici le mitochondrial event localizer (MEL), un plugin ImageJ utile dans la quantification des changements tridimensionnels de la fission mitochondriale et de l’activité de fusion au fil du temps. Nous décrivons également un pipeline de traitement d’images utile pour le nettoyage des micrographies avant l’analyse dans ImageJ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les mitochondries sont des organites hautement dynamiques qui sont vitaux à la survie de tout animal, subissant régulièrement des événements de fission et de fusion en réponse aux besoins ou aux stress de l’hôte, conduisant au remodelage constant du réseau mitochondrial. Pour cette raison, être capable d’évaluer le réseau mitochondrial en trois dimensions, ainsi qu’au fil du temps, offre un avantage pour comprendre comment le système réagit à des facteurs tels que le stress ou l’intervention pharmaceutique. L’imagerie par fluorescence des réseaux mitochondriaux des cellules permet de visualiser et de surveiller ces changements. Cependant, le réseau mitochondrial est souvent décrit comme une structure bidimensionnelle et statique définie par des mesures non standardisées. Par conséquent, nous avons entrepris de décrire un pipeline qui permet à l’utilisateur de préparer ses images pour le localisateur d’événements mitochondriaux (MEL), un outil de plug-in ImageJ qui détecte les événements de fission et de fusion dans le réseau mitochondrial au fil du temps et de manière tridimensionnelle, offrant ainsi un aperçu des changements dynamiques que ce réseau subit. De plus, nous décrivons les avantages de comprendre la fission et la fusion à la lumière des changements dans le nombre de mitochondries et les changements morphologiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les mitochondries sont des organites très dynamiques présents dans toutes les cellules eucaryotes, qui leur fournissent de l’énergie et régulent leur métabolisme. Ainsi, les mitochondries sont à la croisée des chemins de la mort cellulaire et de la survie. Il a été démontré que les mitochondries sont essentielles pour une variété de processus, allant de l’acidification lysosomale et de l’action motrice moléculaire à la contraction musculaire et à l’activation des synapses 1,2.

Les mitochondries subissent régulièrement des événements de fission et de fusion pour maintenir un réseau mitochondrial qui produit efficacement de l’ATP en réponse à la demande métabolique et au stress de la cellule. En effet, il a été démontré que les mitochondries subissent une fission pour faciliter la mitophagie, l’élimination sélective des fragments mitochondriaux. Par conséquent, seules les mitochondries à respiration active et non dépolarisées sont laissées dans le système cellulaire 3,4. La fusion, cependant, se produit comme un moyen d’augmenter la sortie ATP du réseau en cas de besoin accru 5,6. De plus, il a également été démontré que la fission et la fusion jouent un rôle important dans la partition et la protection de l’ADN mitochondrial 7,8. Il convient de noter que l’étendue de la fission et de la fusion nécessite un contrôle homéostatique minutieux pour assurer un réseau mitochondrial sain, car il a été démontré que trop ou trop peu de l’un ou l’autre processus est préjudiciable.

Il a été démontré qu’une fission excessive conduit à un réseau mitochondrial fragmenté avec une diminution ultérieure des niveaux d’ATP dans la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et les tauopathies 9,10,11, et de faibles niveaux de fission peuvent conduire à une accumulation de mitochondries dépolarisées, conduisant à des symptômes semblables à ceux de la maladie de Parkinson12. On sait que l’hyperfusion du réseau se produit en période de stress pour augmenter la production d’ATP. Cependant, il a été démontré que le fait d’exister dans cet état pendant des périodes prolongées augmente les niveaux de ROS et l’activité de l’autophagie, entraînant l’apparition de la mort cellulaire 9,12.

Il devient donc clair que la compréhension de l’état du réseau mitochondrial offre des informations clés pour comprendre l’état de la cellule, et donc de l’organisme. L’importance évidente de comprendre le réseau mitochondrial dans le contexte de la santé et de la maladie, sa capacité à subir des événements de fission et de fusion, et leur impact sur la santé cellulaire est ce qui a motivé le développement de ce protocole et des outils d’analyse associés. Plus précisément, les outils qui permettent de caractériser la dynamique mitochondriale sont largement limités et mal décrits dans la littérature.

La morphologie mitochondriale est généralement déterminée à l’aide de la microscopie confocale suivie d’une analyse informatique, qui nécessite que les micrographies brutes subissent un certain degré de traitement pour améliorer leur qualité d’évaluation, car cela décrit le mieux l’organisation mitochondriale. De cette façon, les utilisateurs peuvent déterminer de nombreux résultats morphométriques du réseau mitochondrial, tels que le nombre, le volume, la longueur et le rapport d’aspect 13,14,15. Les utilisateurs peuvent utiliser des micrographies 2D ou 3D pour les évaluations morphologiques, bien que l’analyse 3D offre une plus grande précision et une meilleure perspicacité puisque le réseau mitochondrial est constitué de structures 3D. Dans le but d’analyser la fission et la fusion, il est recommandé d’utiliser des micrographies avec un axe z, car cela compense le mieux la tridimensionnalité du réseau mitochondrial16.

De nombreuses études impliquent la catégorisation des mitochondries en états fragmentés, filamenteux ou intermédiaires comme moyen de décrire le réseau16,17. L’analyse 3D est particulièrement bénéfique en raison des différentes formes que prennent les mitochondries dans la cellule. L’ajout de la 3dimensionnalité à son étude donne confiance, en particulier au nombre de mitochondries, car les mitochondries sont susceptibles de se déplacer vers le haut ou vers le bas le long d’un axe z. MEL est un plugin ImageJ qui dépend des images capturées en3D 18. Ici, nous avons utilisé des cellules neuronales de l’hippocampe de souris GT1-7 colorées avec TMRE et Hoechst pour visualiser le réseau mitochondrial ainsi que le noyau de la cellule. Les cellules ont ensuite été placées dans un pipeline de prétraitement pour améliorer la qualité des micrographies en vue de l’analyse d’images.

De nombreuses techniques ont été mises à disposition pour déterminer la morphologie mitochondriale sur la base de métriques statiques. Peu d’entre eux incluent des activités de fission et de fusion et permettent de capturer quantitativement le comportement dynamique des mitochondries 13,19,20,21. Ici, nous décrirons un protocole d’amélioration de l’image avant la détermination des caractéristiques du réseau, en mettant l’accent sur la fission mitochondriale et l’activité de fusion. Nous démontrerons comment cette technique peut compléter les méthodes précédemment publiées pour déterminer la morphologie mitochondriale.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Traitement cellulaire et acquisition de microscopie

  1. Culture de cellules GT1-7 dans 8 boîtes de chambre dans du DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de Penstrep (milieu complet). Laissez les cellules se fixer pendant la nuit, puis traitez-les avec 2,5 mM de chlorhydrate de metformine fabriqué dans du DMEM avec 10 % de FBS pendant 72 h, en veillant à remplacer le milieu toutes les 24 h. Co-traiter les cellules avec 10 μM CCCP 6 h avant l’imagerie et 400 nM de bafilomycine A1 (Baf) 4 h avant l’imagerie.
    REMARQUE : Cela peut être fait avec n’importe quelle lignée cellulaire eucaryote de votre choix.
  2. Avant l’imagerie, préparez un cocktail de milieux complets préchauffés contenant 5 nM Hoechst et 100 nM TMRE.
  3. Remplacer le milieu de traitement cellulaire par le cocktail d’imagerie et laisser reposer 10 min avant l’imagerie.
    REMARQUE : En raison de l’activité dynamique des mitochondries, les cellules doivent être imagées à l’aide d’un microscope avec une chambre d’incubation réglée à 37 °C et 5 % de CO2.

2. Imagerie

  1. Image des cellules avec un grossissement de 100x avec une NA de 1,4.
  2. Ajustez la puissance du laser de manière à ce qu’elle soit suffisamment faible pour éviter le photoblanchiment, ~2 %. Assurez-vous que la vitesse de numérisation est élevée. Capturez des images à une résolution de 512 x 512.
  3. Réglez les intervalles de tranche Z entre des incréments de 0,25 μm. Pour suivre ce protocole, imagez les cellules de telle sorte qu’elles soient constituées de 10 piles Z. Acquérez cinq intervalles de temps sans aucun intervalle entre l’acquisition d’une pile Z.
    REMARQUE : Une fois optimisé, ce protocole ne doit pas être ajusté entre les groupes de traitement ou les groupes d’expérience, car les macros répertoriées ici nécessitent que le protocole d’imagerie soit normalisé dans toutes les cellules.

3. Évaluation computationnelle

REMARQUE : Tout le traitement ultérieur a été effectué à l’aide d’ImageJ v1.53t. Le plugin MEL, ainsi que les modules de support, se trouvent à l’https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin, tandis que toutes les macros utilisées se trouvent à https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections.

  1. Préparation de l’image
    1. Ouvrez le fichier brut dans ImageJ.
    2. Pour recadrer plusieurs cellules à partir d’une seule micrographie, commencez par dupliquer l’image jusqu’au nombre de cellules uniques à analyser.
    3. Utilisez l’outil de synchronisation des fenêtres, l’outil de dessin à main levée et l’ajustement des couleurs pour dessiner une région d’intérêt autour d’une cellule d’intérêt où il y a plusieurs cellules dans un champ de vision (figure supplémentaire S1).
    4. Cliquez sur Modifier | Dégagez l’extérieur.
    5. Séparez les canaux rouge et bleu l’un de l’autre et enregistrez le canal mitochondrial sous la forme d’un . Fichier Tiff.
  2. Génération et déconvolution de fonctions d’étalement de points
    1. Pour générer une fonction d’étalement de points (PSF), utilisez le plug-in PSF generator à l’aide d’informations micrographiques intégrées. Aller aux plugins | PSF Generator pour ouvrir le plugin. De plus, accédez à Image | Afficher les infos... ou appuyez sur I pour ouvrir les informations de l’image et faites défiler vers le bas. À l’aide de la taille et de la profondeur du voxel, dans la boîte d’informations d’affichage, modifiez la taille de pixel XY à 166,1 nm et le pas de Z à 200 nm. Modifiez la longueur d’onde à 568 nm, la taille XYZ pour correspondre à une résolution d’image de 512 x 512 et une pile Z de 10 tranches Z (figure supplémentaire S2).
    2. Aller aux plugins | Macros | Modifier | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm.
    3. Modifiez les lignes d’entrée et de sortie et appuyez sur exécuter (Figure supplémentaire S3).
  3. Amélioration du contraste et du flou de l’image
    1. Aller aux plugins | Macros | Modifier | Prétraitement.ijm.
    2. Dans les macros Preprocessing.ijm , utilisez une soustraction d’arrière-plan avec un rayon de balle roulante égal à 6. Définissez Sigma Filter Plus de telle sorte que le rayon soit égal à 1, que les pixels utilisés soient égaux à 2 et que la fraction minimale de pixels soit égale à 0,2, le plugin étant sensible aux valeurs aberrantes. Ajustez les paramètres CLAHE de sorte que la taille de bloc soit de 64 ; définissez les groupes d’histogramme sur 256, la pente maximale sur 2,5 et le gamma sur 0,8.
      REMARQUE : Tous ces paramètres ont été optimisés pour nos ensembles de données, et les valeurs doivent être optimisées pour d’autres ensembles de données avant de s’appliquer. Le filtrage Sigma est appliqué pour lisser l’image et fusionner efficacement les pixels à proximité afin d’assurer des structures cohérentes. Un contraste local est appliqué pour augmenter le contraste entre les pixels clairs et sombres et, associé à un changement de gamma, améliore la présence des structures mitochondriales tout en minimisant les pixels d’arrière-plan.
    3. Remplacez la ligne d’entrée par le dossier contenant les micrographies qui ont subi une déconvolution (figure supplémentaire S4).
    4. Cliquez sur Exécuter.
  4. Seuillage d’image
    REMARQUE : Bien que les utilisateurs puissent utiliser n’importe quel outil de seuillage de leur choix, nous recommandons le plugin de seuillage adaptatif de Qingzong Tseng (https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold).
    1. Ouvrez un fichier d’intérêt qui a été modifié par les macros Preprocessed.ijm dans ImageJ.
    2. Allez dans Plugins | adaptiveThr.
    3. Définissez le seuil local sur Moyenne pondérée et la taille du bloc de pixels selon les préférences de l’utilisateur.
      REMARQUE : La taille des blocs de pixels doit être maintenue cohérente entre les cellules, car cette valeur a un impact sur les évaluations dimensionnelles mitochondriales telles que le volume ou le rapport hauteur/largeur.
    4. Pour optimiser le temps, cliquez sur l’aperçu et ajustez la taille du bloc de manière à ce que le plus grand nombre possible de mitochondries soient clairement incluses. Ajustez également la valeur de soustraction pour chaque cellule afin d’éliminer l’arrière-plan inutile. Enregistrez les fichiers micrographiques dans les dossiers associés à la valeur de soustraction (figure supplémentaire S5).
      REMARQUE : Les macros Threshold.ijm incluent un filtre de taille pour éliminer les particules plus petites.
    5. Sélectionnez Plugins | Macros | Modifier | Seuil.ijm.
    6. Modifiez les lignes input_path et output_path, ainsi que blockSize, et soustrayez des lignes dans le script de macros (figure supplémentaire S6).
    7. Cliquez sur Exécuter.
  5. Détection des événements de fission et de fusion par le plug-in MEL (mitochondrial)
    REMARQUE : MEL est conçu pour traiter une séquence time-lapse de piles z composée d’un seul canal, enregistré sous la forme d’un seul Tiff à la fois. Bien que cela puisse être fait en remplaçant la ligne d’entrée par le fichier Tiff seuillé qui vous intéresse, nous allons également démontrer une méthode de traitement de plusieurs fichiers Tiff à la fois à l’aide de la fonction de concaténation dans ImageJ.
    1. Ouvrez jusqu’à 10 micrographies seuillées qui appartiennent aux mêmes conditions de traitement.
      REMARQUE : Les micrographies doivent avoir le même nombre de tranches z pour que cela fonctionne.
    2. Aller à l’image | Piles |Outils | Concaténer et appuyer sur Ok.
    3. Pour supprimer les petits points restants laissés par le seuillage, allez dans Plugins | Serveurs de fichiers d’images intégrés | Éliminez les valeurs aberrantes. Utilisez l’aperçu pour définir les tailles X et Y afin de supprimer les fragments nécessaires.
    4. Enregistrez le fichier concaténé en tant que Tiff.
    5. Aller aux plugins | Macros | Modifier | Quicktest_new.ijm et modifiez les chemins d’entrée et de sortie si nécessaire (figure supplémentaire S7).
      REMARQUE : Une fois l’opération terminée, un dossier appelé « MEL_results » se trouve dans le dossier de sortie avec tous les résultats de la MEL. Ceux-ci sont représentés par des événements de fission et de fusion détectés à chaque point temporel, et le dernier point temporel doit toujours être supprimé en raison de la manière dont MEL fonctionne18.

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Results

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Sélection des cellules appropriées
Les utilisateurs doivent savoir que le réseau mitochondrial change en fonction de l’état mitotique de la cellule. Si le noyau apparaît en forme d’haltère ou de U, ou s’il y a un espace près du noyau avec un manque de signal de fluorescence, cela peut indiquer que la cellule est proche de la mitose. Dans cet état, les mitochondries subissent probablement une fission en raison de la division cellulaire et non en raison de l’intervention thérapeutique et de son effet su...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bien qu’il existe un nombre croissant d’approches pour décrire la morphologie mitochondriale, il existe peu de techniques pour saisir correctement la dynamique mitochondriale de manière quantitative. De plus, il convient de noter que la morphologie du réseau mitochondrial ainsi que les mécanismes régissant cette morphologie sont de nature variée. Il en résulte des réseaux qui sont liés aux besoins de la cellule, allant d’une formation ramifiée pour une production d’énergie accrue à des r...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par l’Université de Stellenbosch, en Afrique du Sud, le Conseil sud-africain de la recherche médicale (SAMRC) et la National Research Foundation (NRF) d’Afrique du Sud, ainsi que par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8 plats de chambreThermoFisher#Z734853
Seuillage ajustéhttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Bafilomycine A1Laboratoires LKT#B0026
Cyanure de carbonyle chlorophénylhydrazone (CCCP)Merck#C2759
Microscope confocalCarl Zeiss AGPlate-forme super-résolution LSM780 ELYRA PS.1
Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)ThermoFisher#341956062
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma-Aldrich#F0679
Lien Githubhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad Prism v7.06
Cellules GT1-7ATCCSCC116
HoecshtSigma-AldrichN° H6024
ImageJ v1.53tFidji
Macroshttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
La metforminePharmacopée européenneM06050000
Pénicilline/streptomycine (PenStrep)Sigma-Aldrich#P4333
T25Bio-Smart Scientific#70025
TMREThermoFisher#T669
TrypsineSigma-Aldrich#T4049

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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