Article de méthode

Cartographie optique des anomalies électrophysiologiques et de manipulation du calcium de l’atrie dans un modèle de rat de péricardite stérile

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DOI :

10.3791/69767

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27 janvier 2026

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1Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Research Center of Ion Channelopathy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 3Institute of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Key Lab for Biological Targeted Therapy of Education Ministry, 5Hubei Provincial Engineering Research Center of Immunological Diagnosis and Therapy for Cardiovascular Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 6Department of Cardiology, Xuzhou Central Hospital, 7Institute of Cardiovascular Diseases & Department of Cardiology, Sichuan Provincial People's Hospital, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une double cartographie optique des transitoires de tension et de calcium dans les cœurs stériles de la péricardite de rat afin d’évaluer le remodelage auriculaire induit par l’inflammation sous-jacent à la fibrillation auriculaire postopératoire.

Résumé

La fibrillation auriculaire postopératoire (POAF) survient fréquemment après une chirurgie cardiaque et est associée à une inflammation et un remodelage auriculaires. Le modèle de péricardite stérile (SP) reproduit cette affection chez les rats, fournissant une plateforme précieuse pour étudier l’électrophysiologie auriculaire induite par l’inflammation. Ce protocole décrit la préparation de cœurs de rat perfusés par Langendorff après induction SP et l’utilisation simultanée d’une double cartographie optique pour enregistrer la tension transmembranaire et les transitoires calciques. Les cœurs sont colorés avec le colorant sensible à la tension RH237 et l’indicateur calcique Rhod-2 AM, tandis que la contractilité est supprimée par blbbistatine pour minimiser les artefacts de mouvement. L’imagerie à haute vitesse permet une cartographie spatiotemporelle des potentiels d’action auriculaires et de la dynamique du calcium lors de protocoles de stimulation contrôlés. Les paramètres quantitatifs incluent la durée du potentiel d’action, la vitesse de conduction, la durée du transitoire calcique, le temps jusqu’au pic et la magnitude des alternants. La méthode permet une évaluation précise de l’hétérogénéité de la conduction auriculaire, du couplage électro-calcique et de la vulnérabilité à l’arythmie sous stress inflammatoire. Cette approche visualisée offre une plateforme reproductible et polyvalente pour étudier les mécanismes de la POAF et tester des interventions pharmacologiques ou génétiques ciblant le remodelage auriculaire.

Introduction

La fibrillation auriculaire postopératoire (POAF) est une complication fréquente après une chirurgie cardiothoracique, caractérisée par des épisodes transitoires de fibrillation auriculaire (FA) qui atteignent généralement leur pic entre 2 et 4 jours après l’opération. Bien que la POAF soit souvent autolimitée, elle est associée à un risque accru d’AVC, à des séjours hospitaliers plus longs et à des coûts de santéaccrus 1. Le stress inflammatoire dans le myocarde auriculaire est considéré comme un facteur clé de sapathogenèse 2.

Le modèle de péricardite stérile (SP) est un modèle animalier de petite taille bien établi pour étudier laPOAF 3,4. Dans ce modèle, l’application épicardique du talc induit une inflammation péricardique localisée qui imite les changements postopératoires. Des études antérieures utilisant ce modèle ont démontré un remodelage structurel, une expression modifiée des jonctions gap et des anomalies de manipulation du calcium qui prédisposent à l’arythmogenèse 5,6,7. Cependant, les techniques électrophysiologiques conventionnelles fournissent des informations spatiotemporelles limitées, rendant difficile la capture de l’hétérogénéité de conduction et de la dynamique de couplage électro-calcique à travers la surface auriculaire intacte.

La cartographie optique permet l’imagerie simultanée à haute résolution de la tension transmembranaire et des transitoires calciques (CaT) sur la surface auriculaire, permettant une visualisation précise de la conduction auriculaire, de la repolarisation et de la signalisationcalcique 8. Dans ce protocole, nous décrivons la double cartographie optique dans les cœurs de rats SP perfusés par Langendorff. Cette approche permet de quantifier la vitesse de conduction, la durée du potentiel d’action (APD), les propriétés de CaT et les alternans sous des protocoles de pacing contrôlés. En intégrant l’évaluation électrique et de la manipulation du calcium dans une préparation auriculaire enflammée, la méthode constitue un outil puissant pour étudier la base mécanistique de la POAF et tester des interventions thérapeutiques ciblées.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de Soins et d’Utilisation Institutionnelles des Animaux (IACUC) sous l’identifiant d’approbation [2024] Numéro IACUC 4241 et menées conformément aux directives institutionnelles et nationales. Tout au long de l’étude, le respect strict des recommandations de bien-être animal a été maintenu, avec des critères humains clairement définis : les rats présentant une léthargie persistante, une perte de poids soudaine supérieure à 20 %, une détresse respiratoire, une incapacité à manger ou boire normalement, ou des complications postopératoires graves ont été immédiatement euthanasiés à l’aide d’une surdose d’isoflurane (5 % avec un flux d’oxygène à 1 L/min) pour minimiser la souffrance.

1. Préparation des solutions et réactifs

  1. Préparer la solution de Tyrode modifiée (en mM) : 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,3 CaCl2, 1,05MgCl 2, 1,19NaH 2PO4, 20NaHCO 3, 11,1 glucose. Faites une bulle avec 95 % de O2/5 % de CO2, ajustez le pH à 7,38-7,42, et réchauffez à 37 ± 1 °C.
  2. Blebbististe : dissous dans du DMSO (5 mg/mL), conserve à -20°C, protégé de la lumière. À utiliser à une concentration finale de 10 μM.
  3. RH237 (colorant sensible à la tension) : dissous dans du DMSO (2 mg/mL), conservé à −20 °C, protégé par la lumière. À utiliser à une concentration finale de 2 μM.
  4. Rhode-2 AM (indicateur calcique) : Dissolution dans DMSO (1 mg/mL) ; conserver à −20 °C, protégé par la lumière. À utiliser à 0,89 μM de concentration finale.
  5. F-127 pluronique (tensioactif) : solution à 20 % dans le DMSO (réactifs disponibles dans le commerce).
  6. Pentobarbital sodique (1 %) : dissoudre 0,1 g dans 10 mL de solution saline pour l’anesthésie (40 mg/kg, p.i.).
    REMARQUE : Manipuler les teintures et les stocks DMSO avec des EPI appropriés ; Protégez la blébbistamine et les colorants de la lumière. Respectez les règles de biosécurité et de sécurité chimique.

2. Équipement

  1. Système Langendorff avec contrôle de température (37 ± 1 °C), réservoir, colonne de bulles et pompe péristaltique (débit 10-12 mL/min).
  2. Imagerie : caméra CMOS haute vitesse (≥ fréquence d’images de 1 kHz ; ≥ champ de vision 80 × 80 pixels pour l’atrium), source d’excitation LED (530 ± 25 nm), diviseur de faisceau dichroïque (~630 nm), filtres d’émission (Rhod-2 ~590 nm ; RH237 >700 nm), objectif avec ouverture réglable, table optique avec isolation des vibrations. Source lumineuse d’excitation : laser LED avec un courant maximal de 5 A, lumière verte avec une puissance maximale de 2,2 W.
  3. Stimulation : Stimulateur à tension constante, électrodes de stimulation bipolaire.
  4. Physiologie : électrodes ECG submersibles ; sonde thermistante ; substrat noir (caoutchouc) pour réduire la contamination par la lumière ventriculaire ; des instruments chirurgicaux de qualité ; Ventilateur pour rats. Un inventaire détaillé est disponible dans le tableau des matériaux.

3. Induction de la péricardite stérile (SP) chez les rats

  1. Anesthésiez les rats mâles de Sprague-Dawley (200-220 g) avec 1 % de pentobarbital sodique (40 mg/kg, p.i.). Confirmez la profondeur de l’anesthésie (perte du réflexe pédal).
  2. Intubez le rat à l’aide d’une canule en polyéthylène ou métallique sous visualisation directe. Avancez doucement le tube dans la trachée, en le positionnant juste au-dessus de la carine, et sécurisez-le pour éviter le déplacement. Branchez-vous à un ventilateur réglé à un volume de marée de 2 mL/100 g, 55 respirations/min, I :E = 1:1. Confirmez une ventilation efficace en observant une expansion thoracique symétrique et une respiration stable.
    REMARQUE : Évitez les placements profonds ou superficiels pour éviter une intubation bronchique ou une extubation accidentelle.
  3. Préparez le champ chirurgical. Réalisez une petite thoracotomie parasternale (deuxième espace intercostal près du sternum). Exposez doucement le cœur.
  4. Soulève le thymus pour visualiser les deux oreillettes. Ouvrez délicatement le péricarde au-dessus des surfaces auriculaires avec une pince fine.
  5. Appliquez uniformément du talc stérile sur les surfaces auriculaires gauche et droite à l’aide d’une spatule fine (dosage de talc : 50 mg/100 g de poids corporel de rat). Évitez de déborder sur de grands vaisseaux/ventricules. Remplacez le thymus au-dessus des oreilles pour limiter la migration du talc.
  6. Repositionnez les muscles thoraciques pour couvrir l’incision chirurgicale intercostale. Après désinfection avec 0,5 % de povidone-iode, suturez les muscles et la peau pour refermer la cavité thoracique, puis administrez la pénicilline (160 000 U/100 g, i.p.) postopératoirement.
  7. Simulacre : Thoracotomie sans péricardiotomie ni application de talc.
    REMARQUE : Appliquez une couche fine et uniforme de talc uniquement sur l’épicarde auriculaire ; Une contamination excessive par du talc ou du ventricule augmente la mortalité et peut perturber les relevés spécifiques de l’atrie. Des études antérieures ont confirmé que la chirurgie de péricardite aseptique chez le rat provoque une myocardite auriculaire sévère avec une fibrose marquée et des facteurs inflammatoires élevés, notamment IL-6, IL-1β etTGF-β1 3,9.

4. Isolement cardiaque et perfusion de Langendorff

  1. Au troisième jour post-opératoire, anesthésiez les rats avec de l’isoflurane (2-3 %) via un cône nasal et administrez une héparine systémique (250 U/Kg, i.p.) pour prévenir la formation de caillots intravasculaires susceptibles d’obstruer la circulation coronarienne et compromettre la perfusion de Langendorff. Ce moment a été choisi sur la base de nos précédentes constatations in vivo selon lesquelles l’inducibilité de la FA atteint un pic 3 à 4 jours après laSP 3, permettant la capture de la phase arrythmogène aiguë et inflammatoire tout en évitant les adhérences ultérieures qui interfèrent avec la charge de colorants et les enregistrements optiques.
    REMARQUE : Avant de commencer, préparez de la fraîcheur ; Équilibrer gaz et température. Alignez les optiques et confirmez les filtres/dichroïque. Configurez le logiciel d’acquisition (1-2 kHz, exposition 1 ms) et effectuez l’étalonnage avec une carte fluorescente.
  2. Effectuer une thoracotomie médiane rapide pour exposer la cavité thoracique. Retirez le cœur en bloc avec une partie de l’arc aortique, puis immergez-le immédiatement dans la solution de Tyrode oxygénée glacée pour arrêter le métabolisme et préserver la viabilité des tissus. Disséquez soigneusement le tissu conjonctif environnant tout en maintenant une longueur aortique de 0,5 mm pour la canulation. Fixez l’aorte sur la canule de Langendorff à l’aide de sutures en soie 4-0, en assurant un joint hermétique et que le bord inférieur du cathéter s’aligne avec le bord supérieur de l’atrium. Commencer la perfusion rétrograde avec des Tyrodes oxygénés à un débit constant de 10 à 12 mL/min, en maintenant la température de perfusate à 37 ± 1 °C. Pour la reproductibilité, les spécifications de la canule aortique du rat sont les suivantes : diamètre extérieur : 1,4 mm ; diamètre intérieur : 1,0 mm ; longueur totale : 3-4 cm ; profondeur d’insertion : environ 0,5 à 1,0 cm dans la racine aortique ; forme de la pointe : légèrement effilée ; Matériau : Acier inoxydable ou tubes métalliques émoussés. La canule doit être suffisamment rigide pour supporter des pressions de perfusion (généralement 60-80 mmHg) sans se plier, et la pointe doit éviter d’obstruer l’ostie coronarienne.
  3. Observez le cœur pour des effets immédiats de la réperfusion. Une perfusion réussie est indiquée par un lavage rapide et rapide du sang résiduel provenant de la vasculature coronaire, la restauration d’une couleur myocardique uniforme rosée, et la reprise des contractions rythmiques spontanées. Un œdème myocardique minimal et un rythme cardiaque stable (généralement 300-400 bpm) sont nécessaires avant toute expérimentation supplémentaire. Enregistrez simultanément l’électrocardiogramme du cœur. Laissez le cœur s’équilibrer pendant au moins 20 minutes sous perfusion constante avant d’initier les protocoles de cartographie optique.

5. Suppression des mouvements et ventilation

  1. Ajoutez la blebbistaine au perfusate (10 μM finaux). Perfusez pendant ~10 minutes jusqu’à ce que les contractions cessent.
  2. Insérez un cathéter hypotendu dans le ventricule gauche via la veine pulmonaire à travers la valve mitrale pour décompresser le ventricule, réduisant ainsi la pression intracavitaire tout en préservant la morphologie auriculaire et l’intégrité du signal. Pour la reproductibilité, les spécifications du cathéter sont : diamètre extérieur : 1,4 mm ; diamètre intérieur : 1,0 mm ; longueur totale : 1,5 cm ; Profondeur d’insertion dans le cœur : 1,0 cm. N’ouvrez pas les oreilles pour préserver la géométrie et les signaux auriculaires.

6. Chargement de colorant

  1. Perfusion cardiaque : Après un arrêt cardiaque, perfusez le cœur à température ambiante à un débit constant de 10 à 12 mL/min.
  2. Coloration indicatrice calcique : Ajoutez Rhod-2 AM (concentration finale 0,89 μM) et 20 μL de F-127 pluronique à 20 % à 100 mL de solution de perfusion. Perfusez le cœur avec cette solution pendant environ 30 minutes, jusqu’à ce que les oreillettes et ventricules présentent une fluorescence rouge uniforme.
  3. Coloration par colorant sensible à la tension : Ajoutez RH237 (concentration finale 2 μM) à 100 mL de solution de perfusion. Perfusez le cœur pendant ~5 minutes jusqu’à ce que les oreillettes et ventricules apparaissent roses.
  4. Réchauffement et lavage : Transférez le cœur dans le système de perfusion d’origine. Réchauffez-vous à température physiologique et perfonez pendant 5 à 10 minutes pour éliminer le colorant non absorbé.
    REMARQUE : Les signaux CaT faibles reflètent souvent une charge insuffisante en Rhod-2 ; prolonger le chargement de 10-15 minutes et confirmer que Pluronic est frais. Si le mouvement persiste, confirmez la puissance de la blebbistatine et la légère protection.

7. Géométrie d’imagerie et isolation du signal

  1. Placez le cœur dans un bain d’imagerie à 37 °C. Orientez l’atrium gauche (LA) vers la caméra. Alignez les sources lumineuses LED primaire et secondaire vers LA.
  2. Soutenir le cœur pour éviter la dérive ; Écartez doucement l’oreillette et sécurisez-le avec des aiguilles d’acupuncture pour une visualisation optimale. Couvrez les ventricules de feuilles en caoutchouc noir pour minimiser la pollution lumineuse ventriculaire.
  3. Positionnez les électrodes de pacing bipolaire sur l’oreillette droite (PR). Placez des électrodes ECG près des oreilles pour une capture de grandes vagues P.

8. Protocoles d’acquisition et de rythme

  1. Lancez le logiciel de cartographie (logiciel OMapRecord4.0). Régler le taux d’images à 1-2 kHz ; régler la charge LED à 3-4 A ; pour englober toute la LA Ajustez le gain/l’exposition pour éviter la saturation dans l’un ou l’autre des canaux. Optimisez le gain et l’exposition de la caméra pour éviter la saturation tout en maximisant le rapport signal/bruit. Paramètres d’imagerie : exposition 1 ms ; fréquence maximale de la caméra 30 kHz ; fréquence d’échantillonnage 12,5 kHz ; résolution 2048 × 2048 pixels ; ROI jusqu’à 3,5 kHz ; résolution spatiale : 70 μm. Ces réglages garantissent des enregistrements haute fidélité des points d’accès et du CaT.
  2. Pacing S1S1 (base) : pacing de l’AR à 7 Hz (largeur d’impulsion 2-4 ms ; seuil diastolique double). Achetez ≥ films de 5 s pour la durée APD/CaT (CaD), le temps jusqu’au pic et la vitesse de conduction.
  3. Protocole S1S2 (réfractarité/AF) : Délivrer 30 temps S1 à 7 Hz, puis un seul S2 ; diminuer l’intervalle S1-S2 de 140 ms par étapes (10/5/1 ms) à la réfractarité. Enregistrer la récupération de CaT (A2/A1), la période réfractaire effective (ERP), l’inductibilité/durée de la FA.
  4. Rythme incrémental (alternans) : Augmenter le rythme RA de 8 à 18 Hz par pas de 1 à 2 Hz. Enregistrer ≥ 5 s à chaque rythme pour quantifier Ca-ALT, APD-ALT et DIS-ALT. Sauvegardez simultanément les films bicanal et les traces ECG/stimulation synchronisées pour analyse.
    REMARQUE : Maintenir une température constante et une perfusion tout au long du rythme ; L’hypothermie réduit la conduction et exagère les artefacts d’Alternan.

9. Traitement des données et quantification

  1. Analyser les signaux optiques à l’aide du logiciel OMapScope 4.0. Un filtre spatial gaussen 3×3 a été appliqué pour réduire le bruit tout en préservant la morphologie du signal en faisant la moyenne de chaque pixel avec ses voisins. Les temps d’activation sont définis comme le point de dF/dt maximal lors de la remontée, à partir duquel la vitesse de conduction est calculée en divisant la distance linéaire entre les premiers et les sites d’activation les plus récents par la différence de temps d’activation correspondante. APD70/90 a été défini comme le temps allant du dF/dT maximal du potentiel d’action à 70 % ou 90 % de repolarisation de l’amplitude de l’AP. Le CaD70/90 était défini comme le temps allant du pic du transitoire calcique (Ca²⁺) à 70 % ou 90 % de désintégration. Les alternans ont été quantifiés comme suit : Ca-ALT a été calculé comme 1 moins le rapport entre une amplitude moyenne plus petite et une plus grande de CaT, APD-ALT comme la différence entre les valeurs plus longues et plus courtes d’APD80 , et DIS-ALT comme alternans spatialement déphasés séparés par des lignes nodales. Le rapport de récupération RyR a été calculé comme le rapport de deux pics consécutifs de CaT (plus petit/plus grand).

10. Paramètres critiques et critères d’acceptation

  1. Perfusion : 10-12 mL/min, 37 ± 1 °C ; sinus stable ou rythme rythmé ; LA bien perfusé.
  2. SNR : Course montante dF/F ≥ 3 pour les deux canaux ; Photoblanchiment minimal sur la fenêtre d’acquisition.
  3. Mouvement : Mouvement résiduel négligeable après la blebbistamine ; Enregistrement stable des images entre les images.
  4. Température : Surveillance continue ; excluez les ensembles de données avec un bain < 36 °C ou > 38 °C lors de l’acquisition.

11. Analyses statistiques

  1. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism 9. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La normalité de la distribution des données a été évaluée à l’aide du test de Shapiro-Wilk. Pour les données à distribution normale, les différences entre les deux groupes ont été analysées à l’aide d’un test t de Student à deux queues non apparié ; pour les données non distribuées normalement, le test Mann-Whitney U a été appliqué. Les variables catégorielles ont été analysées à l’aide du test χ2 . Un taux de P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

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Résultats

Inductibilité AF
L’activité ectopique et la rentrée sont des mécanismes essentiels contribuant à l’initiation et à la perpétuation de laPOAF 2, La longueur d’onde de rentrée (λ) est déterminée par le produit de la PE et de la vitesse de conduction (CV), c’est-à-dire λ = ERP × CV. Dans les cœurs opérés par simulacre, la stimulation S1S2 a suscité des réponses auriculaires stables sans arythmie (Figure 2A). En revanche, les cœurs traités par SP prése...

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Discussion

Ce protocole décrit une double cartographie optique des AP et des CaTs dans des cœurs de rats isolés après la SP, un modèle de POAF provoqué par l’inflammation. L’enregistrement simultané à haute résolution des signaux Vm et Ca2+ sur la surface auriculaire intacte sous pacing programmable permet d’évaluer l’APD, le temps jusqu’au pic, la vitesse de conduction, l’hétérogénéité spatiale de la repolarisation, le CaD, l’amplitude CaT, le temps de pic et la variabilité régionale de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82470328, 82170326 à Y.D. ; Non. 82300350 à J.L.). Nous tenons à exprimer notre gratitude aux Drs Guoliang Hao et Gongxin Wang (Institut d’électrophysiologie, Académie des sciences médicales du Henan, Zhengzhou, Chine) pour leur aide exceptionnelle en cartographie optique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BlebbistatineAbcamab120425
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Caméra CMOSMappingLabOMS-PCIE-2002
Système ECGChengdu TechmanBL-420F
FE32 - MètreMettler Toledo30254108
Filtres/miroirs dichroïquesMappingLabRH237 >700 nm ;
CaT 590 nm
GlucoseSigma-Aldrich921-60-8
Bain d’imgasMappingLabN/A
KClSigma-Aldrich7447-40-7
Système de perfusion de LangendorffRadnoti / CustomN/A
Source LED (530 & plusmn ; 25 nm)MappingLabN/A
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
NaH2PO4Sigma-Aldrich10049-21-5
NaHCO3Sigma-Aldrich144-55-8
Logiciel OMapRecord4.0MappingLabN/A
Logiciel OMapScope4.0MappingLabN/A
Pompe péristaltiqueCole-ParmerMasterflex & reg ; L/S® ;
Pluronic F-127InvitrogenP3000MP
RH237 (colorant de tension)Thermo Fisher / InvitrogenS1109
Rhod-2 AM (indicateur CA)Thermo Fisher / InvitrogenR1245MP
Respirateurs pour petits animauxYUYANBIOV-100
Pentobarbital sodiqueSigma-AldrichP3761
Rats de Sprague-Dawley (200 et trait de trait ; 220 g, homme)Fournisseur local certifiéN/A
Poudre de talc stérileSigma-AldrichT1586
StimulateurMappingLabLEDC-2002
Bain marie (température contrôlée)Ningbo XinzhiSC-15

Références

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Réimpressions et autorisations

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Mots-clés

lectrophysiologie auriculairePerfusion de LangendorffCartographie optique doubleColorant sensible la tensionIndicateur de calciumDur e du potentiel d actionVuln rabilit aux arythmies
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