Modélisation des maladies mitochondriales à l’aide d’organoïdes cérébraux : un accent sur l’encéphalomyopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes semblables à ceux d’un accident vasculaire cérébral

Résumé

Les organoïdes cérébraux servent de modèle précieux pour les études sur l’encéphalomyopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes similaires à l’accident vasculaire cérébral (MELAS), offrant un aperçu de leur physiopathologie sous-jacente et fournissant une plate-forme pour le dépistage des médicaments. Les organoïdes dérivés de lignées cellulaires présentant des niveaux variables d’hétéroplasmie de gènes pathogènes présentent des différences phénotypiques significatives.

Résumé

L’encéphalomyopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes similaires à un accident vasculaire cérébral (MELAS) sont des troubles mitochondriaux le plus souvent causés par une variante m.3243A>G de l’ARNt mitochondrial^Leu. Pour étudier la physiopathologie de MELAS, nous avons généré des organoïdes cérébraux à partir de plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dérivées d’un patient porteur de la variante m.3243A>G. Ces lignées partagent un patrimoine génétique nucléaire identique mais diffèrent par leurs niveaux d’hétéroplasmie impliquant le variant m.3243A>G. Nous avons observé des différences significatives dans la taille des organoïdes, la morphologie et l’efficacité de l’induction neuronale, qui étaient corrélées avec le degré d’hétéroplasmie. Les neurones dissociés des organoïdes ont été transférés dans un système de culture 2D, ce qui est pratique et adapté au criblage de médicaments à haut débit. Les organoïdes ont également montré des différences significatives dans la formation des réseaux neuronaux, en fonction des niveaux d’hétéroplasmie. Nos résultats suggèrent que les modèles organoïdes basés sur des iPSC dérivés de patients représentent une plate-forme utile pour l’étude des mécanismes MELAS et pour le criblage de médicaments. Cette vidéo présente des méthodes complètes et conviviales, y compris des protocoles pour générer des organoïdes et évaluer les phénotypes.

Introduction

La myopathie mitochondriale, l’encéphalopathie, l’acidose lactique et les épisodes similaires à un accident vasculaire cérébral (MELAS) sont des maladies mitochondriales caractérisées par un dysfonctionnement neurologique, des épisodes similaires à un accident vasculaire cérébral et divers symptômes systémiques. La cause la plus fréquente est une variante m.3243A>G du gène de l’ARNt de la leucine mitochondriale, MT-TL1¹. On pense que cette variante altère la modification de la taurine au niveau de l’anticodon, réduisant ainsi l’efficacité de la traduction de la leucine et contribuant au dysfonctionnement mitochondrial dans MELAS ^2,3,4. Notamment, des améliorations des symptômes ont été signalées après l’administration de taurine à forte dose ^5,6. Cependant, la présence de non-répondeurs suggère que des mécanismes physiopathologiques supplémentaires, non encore identifiés, peuvent contribuer à la maladie chez les individus porteurs du variant m.3243A>G.

Pour élucider les mécanismes pathologiques causés par les variantes génétiques, il est idéal d’utiliser des modèles expérimentaux dans lesquels toutes les variables sont identiques, à l’exception de la variante causale, ce qui permet des comparaisons phénotypiques précises. Les lignées cellulaires modifiées par le génome et les modèles animaux avec des variantes corrigées sont souvent utilisés comme témoins pour les troubles des gènes nucléaires. Cependant, la réparation des variants de l’ADNmt reste techniquement difficile, même avec des technologies avancées d’édition du génome⁷. Par conséquent, l’établissement de modèles expérimentaux avec des antécédents nucléaires identiques reste un défi. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé deux lignées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dérivées du même patient avec MELAS qui ne diffèrent que par leurs niveaux d’hétéroplasmie (c’est-à-dire la proportion d’ADN mitochondrial portant le variant 8 de MT-TL1 m.3243A>G), et généré des organoïdes cérébraux comme modèle de maladie. Bien que les niveaux d’hétéroplasmie puissent fluctuer au cours du passage ou de la différenciation cellulaire, influençant potentiellement les phénotypes et provoquant une variabilité d’un lot à l’autre dans les résultats expérimentaux, les cellules dérivées de patients portant des variantes de gènes mitochondriaux restent précieuses pour l’étude de la pathogenèse de la maladie.

Dans cette étude, nous avons généré des organoïdes cérébraux à partir d’iPSC dérivées d’un patient atteint de MELAS et étudié leur physiopathologie pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie. En utilisant deux lignées d’iPSC avec des niveaux d’hétéroplasmie élevés et faibles, nous avons observé des différences significatives dans l’efficacité de l’induction neuronale, qui étaient corrélées avec le degré d’hétéroplasmie. Nos résultats suggèrent que les organoïdes cérébraux basés sur les iPSC dérivés de patients fournissent une plate-forme précieuse pour élucider les mécanismes sous-jacents à MELAS et pour faciliter le dépistage de médicaments.

Protocole

Les deux lignées iPSC (2-6 et 2-8) ont été dérivées des fibroblastes du même patient MELAS à l’aide de méthodes bien établies⁸. Ils ne diffèrent que par leurs niveaux d’hétéroplasmie. La lignée iPSC 414C2 établie à partir d’un individu en bonne santé a été utilisée comme témoin. Le protocole utilisé dans cette étude a suivi les directives du comité d’éthique de la faculté de médecine de l’Université Kitasato (#G22-02).

1. Culture cellulaire

1. Décongélation des stocks de cellules congelées
   1. Préparez des plaques à 6 puits en les enrobant de laminine selon les instructions du fabricant.
   2. Réchauffer le milieu de culture pour les CSPi exemptes de feeder contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK à 37 °C.
   3. Récupérez le flacon d’iPSC congelé dans le réservoir d’azote liquide (LqN₂) et décongelez-le rapidement dans un bain-marie à 37 °C.
   4. Transférez la suspension décongelée dans 10 mL de milieu préchauffé. Centrifuger à 120 × g pendant 5 min à température ambiante (22 °C).
   5. Retirez délicatement le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension en tapotant le tube. Ajoutez du milieu frais et des cellules de graines dans des plaques à 6 puits pré-enduites de laminine. Incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂.
2. Changement moyen
   1. Remplacez le milieu (sans inhibiteur de ROCK) tous les 1 à 2 jours.

2. Génération d’organoïdes cérébraux

1. Initiation de la différenciation (Jour 0)
   1. Retirer le milieu des plaques de culture iPSC (~70-80 % confluent). Lavez les cellules avec du PBS.
   2. Ajouter la solution enzymatique et incuber à 37 °C pendant 5 min.
   3. Ajouter un milieu pour arrêter la réaction. Transférez les cellules dans un tube de 15 ml. Centrifuger à 190 × g pendant 5 min à température ambiante (22 °C).
   4. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu de différenciation contenant 30 μM d’inhibiteur de ROCK, 5 μM de SB431542 et 2,5 μM d’IWP-2.
      REMARQUE : Le support de base est le même que celui utilisé à l’étape 1.1.2.
   5. Comptez les cellules. Semez 3 × 10³ cellules dans 100 μL par puits dans des plaques en forme de U, à 96 puits et à faible fixation. Incuber pendant 6 jours à 37 °C, 5 % CO₂.
2. Changement moyen (jour 6)
   1. Transférer les organoïdes (à partir de l’étape 2.1.5) d’une plaque de 96 puits dans une boîte de 10 cm à l’aide d’une pipette à gros calibre. Ajouter 50 μL de milieu (DMEM/F12 avec 1 % de N2, 1 % de substitut de glutamine, 1 % d’AEAN, 2,5 μM d’IWP-2, 5 μg/mL d’héparane sulfate et 1 % de PS) dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 96 puits.
      REMARQUE : Utilisez des pipettes de grand calibre tout au long des expériences lors du transfert d’organoïdes pour éviter de perturber leur structure 3D. De plus, les pipettes à 8 canaux sont utiles pour réaliser des expériences rapidement et avec précision.
   2. Prélever les organoïdes dans des tubes de 2 ml. Retirez délicatement le milieu pour ne pas aspirer les organoïdes et ajoutez 1,5 mL de DMEM/F12. Répétez l’opération 3 fois pour laver les organoïdes.
   3. Retirer le milieu et ajouter 500 μL de milieu frais dans les tubes contenant des organoïdes. Transférez tous les organoïdes dans un plat de 10 cm, puis ajoutez 5 ml de milieu pour faciliter la prise de chaque organoïde.
   4. Prélever un seul organoïde à l’aide d’une micropipette réglée à 50 μL et le transférer dans un puits de plaque de 96 puits. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les organoïdes soient transférés dans la plaque à 96 puits (volume final de 100 μL). Incuber pendant 3 jours à 37 °C, 5 % CO₂.
3. Changement moyen (jour 9)
   1. (Facultatif) Transférer les organoïdes dans un plat de 10 cm à l’aide de pipettes à 8 canaux. Sautez l’étape 2.3.1 lorsque vous utilisez des micropipettes monocanaux et passez à l’étape 2.3.2.
   2. Prélever les organoïdes dans des tubes de 2 ml. Lavez 3 fois avec DMEM/F12 à l’étape 2.2.2.
   3. Remettre en suspension dans un milieu de différenciation (DMEM/F12 1:1 et neurobasal) contenant 1 % de N2, 2 % de B27 sans vitamine A, 100 μM de 2-mercaptoéthanol (ME), 2,5 μg/mL d’insuline, 1 % de substitut de glutamine, 0,5 % de NEAA et 1 % d’extrait de membrane basale.
      REMARQUE : Préparez de petites aliquotes d’extrait de membrane basale à usage unique et conservez-les à -20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Décongelez l’extrait à 4 °C sans le laisser dépasser 8 °C, puis mélangez-le dans un milieu froid et réchauffez le milieu à température ambiante pendant environ 30 min.
   4. Transférez ~10 organoïdes par puits dans une plaque à 6 puits. Ajuster le volume final du fluide de 1 puits à 2 ml. Culture statique pendant 6 jours à 37 °C, 5 % CO₂.
4. Changement moyen (jour 15)
   1. Prélever les organoïdes dans des tubes de 15 ml. Laissez le tube intact jusqu’à ce que tous les organoïdes se soient déposés. Retirer le surnageant et ajouter un nouveau milieu de différenciation (identique à l’étape 2.3.3 mais avec B27 + vitamine A).
      REMARQUE : Habituellement, les organoïdes se déposent au fond du tube sans centrifugation. Cependant, les petits organoïdes dérivés des iPSC des patients peuvent ne pas couler efficacement. Dans ce cas, centrifugez les tubes à 120 × g pendant 3 min à température ambiante pour recueillir les organoïdes.
   2. Transférez ~10 organoïdes par puits dans une plaque à 6 puits. Cultiver statiquement pendant 15 jours à 37 °C, 5 % CO₂.
   3. Remplacez le moyen tous les 5 à 7 jours jusqu’au jour 30.

3. Dissociation des organoïdes cérébraux pour la culture 2D (Jour 30)

1. Plaques de revêtement avec de la poly-L-ornithine (PO)
   1. Préparez une solution mère d’OO en dissolvant 10 mg d’OO dans 66,7 mL de_H2O et faites de petites aliquotes à usage unique. Conservez-les à -20 °C jusqu’à utilisation.
   2. Diluer la solution mère PO 1:5 avec H₂O et enrober les plaques de culture avec la solution diluée. Incuber toute la nuit à 37 °C.
2. Revêtement laminin
   1. Retirer l’OP et bien laver 3 x 5 min avec du PBS.
   2. Ajouter de la laminine (1:1 000 en PBS) et incuber à 37 °C pendant 3 h ou toute la nuit.
      REMARQUE : La solution mère de laminine est de 1 mg / mL. Préparez de petites aliquotes et conservez-les à -80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
3. Dissociation en neurones uniques
   1. Décongeler la solution de dissociation à 4 °C pendant 1 h avant utilisation.
   2. Transférez les organoïdes dans un tube de 15 mL et laissez le tube intact jusqu’à ce que tous les organoïdes se soient déposés. Retirer le surnageant et ajouter 5 ml de PBS pour rincer les organoïdes.
   3. Après avoir retiré le PBS, ajoutez 1 ml de solution enzymatique et pipetez doucement 1 à 2 fois. Incuber à 37 °C pendant 5 min ; pipette plusieurs fois. Si nécessaire, incuber pendant 2 à 3 minutes supplémentaires. Pipeter à nouveau pour compléter la dissociation.
   4. Centrifuger à 200 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL de solution de dispersion et pipeter.
   5. Solution d’isolement de couche en dessous et centrifuger à 200 × g pendant 5 min.
   6. Ajouter 1 mL de milieu neuronal (neurobasal avec 1 % de B27, 0,25 % de substitut de glutamine, 1 % de PS) et mélanger. Passer la suspension à travers une crépine de 70 μm dans un tube de 50 mL.
   7. Comptez les cellules. Cellules de semence à 1 × 10⁵ cellules/cm² sur plaques PO/laminine. Remplacer le milieu tous les 4 à 7 jours jusqu’au jour 60.

4. Récolte de cellules et d’organoïdes pour l’analyse cellulaire et moléculaire

1. Fixation organoïde pour l’immunofluorescence (Jour 30)
   1. Récoltez les organoïdes (étape 2.4.3) dans des microtubes.
   2. Retirer le milieu avec précaution pour ne pas aspirer les organoïdes et ajouter 1 mL de PBS pour rincer les organoïdes.
   3. Retirer soigneusement le PBS pour ne pas aspirer les organoïdes et ajouter 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pour fixer pendant 30 minutes à température ambiante.
   4. Laver 3 fois avec du PBS.
   5. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Prélèvement d’organoïdes pour la RT-qPCR (jour 30)
   1. Transvasez les organoïdes (étape 2.4.3) dans des microtubes. Lavez avec du PBS comme décrit à l’étape 4.1.2.
   2. Ajouter un tampon de lyse et congeler dans de l’azote liquide (LqN₂). Conserver à −80 °C jusqu’à utilisation.
3. Fixation cellulaire pour l’immunofluorescence (Jour 60)
   1. Retirez le milieu de culture et ajoutez du PBS pour laver les cellules.
   2. Fixer dans 4 % de PFA pendant 15 min à température ambiante.
   3. Retirez le PFA et ajoutez du PBS aux cellules de lavage. Répétez cette étape 3 fois.
   4. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.

5. RT-qPCR

1. Extrayez l’ARN total des organoïdes selon les instructions du fabricant du kit.
2. Synthétiser l’ADNc à partir de 1 μg d’ARN total préparé à l’étape 5.1 selon les instructions du fabricant de la trousse dans un volume de réaction total de 20 μL.
3. Effectuez une PCR quantitative à l’aide des amorces suivantes : FOXG1_forward : CGCCAGATTTCCATGTGTGC ; FOXG1_reverse : GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA ; ACTB_forward : TGAAGTGTGACGTGGACATC ; ACTB_reverse : GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Réglez la concentration finale pour chaque réaction comme suit : 1x master mix fluorescent, 0,25 μM d’amorce directe, 0,25 μM d’amorce inverse. Le volume total de la réaction est de 15 μL, y compris 0,2 μL d’ADNc de l’étape 5.2. Utiliser les conditions PCR suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 1 min ; 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 30 s.
4. Normaliser l’expression de FOXG1 en ACTB en tant que contrôle interne.

6. Coloration par immunofluorescence

1. Incuber les organoïdes (jour 30) dans 10 % de saccharose pendant 1 h à 4 °C, puis 30 % de saccharose pendant ≥3 h à 4 °C.
2. Monter les organoïdes dans le milieu d’enrobage et préparer la cryosection (10 μm) à l’aide du cryostat. Stocker les sections des lunettes de diapositive à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
3. Retirer le support d’enrobage par lavage PBS (2 x 5 min).
4. Perméabiliser dans 0,3 % de PBST pendant 10 min. Laver avec du PBS.
5. Bloquer dans 10 % de sérum de chèvre normal dans 0,1 % de PBST pendant 1 h. Incuber pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires : anti-FOXG1 (1:200), anti-TUBB3 (1:500-1:1 000). Laver 3 fois avec du PBS.
6. Incuber avec l’anticorps secondaire (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) pendant 1 h. Laver 3 fois avec du PBS.
7. Montez et observez au microscope confocal.

7. Analyse de l’hétéroplasmie

1. Récoltez les iPSC à l’aide de racleurs cellulaires et transférez-les dans des microtubes. Ajouter 0,5 mL de PBS et centrifuger à 100 × g pendant 5 min. Retirer le surnageant et passer à l’étape 7.2.
2. Extrayez l’ADN total selon les instructions du fabricant du kit.
3. Réglez la concentration finale pour chaque réaction PCR : 1x master mix fluorescent, 0,25 μM d’amorce directe, 0,25 μM d’amorce inverse. Le volume total de la réaction est de 15 μL, y compris 50 ng d’ADN total de l’étape 7.2. Utiliser les conditions PCR suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 1 min ; 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 30 s. Les séquences d’amorces sont les suivantes : MELASwt_foward : gtttgttaagatggcagagc ; MELASwt_reverse : ggaattgaacctctgactgtaaagttt ; MELASmut_foward : gtttgttaagatggcagg ; MELASmut_reverse : ggaattgaacctctgactgtaaagttt ; FBXO15_ avant : gccaggaggtcttcgctgta ; FBXO15_ inverse : aatgcacggctagggtcaaa.
4. Utilisez des valeurs de cycle seuils pour calculer le nombre de copies d’ADN mitochondrial (mutant ou de type sauvage).
5. Normaliser en FBXO15 : numéro de copie du gène nucléaire.

8. Évaluation de la taille et de la forme des organoïdes

1. Capturez des images d’organoïdes à l’aide d’un microscope au format TIFF.
2. Mesurez la taille et la circularité à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images open source. Ouvrez les fichiers TIFF enregistrés à l’étape 8.1 en cliquant sur Fichier | Ouvrez et sélectionnez le fichier. Choisissez Sélections à main levée et tracez l’organoïde. Cliquez ensuite sur Analyser | Mesurer. Les valeurs de l’aire et de la circularité dans les résultats ont été utilisées pour l’analyse à l’étape 8.3.
3. Analysez les données en effectuant un test t pour évaluer s’il existe des différences significatives par rapport aux lignes de contrôle à l’aide d’un logiciel statistique.

Résultats

Nous avons généré des organoïdes cérébraux et effectué des cultures neuronales en 2D à l’aide d’un protocole relativement simple avec des modifications mineures basé sur Nakamura et ^al.9 (Figure 1). Dans le protocole précédent, des plaques en forme de V à 96 puits ont été utilisées, tandis que dans cette étude, nous avons utilisé des plaques en forme de U à 96 puits à faible fixation pour permettre aux cellules de s’agréger naturellem...

Discussion

Les organoïdes induits à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSE)/iPSC représentent des modèles de maladie prometteurs pour les maladies rares et réfractaires, tandis que la génération d’organoïdes cérébraux nécessite généralement des périodes de culture prolongées de plusieurs mois¹⁰ et l’utilisation d’équipements coûteux, tels qu’un conteneur conçu qui remue continuellement le milieu de culture et maintient des conditions stables pour la culture c...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Antenne de culture cellulaire de 10 cm	Corning	353003
Surface d’attache ultra basse à 6 puits	Corning	3471
70 & mu ; Filtre à cellules M	Corning	352350
Accutase	Nacalai Tesque	12679-54	Des enzymes utilisées pour dissocier les iPSC
Supplément B27	Thermofischer scientifique	17504001
Supplément de B27 sans vitamine A	Thermofischer scientifique	12587010
&bêta ;-mercaptoéthanol (2-ME)	sigma	M3148	Rejetez selon les règles de l’institution.
Culture cellulaire à 6 puits multiplaques	Corning	353046
Embout de sauvegarde de cellules	BMBio ECO	BMT-200W	Pointe à pipette à large calibre
Grattoirs à cellules	SUMITOMO BAKELITECO., LTD.	MS-93100
Microscope confocal	Zeiss	LSM710
Cryostat	Leica	CM3050
Laminine de souris de culture 1	R& D	3400-010-02	utilisé pour revêtir les plaques des cultures 2D de neurones dissociés
DMEM/F12	FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.	042-30795
Milieu de montage à fluorescence	DAKO	S302380-2	Milieu de montage
Anticorps FOXG1	Abcam	ab196868
Glutamax	Thermofischer scientifique	35050061
Anti-IgG anti-souris (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor Plus 488	Thermofischer scientifique	A32723
Anti-IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor Plus 555	Thermofischer scientifique	A32732
Sulfate d’héparan (HS)	sigma	H7640
Kit ARN-ADN à cDNA haute capacité	Thermofischer scientifique	4387406	utilisé pour synthétiser de l’ADNc à partir de l’ARN
Hoechst 33258	Thermofischer scientifique	H3569
ImageJ		Version 1.52a	Utilisé pour mesurer la taille et la circularité des organoïdes
Soie iMatrix-511	Takara Bio Inc.	892021	Revêtement des plaques pour la culture iPSC
Insuline	FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.	; 090-06481
IWP2	Tocris Bioscience	3533
Keyence BZ-X810	Keyence	BZ-X810	utilisé pour capturer des images pour la Figure 3A
LSM710	Carl Zeiss AG		Microscope confocal
LSM980	Carl Zeiss AG		Microscope confocal
LUNA Universal qPCR Master Mix	New England Biolabs	M3003
Matrigel	Corning	354277
Supplément N2	Thermofischer scientifique	17502001
Milieu neurobasal	Thermofischer scientifique	21103049
Solution de dissociation neuronale & nbsp ;	FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.	291-78001
acides aminés non essentiels (NEAA)	Nacalai Tesque	06344-56
Sérum de chèvre normal	Jackson ImmunoResearch Inc.  ;	005000121
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera traitée, microplaque à fond en forme de U traitée	Thermofischer scientifique	174929
Paraformoldéhyde (PFA)	Nacalai Tesque	09154-85	Rejetez selon les règles de l’institution.
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
PBS	Nacalai Tesque	27575-31
pénicilline/streptomycine (PS)	Nacalai Tesque	26253-84
Poly-L-ornithine (PO)	sigma	P3655
Polyoxyéthylène(10) Éther octylphénylique (Triton)	FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.	168-11805
PRISM  ;	GraphPad	Version 9.5.0
QIAamp Mini Kit ADN   ;	QIAGEN	51304	utilisé pour extraire l’ADN total
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	utilisé pour extraire l’ARN total
SB-431542	Cayman Chemical	13031
Des verres à glissière	MATSUNAMI	CRE-05
StemFit AK02N	Takara Bio Inc.	AK02N	Moyen utilisé pour la culture des iPSC non indifférenciées et du jour 0 au jour 6
Saccharose	FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.	196-00015
Composé Tissulaire-Tek O.C.T.	Sakura Finetek Japan Co., Ltd.	4583	Milieu de cryoconservation
Anticorps TUBB3	Promega	G712A
Y27632	FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.	030-24021	Inhibiteur de ROCHE
ZEN	Carl Zeiss AG	2.3SP1 (édition noire)	logiciel pour analyser les images prises   ; avec microscope confocal (LSM710)
ZEN	Carl Zeiss AG	2.6 (édition bleue)	logiciel pour analyser les images prises   ; avec microscope confocal (LSM980)