Article de méthode

Un modèle animal de la pulpite basé sur une souche de souris en surproduction et son analyse histologique

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DOI :

10.3791/69786

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27 février 2026

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1Department of Operative Dentistry, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 2Dow Institute of Advanced Biological and Animal Research, Dow University of Health Sciences, 3Department of Pathology, Dow International Medical College, Dow University of Health Sciences, 4Department of Oral Pathology, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 5Qatar University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour créer un modèle de pulpite chez des souris NMRI (Naval Medical Research Institute). De plus, les étapes pour réaliser un clip de rétraction de la mâchoire et préparer des lames pour l’histologie à partir de la mâchoire animale sont décrites. En suivant un protocole standard, il est possible d’éviter les variations méthodologiques et des résultats.

Résumé

Les souris de l’Institut de Recherche Médicale Navale (NMRI) n’ont pas été rapportées auparavant pour avoir créé un modèle d’inflammation de la pulpe dentaire. Dans ce protocole, nous présentons un modèle animal utilisant des souris IRMN et fournissons des procédures histologiques détaillées pour le modèle de pulpite afin d’assurer la reproductibilité. Nous avons inclus 70 souris IRMN réparties aléatoirement dans deux groupes : le groupe A (n=35), dans lequel la pulpite a été induite uniquement par l’exposition à la pulpe, et le groupe B (n=35), qui a reçu une exposition à la pulpe suivie d’une application de zymosan. Après l’exposition pulpaire de la molaire maxillaire droite, les animaux étaient sacrifiés à des intervalles de temps désignés (0, 6, 9, 12, 24, 48 et 72 heures). La mâchoire maxillaire a été prélevée pour l’histologie et l’analyse histomorphologique quantitative. Une augmentation progressive de l’inflammation dépendante du temps a été observée lors de l’analyse histologique pour les deux groupes. Les deux modèles animaux ont permis l’étude de l’inflammation jusqu’à 72 heures. La technique présentée dans cet article est reproductible et aidera à standardiser l’étude histologique de la pulpite.

Introduction

Divers modèles animaux ont été utilisés pour étudier la pulpite 1,2,3,4. Parmi ceux-ci, des modèles de souris basés sur C57BL/6 et BALB/c sont exclusivement rapportés dans la recherche sur lapulpite 5,6,7,8. Les deux sont consanguins et ont des exigences strictes pour la reproduction 7,9. Les souris IRM utilisées dans le protocole actuel sont une souche en bénigie, offrant de multiples avantages par rapport aux souches consanguines. Il a de faibles coûts d’installation et d’entretien. Une reproduction élevée, une meilleure immunité et une faible mortalité entraînent un renouvellement plus précoce et plus important descolonies 10. Par conséquent, il est plus faisable sur le plan logistique et financier11. De plus, nos résultats indiquent que le profil pathologique de l’inflammation pulpaire produite dans ce modèle est similaire à celui précédemment rapporté sur les sourisconsanguines 5,6,8. De plus, les souris IRMN peuvent supporter l’exposition de la pulpe au Zymosan jusqu’à 72 heures, développant ainsi un profil pathologique observable. C’est une alternative viable à d’autres souches consanguines pour étudier la pulpite12.

Le zymosan est un extrait de la paroi cellulaire de Saccharomyces cerevisiae, et il est principalement composé de chitine, de mannans, de mannoprotéines et d’ß-glucans13. Zymosan et Candida albicans partagent une structure de paroi cellulaire similaire et sont détectés par l’immunité innée de l’hôte via une lectine de type C, un récepteur de reconnaissance des pathogènes, Dectin-1-14. La déctine-1 est principalement exprimée par les cellules dendritiques et les macrophages. Il détecte les ß-glucanes chez les agents pathogènes fongiques et utilise la voie Syk/CARD9 pour la formation de médiateursinflammatoires 15. Par conséquent, Zymosan est une alternative viable pour étudier l’effet de l’exposition de C. albicans sur la maladie pulpaire, au lieu d’utiliser l’organisme16. Cela est confirmé par nos résultats précédemment publiés, qui montrent une détection précoce de transcrits de Dectin-1 dans la pulpe exposée au Zymosan. De même, des macrophages de Dectin-1 exprimant CD68+ve ont égalementété observés dans le 12.

Les techniques histologiques décrites dans les publications précédentes sont souvent insuffisantes pour que les chercheurs novices puissent se reproduire avec confiance. Par conséquent, de nombreux essais et erreurs ont lieu, entraînant des pertes animales inutiles lors de l’optimisation des procédures histologiques. Le protocole actuel standardise la technique de préparation des lames et a également été appliqué avec succès auxrats 17. Ici, toutes les étapes essentielles du modèle de pulpite sont décrites en détail, y compris une méthode reproductible pour la rétraction de la mâchoire, l’induction de la pulpite par exposition pulpaire, l’induction de l’inflammation pulpaire à l’aide de Zymosan, et une analyse histologique ultérieure.

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Protocole

L’étude animale actuelle a été conçue conformément aux directives ARRIVE. Le comité d’éthique institutionnel pour la recherche et l’éthique animale de l’Université Dow des sciences de la santé a approuvé cette étude sur les animaux (Lettre n° AR. IRB-06/DUHS/Approvacion/2016/05). Le protocole comprenait un total de 70 souris IRM. Les animaux ont été obtenus auprès de la « Central Animal House Facility » de l’Institut Dow pour la recherche biologique avancée et animale. La taille de l’échantillon de ce protocole est basée sur une étude précédente8.

1. Animaux

REMARQUE : Les animaux sélectionnés pour l’étude pesaient entre 26 et 30 g et étaient maintenus dans des cages standard dans les conditions suivantes : une température de ±21 °C, une humidité relative de ±55 %, et un ratio lumière/obscurité de 12 h avec de l’eau filtrée librement disponible et une alimentation standard (régime alimentaire normal). Il y avait une surveillance régulière pour tout signe d’agressivité, d’inconfort ou d’irritation. Le diclofénac sodium (200 μL sous-cutané, 25 mg/mL) était utilisé en cas de douleur ou d’inconfort. Ils ont été autorisés à s’acclimater pendant deux semaines avant toute expérimentation. Dix animaux chacun étaient gardés dans des cages correctement identifiées. Pour l’identification animale, un marqueur était placé sur sa queue.

  1. Divisez les animaux (n=70) au hasard en deux groupes : Groupe A (n=35), Groupe B (n=35).
  2. Dans le groupe A, induire la pulpite uniquement par exposition de la pulpe (voir de l’étape 4.1.1 à l’étape 4.1.9).
  3. Pour les animaux du groupe B, appliquez la solution de Zymosan sur la pulpe exposée (voir l’étape 4.2.1 à l’étape 4.2.3).

2. Solution de zymosan

  1. Suivez une méthode précédemment publiée pour la préparation de la solution de Zymosan décriteci-dessous 18.
  2. Utilisez du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) pour obtenir une solution de 1 mg/mL à partir de 1 mL de Zymosan.
  3. Autoclave la solution à 121 °C pendant 15 minutes.
  4. Laissez la solution refroidir à température ambiante pendant 1 heure.
  5. Centrifugez la solution à 4 °C et 300 x g pendant 10 minutes.
  6. Jetez le surnageant et lavez la pastille trois fois par centrifugation avec du PBS stérile glacé.
  7. Conservez la solution à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
    REMARQUE : La solution doit être utilisée dans les 30 jours, après quoi elle pourra être jetée.

3. Clip de rétraction de la mâchoire

  1. Utilisez un fil orthodontique en acier inoxydable de 0,7 mm pour fabriquer une pince de rétraction de mâchoire.
  2. Prenez un fil de 100 mm de longueur et formez une boucle de 5 mm de diamètre en son centre.
  3. Tournez les deux parties du fil à 5 mm de la boucle et 15 mm au total à angle droit sans courbes serrées.
  4. À une distance de 25 mm du virage, faites une encoche et tournez l’extrémité restante vers l’extérieur. Utilisez la Figure 1A pour guider.

4. Modèle animal

  1. Groupe A (n = 35)
    1. Anesthésiez les animaux par une injection intrapéritonéale de 0,1 mL/20 g de cocktail kétamine-xylazine (87,5 mg/kg de kétamine + 12,5 mg/kg de xylazine).
    2. Utilisez un stéréomicroscope à bras long incliné 10x pour toutes les interventions (Figure 1B). Placez le bras incliné de manière à ce qu’on puisse voir directement les dents maxillaires rétractées de l’animal. (Figure 1C)
    3. Pressez la pince et placez la partie encochée entre les incisives maxillaire et mandibulaire de chaque côté de la pince.
    4. Après avoir relâché le clip, fixez ses extrémités à l’aide d’un ruban adhésif (Figure 1C).
    5. Utilisez une pince dentaire pour étendre les joues de l’animal avec votre main non fonctionnelle. (Figure 1D, E).
      REMARQUE : Évitez une pression excessive. La blessure causée par une pince à épiler peut entraîner des saignements mortels et la mort de l’animal.
    6. Utilisez une fraise en carbure rond #1/4 avec un appareil à main E à basse vitesse dans un micro-moteur électrique sous un grossissement de 10x à moitié de sa profondeur au centre de la première molaire maxillaire droite pour créer une cavité de classe 1. Une ombre de pulpe peut être visible à ce moment (Figure 1D,E).
    7. Faites passer la fraise doucement à basse vitesse dans un mouvement large. Utilisez un moteur électrique pour contrôler les régimes par minute.
    8. Utilisez une lime endodontique de type K numéro 15 pour exposer la pulpe (Figure 2B).
      REMARQUE : L’utilisation d’un instrument endodontique #15 doit être extrêmement douce, sinon une perforation de furcation s’ensuivra, ce qui ne sera évident qu’une fois les lames histologiques préparées. Le diamètre de la fraise en carbure rond #1/4 est de 0,25 mm, et une lime de type #15K mesure 0,15 mm de large. Par conséquent, 0,15 mm sera la taille d’exposition dans la pulpe (Figure 2C).
    9. Laissez la pulpe exposée ouverte pour provoquer la pulpite
  2. Groupe B (n = 35)
    1. Répétez toutes les étapes données à l’étape 4.1 en ajoutant ce qui suit.
    2. Utilisez une micropipette (0,2-2 μL) pour placer 0,2 μL de solution de Zymosan préalablement préparée sur la pulpe exposée.
      REMARQUE : Il faut faire preuve de prudence lors de la distribution de la solution de Zymosan. Le déversement involontaire de la solution dans la cavité buccale peut entraîner la mort de l’animal. Par conséquent, la gaze est utilisée pour draper la dent afin que l’excès de solution de Zymosan soit absorbé par la gaze (Figure 2D).
    3. Laissez la pulpe traitée ouverte pour l’induction de la pulpite par solution de Zymosan.

5. Préparation de l’échantillon

  1. Sacrifier cinq animaux de chaque groupe à 0, 6, 9, 12, 24, 48 et 72 h par inhalation de dioxydede carbone 19.
  2. Utilisez une chambre d’euthanasie de 7,25 L.
  3. Ne préchargez pas la chambre avec duCO2.
  4. Placez les animaux directement dans la chambre.
  5. Ajoutez 100 % deCO2 à un taux de remplissage compris entre 30 et 70 % du volume de la chambre par minute.
  6. Maintenez un débit deCO2 à 5 L/min.
  7. Réchauffez leCO2 et laissez-le se mélanger à l’air présent dans la chambre.
  8. Observez les animaux pour détecter des signes d’inconscience dans les 23 minutes.
  9. Surveillez les animaux pour détecter l’arrêt de la respiration et les yeux pour qu’ils ne grisonnent.
  10. Maintenez le flux de CO2 pendant au moins une minute après l’arrêt de la respiration.
  11. Confirmez la mort des animaux avant de les retirer de la chambre. Assurez-vous qu’il n’y a pas de respiration et que les yeux paraissent pâles.
  12. Séparez les têtes des animaux immédiatement après l’euthanasie.
  13. Utilisez la première molaire maxillaire non traitée du côté gauche de l’animal sacrifié à 0 h comme témoin.
  14. Utilisez du formol tamponné à 10 % dans des tubes coniques de 15 mL correctement étiquetés pour stocker les mâchoires maxillaires pendant 2 jours.

6. Histologie

  1. Décalcifiez les mâchoires fixes à 10 % d’acide formique pendant 3 jours.
    REMARQUE : Après le troisième jour, vérifiez si une lame chirurgicale peut couper la mâchoire. Si ce n’est toujours pas assez mou, immergez-le à nouveau dans 10 % d’acide formique et vérifiez chaque jour jusqu’à ce qu’il puisse être coupé avec une lame chirurgicale.
  2. Coupe la mâchoire avec une lame n°22. Faites la coupure parallèlement au plan occlusal, le long du plan sagittal, en maintenant la lame immédiatement sur le côté palatin des cuspides palatines des molaires maxillaires (Figure 3A).
  3. Marquez la surface oclusive de toutes les dents avec de l’encre de Chine.
    REMARQUE : Ce marquage aidera à reconnaître la surface occlusale lors du coupage (Figure 3B).
  4. Enfoncez la mâchoire sectionnée dans de la cire de paraffine dans un boîtier de base en acier inoxydable en la posant à plat contre la base du moule, la surface coupée faisant face à la base.
    REMARQUE : L’intégration de cette manière garantit que la surface de coupe entre d’abord dans le microtome, que l’orientation de l’échantillon est correcte, et que les sections sagittales sont produites comme montré à la Figure 3E.
  5. Retirez la cassette d’embedding contenant la mâchoire intégrée du moule de base et placez-la dans un microtome.
  6. Réalisez des sections sagittales de 3 μm d’épaisseur et placez-les sur une lame de microscope propre et chargée (Figure 3C).
  7. Observez les lames non colorées sous un microscope composé.
    REMARQUE : Continuez à observer les coupes jusqu’à ce que la cavité soit visible sur la surface occlusale. Si les coupes sont correctement réalisées le long du plan sagittal, le long de l’axe long de la première molaire maxillaire, on observera l’ensemble de l’espace pulpaire montrant soit une ou deux racines et une chambre pulpaire (Figure 3E). À partir de ce moment, on peut théoriquement réaliser 50 diapositives à partir d’une section puisque la taille de l’exposition est de 0,15 mm. (3 μm = 0,003 mm, 0,003 x 50 = 0,15)
  8. Effectuer les étapes standard de coloration par hématoxyline et éosine pour les lames sélectionnées montrant soit une ou deux racines, ainsi que toute la chambre pulpaire.
  9. Observez les lames colorées au microscope composé.
  10. Sélectionnez cinq meilleures lames par intervalle de temps qui permettront d’observer l’espace maximal de la pulpe.

7. Analyse statistique

  1. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel statistique standard.
    REMARQUE : Pour l’analyse histomorphologique quantitative, les lames observées de chaque intervalle de temps ont été notées selon un critère précédemment publié (Tableau 1)8. Le test H de Kruskal-Wallis avec correction de Bonferroni à p=0,0018 a été utilisé pour comparer les scores de différents intervalles de temps. Le test U de Mann-Whitney a été utilisé à p ≤ 0,05 pour comparer les groupes A et B. Toutes les comparaisons ont été réalisées à l’aide d’un logiciel statistique standard.

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Résultats

Dans ce protocole, nous présentons une procédure détaillée étape par étape pour deux modèles animaux d’inflammation de la pulpe dentaire chez des souris IRM, ainsi que leurs méthodes histologiques correspondantes. L’utilisation d’un équipement approprié est essentielle au succès du protocole. À cet égard, le stéréomicroscope à bras long incliné 10x est l’équipement le plus crucial. La préparation de la cavité de classe 1 était réalisée à l’aide d’un micromoteur électrique à environ un ti...

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Discussion

Le protocole actuel présente pour la première fois dans la littérature rapportée le développement d’un modèle de lésion dentaire de type 3 (pulpite irréversible) chez la souris IRMN. Il détaille également l’analyse histologique de l’inflammation pulpaire induite par le Zymosan et fournit une méthode reproductible pour préparer des lames histologiques à partir de mâchoires animales.

En suivant ce protocole, un modèle de blessure dentaire de type 3 a été produit...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

L’étude a été autofinancée. Les auteurs saluent l’aide de M. Muhammad Adeel du département d’histologie de l’Université Dow des sciences de la santé, pour l’histologie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Moule de baseLaboratoires Histo-line, ItalieR4166C2 :D23Pour l’intégration de l’échantillon dans la paraffine
Carbide bur #1/4 roundMidwest, Wichita Falls, Texas389101
Microscope composé Motic BA310Motic Inc. Co. Ltd, Hongkonghttps://moticmicroscopes.com/products/ba310e
Diclofénac sodium 25 mg/mLIndus Pharma (DYCLO)https://sahar.ph/product/dyclo-diclofenac-sodium-25-mg-ml-im-iv/200µ ; L sous-cutanée
Pièce manuelle à vitesse lente de type E Rose201-M4À Foshan, Chinehttps://www.beingfoshan.com/en/h-pd-353.html
Incorporation de cassette  ;Laboratoires Histo-line, ItalieR4004
Chambre d’euthanasieConductScience, Illinois USACS-EUTH2ACapacité de 7,25 litres, pour souris et rats [jusqu’à 500 g]
Tubes Falcon 15 mlNest188271
Formol  ;Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis158127tamponnés  ;
Acide formique   ;Fournitures de laboratoire BDH Poole, Angleterre & nbsp ;2842810%
Homogénéiseur  ;Omni-Mixer Homogénéiseur, Omni International, Géorgie USAhttps://omni-inc.com/high-shear-lab-homogenizers/omni-th-0-2ml-100ml/omni-tissue-homogenizer-th
Encre de ChineSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis198285
Fichier endodontique de type K numéro 15Mani, Japonhttps://www.mani.co.jp/en/product/dental_01.html
Cocktail kétamine-xylazineBrookes Pharma Pvt Ltd / Mylab (Pvt.) Ltd.87,5 mg/kg de kétamine + 12,5 mg/kg de xylazine
Microtome HM 315 RMicrom, Allemagne901100
Micro-moteur Marathon-IIIBT-Marathon, Saeyang Microtech Co., Ltd. Coréehttps://www.saeyang.com/theme/basic/sub/product/view.php?it_id=1752202111Utilisation à un tiers de la vitesse maximale
Micropipette 0.2-2 & micro ; L  ;Gilson, Francehttps://www.gilson.com/default/
pipetman-p2-0-2-2-micro-l-metal
-ejector.html ?srsltid=AfmBOoobE
0iSWY_902ZHGZ7AoJ6wzN5PI
0H4V4vkxHQgK1mq7Wg2kkbS		0.2-2 & micro ; L  ;
Solution physiologique tamponnée au phosphate & nbsp ;Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-UnisP4417
Paquet statistique pour les sciences socialesIBM, Armonk, New YorkSPSS pour Mac version 23.0 & nbsp ;   ;
Led BMK-3 stéréomicroscopiqueTechno Meiji, Japonhttps://meijitechno.com/product/bmk-3-led-stereo-microscope/
Lame chirurgicale n° 22Feather Surgical Blade, Feather Safety Razor Co Ltd., Osaka, JaponFB. 12
Zymosan ASigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-UnisNuméro de catalogue Z42501 mg/mL à partir de 1 mL de Zymosan

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