Suivi des protéines individuelles dans les bicouches lipidiques à l’aide de la microscopie à fluorescence

Summary

Cet article fournit une description détaillée de la création d’échantillons pour le suivi d’une seule protéine dans les bicouches lipidiques soutenues par des solides. Il explique aussi un microscope à fluorescence simple avec une sensibilité à une seule molécule et un taux d’images rapide. Enfin, nous exposons la procédure d’extraction des trajectoires à une seule protéine.

Abstract

L’observation directe est une méthode fondamentale pour la découverte et la compréhension scientifiques. L’imagerie à fluorescence à une seule molécule en accéléré permet d’observer des protéines individuelles alors qu’elles se déplacent et interagissent avec leur environnement, rendant visibles des états qui seraient normalement cachés dans les mesures d’ensemble. Le suivi à une seule protéine est particulièrement adapté à l’étude des protéines membranaires, où sa nature bidimensionnelle permet une imagerie rapide et à large champ avec une sensibilité au fluorophore unique. L’utilisation de bicouches lipidiques artificielles qui imitent les membranes où l’on trouve des protéines transmembranaires ou périphériques (comme les membranes plasmatiques ou les membranes d’organites intracellulaires de divers types cellulaires) permet de mesurer des interactions spécifiques dans des environnements proches de la nativité. Elle permet également l’ajout progressif de complexité, un composant à la fois, tout en supprimant les interférences de fond dues à la fluorescence et à la diffusion Raman. En ajoutant un contrôle de température, il devient également possible de déterminer les propriétés thermodynamiques des interactions à particules uniques. Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour la préparation des échantillons, la collecte de données, le suivi de fluorescence d’une seule molécule et l’analyse des trajectoires des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques utilisant l’Aquaporine-4. Ce travail sert d’exemple fondamental et peut être adapté à différentes protéines et compositions de bicouches.

Introduction

Dans des conditions biologiques naturelles, les protéines membranaires sont entourées d’un vaste réseau d’interactions, qui comprend d’autres protéines membranaires, des protéines dans les fluides intra- et extracellulaires, divers types de lipides et de cholestérol, des substrats ou ligands, des interactions en solution, ainsi que des interactions entre matrices extracellulaires et intracellulaires. Une approche biophysique classique pour mieux comprendre les interactions spécifiques et collectives commence par un seul composant, introduisant progressivement des composantes supplémentaires un à un jusqu’à ce que la complexité reflète l’environnement natif — une approche « diviser pour mieux régner » en biophysique. Une méthode moderne à l’échelle moléculaire pour étudier ces interactions consiste à l’observation directe utilisant l’imagerie de fluorescence à une seule molécule en accéléré afin de suivre les protéines individuelles alors qu’elles se déplacent et interagissent avec leur environnement. Dans cet article, nous décrivons les étapes fondamentales de cette approche, notamment la formation de bicouches lipidiques sur les caches de quartz et l’insertion d’une grande protéine membranaire dans ces bicouches préfabriquées, d’une manière adaptée à l’imagerie à protéine unique. Cela sera suivi d’un protocole « cheval de bataille » pour suivre des protéines individuelles dans des bicouches supportées.

Cet article décrit comment créer des bicouches lipidiques solides à support à l’aide de petites vésicules unilamellaires (SUV) qui se rompent sur les couches de quartz hydrophiles. Les surfaces de quartz sont préparées soit par un lavage à l’acide, soit par un nettoyage à l’ultraviolet (UV) de l’ozone. Les lipides utilisés pour créer les SUV devraient, lorsque possible, correspondre à la composition chimique principale de la membrane biologique d’intérêt (par exemple, l’aquaporine-4 (AQP4) se trouve dans la membrane plasmique des astrocytes et les principaux composants sont le POPC (46,4 %), le POPE (8,5 %), le PS (5,6 %), le cholestérol (30 %), le PI (2,5 %) et le SM (5,6 %) ^1,2). Pour éviter toute interaction avec le substrat solide, des additifs tels que le polyéthylène glycol (PEG) greffé sur un lipide soulèvent la bicouche de la^{surface 3,4}. La quantité de chaque additif doit être soigneusement ajustée pour éviter que la diffusion des protéines ne soit obstruée, tout en offrant suffisamment de soutien pour soulever la membrane à la surface du substrat. Les additifs comme les lipides PEGylés présentent généralement deux phases : une « phase brossage » et une « phase champignon ». La phase brosse se produit lorsque le PEG est à haute concentration, ce qui fait que le polymère se tient debout pour réduire les obstacles stériques. La phase champignon se produit à de faibles concentrations, lorsque les polymères sont suffisamment séparés pour exister sous forme de bobines aléatoires. En général, la phase brosse freine la diffusion, mais la phase champignon offre peu de soutien. La concentration entre les phases brosse et champignon est optimale, offrant un soutien avec un impact minimal sur la diffusion ^3,4.

Certaines protéines membranaires s’insèrent spontanément dans des membranes lipidiques solides, comme les P450 et la cytochrome P450 réductase⁵, tandis que d’autres doivent être insérées à l’aide de détergents, ce qui est un processus délicat. Un lavage soigneux est nécessaire pour éliminer ces détergents, ainsi que toute protéine non incorporée pouvant interagir avec le suivi des protéines individuelles – un processus qui sera décrit en détail. L’objectif principal de cet article est la préparation d’un échantillon pour le suivi à molécule unique (SMT) à l’aide de l’imagerie à fluorescence en accéléré. Cela nécessite un objectif avec un grossissement élevé et une ouverture numérique (NA) — généralement un objectif d’immersion en huile de 100x et 1,45 NA ^6,7. Elle nécessite également une caméra rapide et très sensible (EMCCD, CMOS ou ICCD) et une excitation laser. L’excitation laser doit couvrir un champ de vision suffisamment large pour mesurer de longues trajectoires protéiques, ce qui est souvent réalisé par réflexion interne totale pour créer un champ évanescent d’environ 50 μm x 100 μm, ou une épi-illumination avec des optiques de forme de faisceau (Gaussienne à top-hat) d’environ 80 μm x 80 μm⁸, ou une feuille optique très inclinée et laminée (HILO) avec un champ similaire à celui du TIRF. La microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) a l’avantage de réduire le signal de fond. Un design simple et relativement abordable de microscope TIRF est présenté ci-dessous. En ajoutant des contrôles de température, il est possible de mesurer plusieurs propriétés thermodynamiques telles que l’enthalpie, l’entropie et l’énergie libre de^{Gibbs 9}. La technique nécessite également un marquage par fluorescence de la protéine membranaire à un certain degré de marquage qui garantit que la plupart des protéines membranaires portent un marquage fluorescent.

La protéine transmembranaire d’intérêt dans cet article est AQP4. AQP4 est un canal d’eau polarisé dans les extrémités des astrocytes et d’autres zones du système nerveux^{central 10}. Elle peut transporter jusqu’à 3 milliards de molécules d’eau par seconde et est impliquée dans l’homéostasie de l’eau, la migration cellulaire, l’œdème cérébral, l’apprentissage et la formation de la mémoire grâce à la plasticité^{synaptique 11}. La dysrégulation de la fonction de l’AQP4 a été liée à diverses affections neurologiques, notamment l’œdème cérébral, la neuromyélite optique et^{l’épilepsie} 12,13,14,15. AQP4 est une protéine de 32 à 37 kD, selon son isoforme, et possède une structure quaternaire tétramérique avec huit domaines membranaires hydrophobes reliés par des boucles de jonction, un domaine N-terminal intracellulaire et un grand domaine^{C-terminal intracellulaire 16}. Il existe deux isoformes principales d’AQP4, M1 et M23 ; La différence provient de l’initiation au résidu de méthionine 1 ou de méthionine 23. Des recherches ont montré que l’isoforme M1 peut former des dyades ou des triades avec elle-même, selon son état de^{palmitoylation 9}. L’isoforme M23 s’assemble en grands agrégats protéiques appelés Réseaux Orthogonaux de Particules (OAP). Lorsqu’elle est co-exprimée, l’isoforme M1 limite la croissance de la CAO en formant un revêtement protéique périphérique autour de son extérieur 17,18,19. La dynamique de l’agrégation de la CAO peut être un facteur clé dans la modulation de la perméabilité à l’eau et de l’homéostasie dans le cerveau. Dans cet article, nous décrivons les étapes nécessaires pour suivre chaque AQP4 dans une membrane et observer les interactions protéine-protéine unique.

Protocol

1. Préparation de petites vésicules unilamellaires

1. Sortez les solutions de bouillon lipidique du congélateur et laissez-les atteindre la température ambiante.
2. Sortez une fiole propre de 10 mL du four et laissez-la refroidir à température ambiante.
3. Ajoutez 900 μL de chloroforme de qualité spectroscopique et 100 μL de méthanol de qualité spectroscopique dans la fiole froide à fond rond, puis ajoutez les quantités appropriées de chaque lipide dans le mélange. Faites tourner la fiole pour vous assurer que les lipides sont bien mélangés.
   REMARQUE : D’autres auteurs utilisent différents rapports chloroforme :méthanol, mais nous avons constaté que le meilleur ratio pour former des gâteaux lipidiques uniformes était de 9:1.
   Un tableau pour calculer les quantités correctes de lipides est fourni dans le Fichier Supplémentaire 1. Si vous préparez des lipides pour vérifier la formation de la bicouche lipidique à la surface du substrat, utilisez un lipide marqué par fluorescence.
4. Placez un connecteur de distillation sous vide au-dessus de la fiole à fond rond, comme montré à la Figure 1, et connectez-la à la conduite d’azote (appareil de séchage).
   REMARQUE : Utilisez du N₂(g) purifié et faites-le passer à travers un filtre de 0,22 μm avant de le connecter à l’appareil de séchage.
5. Allumez le N₂(g) et ajustez la pression pour que le débit soit à peine perceptible sur le dos de la main.
   REMARQUE : Mouiller le dos de la main peut aider à détecter l’évaporation.
6. Laissez l’échantillon sécher sous un débit de N₂(g) pendant 2,5 à 3 heures, en vérifiant périodiquement que l’azote continue de s’écouler. L’échantillon paraîtra probablement sec dans la première demi-heure ; Cependant, continuez à écouler de l’azote pendant 2 à 2,5 heures supplémentaires pour éliminer tout solvant restant.
   REMARQUE : L’échantillon peut également être séché toute la nuit.
7. Ajoutez 1 mL de tampon pour chaque 5,0 μmol de lipides totaux dans la fiole à fond rond.
   REMARQUE : Le tampon utilisé dans cette étude comprenait 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} et 140 mM NaCl ; c’est le même tampon utilisé tout au long de la préparation de l’échantillon.
8. Placez un bouchon en verre sur la fiole et enveloppez-la dans un film de paraffine.
9. Placez la flasque dans une collette sur un support à anneaux et immergez le fond de la fiole dans un bain d’un sonicateur réglé à 60 °C. Laissez la fiole incuber pendant 1 heure, en tournant doucement toutes les 15 minutes pour créer des liposomes multi-lamellaires, apparaissant sous forme d’une solution opaque sans lipides attachés à la fiole.
10. Après l’incubation d’une heure, allumez le sonicateur (~35 kHz) et réglez l’amplitude à son maximum de fréquence. Ensuite, déplacez la fiole dans le bain pour trouver l’endroit où l’agitation la plus forte se produit, afin que la solution se dégage et gicle à l’intérieur de la fiole. Sonice pendant 30 minutes, je cherche un passage de l’opaque à la transparence et légèrement opalescente.
11. Retirez la solution lipidique de la fiole et placez-la dans un tube de microcentrifuge, puis centrifugez à 100 000 × g pendant 1 h à 4 °C. Retirez le surnageant du tube de la microcentrifuge.
    REMARQUE : Un petit pellet peut se former au fond du tube. Si la boule est grande, jete-la et recommence.
12. Utilisez les SUV après centrifugation, conservez-les à 4 °C pendant une semaine, ou gardez-les à -80 °C avec un peu de tréhalose.
    REMARQUE : La quantité recommandée de tréhalose est de 1 mg par mL de solution lipidique. Pour des résultats optimaux, de nouveaux SUV peuvent être fabriqués chaque semaine et conservés au réfrigérateur.
    REMARQUE : Ce n’est qu’une méthode pour préparer les SUV. Outre les SUV, des vésicules unilamellaires petites, moyennes et grandes peuvent être produites en utilisant des liposomes unilamellaires géants ou par extrusion par électroformation 20,21,22,23.

2. Marquage des protéines

REMARQUE : Le marquage des protéines avec des sondes fluorescentes utilisant divers conjugués, tels que les esters et les maléimides du NHS, est bien documenté et bien compris. Cependant, le degré de marquage (DOL) est particulièrement important dans le suivi d’une seule protéine. Dans cette étude, il était essentiel de déterminer quel pourcentage de protéines transmembranaires étaient marqués et la distribution des fluorophores sur chaque tétramère AQP4.

1. Placez un tube de dialyse dans un bécher contenant 0,1 M tampon de phosphate au pH 8,3 qui a été fait passer par un filtre de 0,22 μm. Ensuite, laissez-la reposer dans le tampon toute la nuit en position inversée, permettant à la membrane de se conditionner.
2. Le lendemain, remplacez le tampon à l’intérieur du tube de dialyse par la solution protéique.
   REMARQUE : Le volume de solution protéique doit être entre 20 et 250 μL. Il devrait y avoir ~1 à 5 mg de protéines dissoutes dans la solution.
3. Une fois la protéine placée dans le tube de dialyse, laissez-la reposer inversée toute la nuit dans le tampon phosphate de 0,1 M.
4. Après la dialyse, transférez la protéine dans un tube de microcentrifuge.
5. Préparez un nouveau tube de dialyse en répétant l’étape 2.1.
6. Préparez le colorant NHS en déposant quelques grains (3-4) sur un petit morceau de papier de pesée, puis transférez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et dissoudrez-le dans 100 μL de DSMO. Suivez avec deux dilutions 10 fois de 1 mL en DMSO, en utilisant la dilution finale pour déterminer les concentrations de chaque échantillon par spectroscopie UV-vis. Pour obtenir un DOL moyen de 2-3, ajoutez un excès de colorant réactif de trois molaires à la solution protéique tout en secouant doucement.
   REMARQUE : Un spectromètre UV-vis standard suffira à cet effet, bien qu’un spectromètre à petit volume soit avantageux en raison de la taille de l’échantillon.
7. Ajoutez le colorant réactif au tube de microcentrifuge contenant la protéine en volumes égaux. Une fois le colorant réactif et la protéine ajoutés, nutez pendant au moins 8 heures.
8. Après la nutation, transférez la protéine marquée dans le tube de dialyse préparé à l’étape 2.5 et placez-la dans un bécher contenant un tampon de phosphate frais. Placez une barre de brassage dans le tampon et laissez-la tourner doucement pendant 6 heures, suivie d’un échange de tampon et de 6 heures supplémentaires de dialyse.
9. Après les deux échanges de tampons, placez le tube de dialyse contenant la protéine marquée dans un bécher propre contenant le tampon final fonctionnel.
   REMARQUE : Le tampon final de travail utilisé dans cette étude comprenait 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} et 140 mM NaCl au pH 7,4.
10. Après la dialyse, mesurez le DOL à l’aide d’un spectromètre UV-vis.
    REMARQUE : Il est important de suivre les méthodes standard pour mesurer le DOL. Voici une équation pour le calcul.
    (1)
    Où l’absorbance mesurée au pic du colorant est et le pic protéique à 280 nm est . Le coefficient d’extinction de la protéine est (calculé à partir du poids moléculaire de la protéine), tandis que et sont fournis par le fabricant du colorant.

3. Préparation de bâtons de quartz de 25 mm de diamètre

REMARQUE : Voici deux méthodes différentes :

1. Lavage acide
   REMARQUE : Il existe plusieurs procédures de lavage à l’acide publiées, notamment le piranha et la gravure à base. Nous avons constaté que la procédure ci-dessous offre une surface extrêmement propre et hydrophile sans gravure, ce qui est préférable pour les études sur une seule molécule utilisant l’imagerie par fluorescence.
   1. La méthode de lavage acide nécessite une hotte thermique lors du chauffage de la solution et des équipements de protection individuels (lunettes, blouse de laboratoire, gants). Une bouteille de bicarbonate de sodium doit être disponible dans le capot en cas de déversement.
   2. Placez les couvertures dans un bécher et remplissez d’eau nanopure, de peroxyde d’hydrogène à 30 % et d’acide nitrique concentré en parts égales en volume (solution 1:1:1).
   3. Chauffez les couvertures dans cette solution pendant 30 minutes jusqu’à ce que la solution commence à bouillonner.
   4. Vérifiez la solution et mélangez en faisant doucement tourner toutes les 10 minutes pour éviter que les couches de couverture ne collent entre elles. Lors du tourbillonnement de la solution, observez les glappes glisser puis se séparer. Une fois séparés, ralentissez progressivement pour les garder séparés, permettant à la solution bouillonnante d’envelopper les engourdises.
      REMARQUE : La solution ne doit pas être chauffée trop vigoureusement, car la réaction produit de la chaleur. Ajustez la plaque chauffante pour qu’elle fasse un léger bouillonnement, généralement au réglage le plus bas. À ces réglages, la solution reste à ~70 °C. Le peroxyde d’hydrogène frais est également recommandé.
   5. Une fois 30 minutes écoulées ou lorsque la solution cesse de bouillonner, laissez la solution 1:1:1 refroidir à température ambiante, puis rincez soigneusement les bâtons de protection avec de l’eau purifiée en faisant doucement tournoyer.
2. UV Ozone
   1. Nettoyez les couches de quartz avec du n-hexane, puis du méthanol, en utilisant des mouchoirs de lentille.
   2. Placez les gaines dans un nettoyant UV à l’ozone avec la surface à traiter orientée vers la lampe.
   3. Faites circuler l’oxygène dans la chambre à 5 psi pendant 5 minutes ; Ensuite, coupez le flux d’oxygène.
   4. Ensuite, allumez les lumières UV pendant 15 minutes, et laissez les couvertures reposer au moins 10 minutes pour laisser s’échapper l’ozone.
   5. Après avoir utilisé l’une ou l’autre méthode de nettoyage, assurez-vous d’utiliser immédiatement les couvertures nettoyées. Si vous utilisez des engoboles déjà nettoyées, répétez le processus pour régénérer la surface.
      REMARQUE : L’ozonation UV nécessite une circulation constante pour éliminer l’ozone de l’air. Le système doit être placé sous un tuba de traitement d’air ou dans une hotte à fumée.

4. Formation bicouche et incorporation d’AQP4 dans une membrane bicouche

REMARQUE : Le tampon utilisé dans cette étude comprenait 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} et 140 mM NaCl au pH 7,4.

1. Placez la gaine fraîchement nettoyée dans un porte-échantillons de 25 mm à l’aide d’un tube d’objectif SM1 de 1/4 de pouce. Ensuite, découpez un joint de parafilm double couche de 8 mm de diamètre et positionnez-le au centre du porte-échantillon (voir Figure 3).
2. Appliquez une gouttelette de 50 μL des SUV au centre du joint de 8 mm, scellez-le, puis incubez à 37 °C pendant 1 heure.
   REMARQUE : Cela permet aux liposomes de fusionner avec la surface hydrophile du quartz et de se rompre, formant une bicouche continue.
   Il est très probable que la quantité de liposomes ajoutés à la zone du joint puisse varier, et qu’un joint plus grand nécessite plus de liposomes pour former une bicouche continue. Cependant, les quantités spécifiées à l’étape 4.2 favorisent presque toujours la formation d’une bicouche continue.
3. Après l’incubation, rincez l’échantillon à l’aide d’une pipette pour retirer la solution. Ensuite, ajoutez 50 μL de tampon frais à la bicouche. Ensuite, répétez le processus un total de 10 fois.
   REMARQUE : Il est crucial que la pointe de la pipette ne touche pas la bicouche lipidique et qu’il reste une solution pour maintenir la bicouche hydratée. Lorsque vous amenez la pointe au sommet de la goutte, vous verrez le contact avec elle. Vous pouvez retirer la solution sans endommager la bicouche en maintenant un contact minimal avec la surface de gouttelette. Finalement, la gouttelette s’inverse et se déplace vers le joint ; C’est le moment idéal pour arrêter d’enlever la solution. La lumière réfléchie devrait changer à ce stade et peut servir de signal pour s’arrêter. Si vous craignez d’enlever trop de solution, baissez le réglage de la pipette pendant le lavage pour laisser une quantité confortable de tampon au-dessus de la bicouche lipidique.
   L’intégrité de la formation de la bicouche lipidique dans ces conditions peut être évaluée à l’avance grâce à la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Cela nécessite d’avoir un composant dans le mélange lipidique marqué^{fluorescentement} 6,7,24,25.
4. Après avoir terminé le lavage final, retirez à nouveau le tampon et ajoutez une aliquote de 50 μL de la protéine désirée dans un détergent à sa concentration micellaire critique ou en dessous. Prévoyez au moins 1 h pour l’incorporation des protéines à 37 °C.
   REMARQUE : La lessive ramollira doucement la bicouche et aidera la protéine à s’intégrer à la membrane. Dans ce protocole, la lessive utilisée était de 50 μM de n-Dodécyl-bêta-D-thiomaltoside (DOTM), un détergent non ionique, et la concentration en protéines était de 2 nM.
5. Après une heure, rincez l’échantillon avec un tampon pour éliminer toute protéine et détergente non incorporée.
6. Ajoutez 5 mg de billes de polystyrène de condition (Bio-perles) à l’échantillon, laissez reposer au moins 1 heure avant de retirer. L’échantillon est alors prêt pour l’imagerie (voir ci-dessous).

5. Additif antifondu

1. Dissoudre 5 mg de Trolox et 80 mg de D-glucose dans 10 mL de tampon (voir ci-dessus). Secouez et agitez jusqu’à ce qu’il ne reste plus de solides. Nutate toute la nuit dans l’obscurité, puis filtre la solution à travers un filtre de 0,22 μm. Préparez du neuf chaque semaine.
2. Dissoudre 6,5 mg de glucose oxydase (1650 U) et 8 μL de Catalase (29 200 U/mL en tampon) dans 92 μL de tampon. Mélangez la solution doucement sans vortex, puis centrifugez et transférez le surnageant dans un nouveau tube. Conserver à 4 °C et protéger de la lumière.
   REMARQUE : Cette solution peut être conservée au réfrigérateur pendant plusieurs mois ; Cependant, si un trouble apparaît, jetez-le et préparez une solution fraîche.
3. Mélangez 99 μL de solution de 5,1 avec 1 μL de l’étape 5,2 dans un nouveau tube. Après le rinçage final de l’échantillon, ajoutez la solution antifade sur l’échantillon (appelée solution d’imagerie).
   REMARQUE : Les solutions antifade peuvent modifier les fonctions des protéines transmembranaires ; Il est important de vérifier la compatibilité avec le système.

6. Installation et réglages du microscope

REMARQUE : Un microscope TIRF personnalisé a été utilisé pour cette étude sur une seule molécule. Cette section décrit les principaux composants et les techniques d’alignement des clés pour un microscope à fluorescence basique adapté à l’imagerie rapide en accéléré (Figure 4), qui est un instrument fiable.

1. Utilisez un laser He :Ne 633 nm pour exciter les échantillons. Le laser passe à travers un filtre passe-bande et une plaque d’onde de 1/4 pour affiner la ligne laser et convertir l’excitation de la lumière polarisée linéairement en lumière polarisée circulairement.
   REMARQUE : La polarisation circulaire réduit l’effet de l’orientation de la sonde.
2. Le faisceau passe à travers une lentille de 300 mm et un filtre de ligne laser de 633 nm, se réfléchit sur un miroir dichroïque passe-long de 633 nm, et est focalisé sur l’arrière d’un objectif de microscope à huile 100x et 1,45 N/A. Alignez la poutre pour qu’elle traverse en douceur le centre de l’objectif et reste droite lors de la sortie.
   REMARQUE : À ce stade, le microscope est configuré pour l’épifluorescence (épi). Une petite quantité de lait en poudre peut être ajoutée à une cuvette à fond transparent. La cuvette est ensuite placée sur l’objectif du microscope avec une goutte d’huile d’immersion entre les deux. Cela permet d’observer que le faisceau traverse directement l’objectif.
3. L’émission des protéines marquées fluorescentement passe par le miroir objectif dichroïque, le filtre passe-long et un objectif de 300 mm, puis est imagée sur une caméra EMCCD. Utilisez des objectifs tubulaires à plus longue focale pour agrandir les images sur l’appareil et améliorer la super-localisation, ce qui est bénéfique pour les protéines et agrégats transmembranaires à mouvement lent. Assurez-vous de calibrer les pixels de la caméra en nanomètres.
   REMARQUE : Cependant, un grossissement de 1x est obtenu avec l’objectif à tube spécifié par le fabricant de l’objectif, ce qui augmente le rapport signal/bruit en focalisant la fluorescence sur moins de pixels. Les distances focales courantes incluent les objectifs de 200 mm, 180 mm, 165 mm et 164,5 mm. Nous recommandons d’utiliser une cible à grossissement de l’USAF de 1951. En utilisant un objectif de 300 mm dans cette configuration, une calibration des pixels de 74 nm a été mesurée à un grossissement total de 170x.
4. Contrôlez la température de l’échantillon à l’aide d’un collier objectif et d’un porte-échantillon équipé d’un chauffage/refroidisseur^{Peltier 26}.
   REMARQUE : Maintenir une température stable est crucial pour assurer la stabilité thermique du microscope et permettre des mesures précises dépendantes de la température ainsi que la mise au point de l’instrument.
5. Les actionneurs piézoélectriques déplacent l’échantillon dans les directions XYZ. Une fois l’échantillon nettoyé, ajustez le faisceau vers le bord de l’objectif du microscope (voir Figure 4) en utilisant l’étage fixé au miroir tournant final jusqu’à obtenir un angle critique. Cela génère un champ d’excitation évanescente. Le microscope est maintenant placé en TIRF.
   REMARQUE : Vous pouvez déterminer que le microscope est en TIRF lorsque la rétro-réflexion du laser est une raie (et non un tache), et que le fond de fond de l’échantillon diminue en intensité et s’allonge.

7. Collecte de données

REMARQUE : La caméra doit être configurée pour une collecte rapide de données.

1. Régler la vitesse verticale de décalage des pixels à environ 600 ns et overclocker la tension d’horloge verticale (généralement +4). Ensuite, réglez l’affichage horizontal des pixels à son réglage maximal (30 MHz à 16 bits dans cet exemple). Ajustez le gain du préamplificateur à 2 et configurez la sortie de l’amplificateur pour la multiplication des électrons. Enfin, réglez le gain du multiplicateur d’électrons à son niveau maximal.
2. Réglez l’exposition à 25 ms. À 25 ms, assurez-vous que la fréquence d’images est légèrement plus longue (25,802 ms sur l’appareil utilisé ici).
3. Ajustez la puissance du laser pour que le signal soit clairement au-dessus de l’arrière-plan.
   REMARQUE : Ajuster la puissance du laser peut être un défi. Trop haut, et la sonde blanchit trop vite ; trop bas, et le rapport signal/bruit rend le suivi difficile. Nous recommandons de régler la puissance de façon à ce que le signal dépasse le fond de 3 à 5 fois pour les particules ayant le signal le plus faible. La section 2 explique pourquoi la luminosité moléculaire montre une distribution.
4. Collectez suffisamment de données pour fournir au moins 1 000 pistes par échantillon.

8. Analyse de suivi

REMARQUE : Dans nos laboratoires, l’analyse de suivi d’une seule particule est généralement réalisée à l’aide de scripts personnalisés dans MATLAB basés sur les travaux de Crocker et Grier et modifiés par les^{auteurs 3,26,27}. Voici une description utilisant ImageJ, un logiciel disponible gratuitement pour la communauté scientifique. Les deux méthodes produisent des résultats identiques.

1. Faites des ensembles de données de recadrage à une taille cohérente puis corrigez l’arrière-plan avec ImageJ.
   REMARQUE : Si les données collectées sont les mêmes entre les ensembles, il n’est pas nécessaire de recadrer. Cela se fait généralement uniquement si la région d’intérêt du capteur de la caméra a changé entre les collectes de données. Les capacités d’ImageJ peuvent être considérablement étendues avec des plugins. Une option consiste à installer et utiliser FIJI, qui est ImageJ fourni avec un ensemble de plugins standards. Parmi ces plugins figure TrackMate, qui sera utilisé pour le protocole^{ici 28,29}.
   Le site ImageJ Wiki propose des guides et des exemples pour de nombreux plugins. Il inclut également des tutoriels vidéo.
2. Dans FIJI, glisser-déposer le film ou le fichier empilé *.tif à analyser (voir Fichier supplémentaire 2).
3. Voici les détails de calibration des pixels. Dans l’onglet Analyser , sélectionnez Définir l’échelle et appliquez la calibration pixel à distance pour l’instrument.
4. Sauvegardez une copie pour suivre les éventuels changements par rapport à l’original.
5. Soustrayez l’arrière-plan de la fenêtre choisie et appliquez-le à la copie enregistrée des données originales. Dans l’onglet Processus , choisissez Soustraire Arrière-plan.
   REMARQUE : Cela sera optimisé en fonction des données. Un bon point de départ est d’utiliser une « boule roulante » plus grande que les particules à imager.
6. Dans l’onglet Plugins , sélectionnez Suivi | TrackMate. Cela ouvre la fenêtre de dialogue TrackMate , qui guide l’utilisateur à travers le processus de suivi.
   REMARQUE : Une fois le suivi terminé, il est possible d’exporter les pistes pour une analyse ultérieure en dehors d’ImageJ.

9. Traitement des données

REMARQUE : Il est abordé ici comment traiter les données représentatives et comment calculer les distributions de taille de pas et obtenir une constante de diffusion moyenne.

1. Glisser-déposer la pile d’images dans FIJI ; Ensuite, applique la calibration (74 nm/pixel).
2. Soustrayez l’arrière-plan en utilisant la soustraction de la boule roulante d’une largeur de 5 pixels. Recadrez le champ en quatre sections séparées de 11 μm x 11 μm et analysez séparément.
   REMARQUE : Cela vise à minimiser toute variance de seuil due au champ d’excitation lors du suivi des protéines membranaires.
3. Lance le plugin TrackMate . Vérifiez que l’étalonnage est appliqué aux pixels (voir Fichier supplémentaire 3) et que le temps couvre la plage souhaitée.
   1. Dans TrackMate, sélectionnez le Laplacien de Gaussienne (LoG) comme méthode de détection des particules, avec un diamètre estimé de 350 nm en utilisant le filtre médian préprocédé. Cliquez sur le bouton Aperçu pour vérifier que les particules détectées sont raisonnables.
      REMARQUE : Certaines particules peuvent clairement être en arrière-plan ; Ne vous inquiétez pas pour ces éléments — ils seront éliminés à l’étape suivante.
   2. Lorsque les paramètres de comptage sont satisfaits, traitez le reste de la pile, suivi du seuil. Utilisez le seuil automatique ou faites glisser la boîte de sélection pour ajuster le seuil.
   3. Après avoir choisi comment visualiser les particules détectées, sélectionnez la méthode de suivi : Advanced Kalman Tracker pour ce jeu de données, avec les réglages suivants : 350 nm pour les rayons de recherche et un écart maximal de trame de 2 images.
      REMARQUE : Il est également possible d’ajouter des pénalités, du séparation de voie et de la fusion de voies. Pour cet ensemble de données, seul le suivi a été effectué.
   4. Décidez comment filtrer et visualiser les pistes.
      REMARQUE : Dans ce jeu de données, seules les taches détectées sont affichées (voir Fichier Supplémentaire 4).
   5. Après avoir traité les pistes individuelles, exportez les données de suivi sous forme de fichier XML pour une utilisation dans un logiciel de retouche de feuilles de calcul (voir Fichier supplémentaire 5).

Results

Comme décrit dans la section 2 du protocole, les lysines ont été marquées à l’aide de NHS-esters conjugués à une molécule de colorant fluorescent (NHS-colorant). Après conjugaison à la protéine, mesurez le DOL avec un spectromètre UV-Vis. Pour cette expérience, le DOL des tétramères AQP4 était de 4,12. Ensuite, déterminez la probabilité que chaque tétramère AQP4 ait au moins une molécule de colorant en utilisant la distribution de Poisson fournie ci-dessous.

(2)

Où P est la probabilité que chaque AQP4 soit marqué, en utilisant l’équation 2, la probabilité que chaque tétramère AQP4 soit accompagné d’une marque fluorescente est de 98 %. La distribution des marqueurs par tétramère est illustrée à la Figure 2 et reflète la distribution de luminosité observée dans l’échantillon.

Le rapport signal/bruit obtenu dans ces données d’exemple était 8 à 9 fois au-dessus du fond pour un seul fluorophore et de 15 à 20 fois plus pour les particules les plus brillantes. Cette variance provient de la position dans le faisceau d’excitation et du DOL décrite à l’étape 2 du protocole.

Dans le fichier XML généré, les colonnes d’intérêt sont J, K, L et M, qui correspondent respectivement à l’ID du nombre de particules, au référentiel dans lequel la particule a été détectée, à la position X de la particule et à la position Y de la particule (voir Fichier supplémentaire 6). Dans la deuxième feuille du fichier, la distribution de la taille des pas et le coefficient moyen de diffusion sont calculés, où les tailles de pas sont les distances parcourues par une particule entre les référentiels, et la diffusion moyenne est donnée par l’équation 3 :

(3)

Où D_moyenne est le coefficient moyen de diffusion, et Δt est le taux d’images par seconde. Cette équation suppose un mouvement brownien, généralement valable pour de petits déplacements et peut être confirmé en analysant le déplacement moyen-quadratique en fonction du temps à partir d’un échantillon de pistes^{individuelles 3,30,31}.

Un histogramme des tailles de pas montre une distribution des particules diffusant, ce qui peut être attribué à des POA de tailles différentes (Figure 5).

Figure 1 : Appareil de séchage lipidique. L’appareil se compose d’une fiole à fond rond de 10 mL avec un connecteur de distillation sous vide. L’azote entre à basse pression par un filtre à seringue de 0,2 μm avec une aiguille attachée à un capuchon de synthèse jaune, relié à un connecteur de distillation sous vide. La pression est relâchée par un tube tygon fixé à une seringue à l’aide d’une aiguille à couper. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Distribution attendue des marquants fluorescents sur chaque unité AQP4 à l’aide de l’équation 2. Le nombre le plus probable de fluorophores est 4, et 98 % de tous les AQP4 auront une marque fluorescente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Assemblage porte-échantillons. L’ensemble est constitué d’un tube de lentille SM1 de 1" dont les filetages mâles sont retirés et biseautés pour éviter toute interférence avec l’objectif du microscope. Comprend un joint de couverture en quartz et un joint en parafilm. L’ensemble est fixé par un anneau de retenue SM1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Microscope. Sur le côté droit se trouve un schéma simplifié du microscope ; La ligne verte montre la lumière d’excitation provenant du laser. En partant de la droite, la lumière laser passe à travers une plaque d’onde de 1/4, puis est focalisée par une lentille de 300 mm. La lumière est réfléchie par un miroir dichroïque à passage long sur l’objectif, où elle est focalisée sur l’ouverture arrière. En utilisant un miroir de translation pour déplacer le faisceau d’excitation, le faisceau est positionné au bord de l’ouverture de l’objectif, créant un champ évanescent dans l’échantillon. La lumière nette émise est captée par l’objectif et est représentée par la ligne rouge. La lumière émise passe ensuite à travers le filtre dichroïque, puis un filtre passe-long, et est focalisée par un objectif de 300 mm sur l’appareil, offrant un grossissement optique de 1,7x (170x de grossissement total de l’objectif et de l’objectif tubulaire). Sur le côté gauche, une image du microscope. Notez que des miroirs pivotants supplémentaires sont utilisés pour positionner correctement le laser. Simultanément, le bras de détection est organisé pour maximiser la collecte de photons provenant des protéines transmembranaires marquées par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Histogramme des tailles de pas. La ligne bleue avec des cercles rouges est un histogramme de toutes les tailles de pas. La ligne noire convient à plusieurs coefficients de diffusion. La distribution de probabilité par taille d’égrés est donnée par : où f_i est la population fractionnaire de chaque type de particule diffusante, en supposant que chacune subit un mouvement brownien. L’histogramme et l’ajustement montrent une distribution hétérogène de particules se déplaçant plus lent et plus rapidement, attribuée à une distribution de multiples tailles de POAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fichier supplémentaire 1 : Calculateur de tableau utilisé pour déterminer les compositions en mol %, les quantités totales de lipides, et les composants fluorescents/FRAP optionnels pour la préparation du SUV. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Pile d’images brutes à fluorescence à une seule molécule utilisée pour le suivi de trajectoire (fichier source du tutoriel TrackMate). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Aperçu animé des données brutes de fluorescence à une molécule montrant l’intensité et le fond avant le traitement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Animation des chemins de particules filtrés (post-seuil) montrant des trajectoires représentatives d’AQP4 dans le temps. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5 : Superposition animée montrant le suivi complet des particules en champ des molécules AQP4 utilisant la sortie TrackMate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Tableau montrant les coordonnées de trajectoire extraites et les distributions de taille de pas calculées utilisées pour l’analyse de diffusion. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cet article, nous présentons une méthode de suivi à particule unique pour observer directement les protéines membranaires individuelles lorsqu’elles traversent une membrane lipidique solide et interagissent entre elles. AQP4 a été choisi comme exemple représentatif en raison de sa capacité à former des auto-assemblages dynamiques régulés par ses différentes isoformes 32,33,34. Ci-dessus, nous présentons une méthode fiable pour la préparation de l’échantillon et des paramètres clés pour suivre les protéines à membrane unique à des échelles de temps de millisecondes. Les étapes incluent : (1) la préparation des SUV, (2) la détermination du niveau approprié de marquage fluorescent, (3) la préparation de supports solides, (4) la création d’échantillons de protéines transmembranaires dans une bicouche lipidique solide, (5) la préparation d’agents antidécolorants, (6) la construction d’un microscope simple à molécule unique, (7) la collecte de données de suivi d’une seule molécule, et (8) l’analyse des données de suivi à l’aide d’ImageJ.

La méthode étape par étape décrite est conceptuellement simple ; Cependant, chaque étape critique comporte ses propres pièges et limitations. Parmi celles-ci, la préparation de l’échantillon est la plus difficile (étapes 1 à 5). Par conséquent, plusieurs détails doivent être pris à l’esprit. La première est de créer une bicouche lipidique soutenue par un solide. Il existe trois méthodes principales : (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) fusion et rupture d’un SUV, et (3) spin-coating 35,36,37,38,39. Chaque méthode présente ses avantages et ses inconvénients. Par exemple, la méthode de Langmuir-Blodgett offre un meilleur contrôle sur les propriétés et la composition chimique des bicouches, y compris les compositions asymétriques entre les deux folioles, et permet la formation de multiples couches de manière contrôlée. Cependant, utiliser une auge LB est techniquement exigeant, chronophage et coûteux à obtenir^{pour obtenir 35}. Le spin-coating est une technique relativement simple pour créer des bicouches lipidiques ; cependant, elle tend à produire des couches multiples et nécessite un grand excès de matériau, souvent une quantité^{impraticablement grande 39}. La fusion et la rupture de vésicules sont des processus simples qui ne nécessitent qu’une petite quantité de matériau. Cependant, la création d’une surface hydrophile est cruciale, et certaines compositions lipidiques forment plus facilement des bicouches par fusion vésiculaire que d’autres (par exemple, dans notre laboratoire, nous avons constaté que les vésicules à charge nette négative forment des bicouches uniquement avec l’ajout de cations divalents et des temps d’incubation prolongés)⁴⁰. Outre l’établissement d’une surface hydrophile (étape 3), d’autres considérations importantes lors de la formation d’une bicouche solide par fusion vésiculaire incluent le lavage de la nouvelle bicouche formée avant et après l’incorporation de la protéine membranaire. Le lavage pré-insertion élimine l’excès de SUV et les vésicules multilamellaires plus grandes (MLV), tandis que le lavage final après insertion membranaire élimine les protéines non incorporées. Un lavage insuffisant peut introduire des signaux de fond lors des études de suivi.

Nous avons examiné de nombreux détergents pour déterminer s’ils conviennent à l’insertion transmembranaire de protéines dans des bicouches lipidiques solides, notamment C12E9, Tween-20, TritonX-100, et bien d’autres. Notre détergent préféré est le DOTM car il est facile à retirer et le plus doux pour la membrane (moins susceptible de perturber l’intégrité de la membrane). La quantité de protéines ajoutée est cruciale. Trop de pistes, et il sera impossible d’observer les pistes uniques. Lors de l’adaptation de cette procédure à d’autres protéines transmembranaires, la quantité devra être ajustée par essais et erreurs. Cependant, les quantités données dans cette procédure constituent un excellent point de départ. La quantité de détergent doit être maintenue à la concentration micellaire critique ou en dessous ; sinon, la bicouche sera solubilisée et retirée du substrat de quartz.

L’insertion des protéines membranaires dans la bicouche lipidique supportée doit être optimisée pour chaque ensemble de conditions expérimentales. Cependant, il existe quelques méthodes courantes pour y parvenir, notamment l’utilisation de protéoliposomes et l’incorporation directe de protéines membranaires dans une bicouche⁴¹ préformée. Un protéoliposome est un liposome, comme un SUV, avec une protéine intégrée à l’intérieur. Ces protéolisomes peuvent fusionner avec une bicouche lipidique solide préformée ou être incorporés simultanément avec les SUV lors de la formation^{de la bicouche 42}. La fusion provoque une rupture, libérant la protéine dans la membrane. C’est simple à mettre en œuvre, mais cela entraîne une orientation aléatoire des protéines membranaires. Cela peut entraîner des interactions fortes avec le support solide, entraînant des propriétés de diffusion différentes selon l’orientation de la^{protéine 3}. Ce protocole décrit une méthode utilisant l’incorporation directe, donnant une préférence orientée pour AQP4 et d’autres protéines membranaires présentant de grands domaines hydrophiles d’un côté de la protéine 2,5,43,44.

L’observation directe est un outil puissant utilisé dans la découverte scientifique. L’imagerie dynamique à molécule unique est particulièrement importante en biophysique membrane-protéine, où l’observation du mouvement et des interactions des protéines individuelles sert à tester des hypothèses ou à en générer de nouvelles qui décrivent mieux le comportement d’une protéine. Le protocole et les méthodes décrits ici sont idéaux pour les bicouches lipidiques solides bidimensionnelles, mais peuvent être étendus à des environnements plus complexes avec plusieurs composants², cellules^{vivantes 34,45,46,47} et trois dimensions⁴⁸. Le suivi à une seule molécule ouvre la porte à de nombreuses autres expériences, notamment le suivi à deux couleurs à une seule^{molécule 49}, le FRET à une seule molécule^50,51, et l’imagerie dynamique à super-résolution telle que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la topographie à nanoéchelle par accumulation de points (PAINT). En élargissant l’instrument pour inclure le contrôle de la température, les propriétés thermodynamiques des protéines membranaires peuvent également être^{explorées 26,43,52}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaque d’onde 1/4	Thorlabs	WPQ05M-633	Assurez-vous d’aligner le laser
Objectif 100X Oil	Olympe	12-563-659	1,45 N/D apochromatique
16:0-18:1 PC	Lipides polaires avanti	850457	Phospholipides POPC
18:0 PEG2000 PE	Lipides polaires avanti	880210	Sel d’ammonium
Objectif 300mm	Thorlabs	AC254-300-A-ML
Laser He :Ne 633 nm	Melles Griot	05-LHP-927	Peut être modifié vers d’autres sources et vers d’autres longueurs d’onde
Filtre passe-bande 633 nm	Chroma Tech	633/10X	Correspondance au laser utilisé
Filtre passe-long 655 nm	Chroma Tech	ET655lp	Modifier pour correspondre aux longueurs d’onde du colorant/laser
Andor Solis I	Andor  ;	Andor Solis I	Logiciels pour la capture d’images
ATTO 655  ;	ATTO-TEC	655 ap. J.-C.	Modification NHS-Ester, tout colorant adapté à un travail sur une seule molécule peut être utilisé. ATTO est recommandé mais Cy5/7 peut être utilisé
Biobilles SM-2 Résine	BioRad	1523922
Chlorure de calcium	Millipore Sigma	C4901
Catalase	Sigma-Aldrich	C3155-50MG	du foie bovin, de la soltion aqueuse et de GE ; 30 000 unités/mg
Chloroforme	Fisher Scientific & nbsp ;	C547-1	HPLC ou de qualité spectroscopique
Cholestérol	Sigma-Aldrich	C8667-500MG
Couvertures	ESCO Optique	R525000	Quartz 25 mm
Séparateur de faisceau dichroïque	Semrock	FF545/650-Di01-25x36	Modifier pour correspondre aux longueurs d’onde du colorant/laser
Caméra EMCCD	Andor  ;	iXon Ultra 888
Falcon Tubes 15 mL & nbsp ;	Greiner Bio-one	188261	Tubes de culture cellulaire Cellestar
Glucose oxydase	Sigma-Aldrich	G2133-50KU	de Aspergillus niger, typer VII, &ge ; 100 000 unités/g de solide (sans oxygène ajouté)
Pistolet à air chaud	Fret portuaire	56434	Utilisé pour le chauffage du parafilm, en général n’importe quel pistolet à air chaud pouvait être utilisé
HEPES	Bioréactifs de Fisher	BP310-500
Huile d’immersion à faible autofluorescence	Thorlabs	MOIL-30
Methonal	Fisher Scientific & nbsp ;	A452-1	HPLC ou de qualité spectroscopique
Tube microcentrifugeuse	VMR	525-1126	1,5 mL  ;
Micro-Pipetters	Ependorf		Divers ; 1000 & micro ; L, 100 & micro ; L et 10 & micro ; L sont suggérés
& Oslash ; Tubes d’objectif 1,5"	Thorlabs	SM1.5L10	Le filetage externe est raclé pour la préparation des échantillons
Table optique	Newport	Dépendance RPR	La taille de la table dépend de l’espace disponible
Tissus optiques	Thorlabs	MC-50E	Nettoyage de divers composants
Parafilm	Millipore Sigma	P7669	Vérifiez que rien ne présente de gaz fluorescents pendant le processus
Actionneur piézoélectrique	Newport	PZA12
Isolateurs pneumatiques de vibrations	Newport	Série I-2000	utilisé pour stabiliser la table optique en cas d’irrégularité   ;
Bain réfrigéré	Fisher Scientific & nbsp ;	Isotemp 3016
Contrôleur d’obturateur	Thorlabs	SC10	Lien avec le logiciel d’imagerie
Chlorure de sodium	Millipore Sigma	S988
Filtre Steritop	Millipore Sigma	S2GPT05RE
Pilote et contrôleur de boîte à interrupteurs   ;	Newport	PZC200	Contrôleur de scène
Filtre à seringue	J.T. Baker	SF01-98	PES 25mm 0.2 & micro ; M
Élément TEC	Thorlabs	TEC3-2.5	Utilisé pour connecter la pompe à chaleur Peltirer au porte-échantillon et au collier objectif
Régulateur de température	Ingénierie de Meerstetter	TEC-1091
Détecteur de température	Thorlabs	TH100PT
Thermistor	Thorlabs	TH10K
Dialyseur à tubes	G Biosciences	786-611	MWCO 4K
Nettoyant UV à l’ozone	Novascan	PSDP_UV	Pro Series - Digital & nbsp ;
Zoom Optics  ;	Thorlabs	SM1NR1