Article de méthode

Préparation de billes de compensation économiques et universelles compatibles pour les anticorps multi-espèces

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DOI :

10.3791/70114

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17 avril 2026

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1Department of Pathology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, 2Center for gene and immunotherapy, The Second Qilu Hospital of Shandong University, 3Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 4Department of Urology, The second hospital of Tianjin Medical University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rentable pour préparer des billes de compensation multi-espèces compatibles pour la compensation de fluorescence en cytométrie en écoulement utilisant des microspheres polystyrène couplées protéine recombinante A/G/L.

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rentable et reproductible pour préparer des billes de compensation multi-espèces compatibles pour la compensation de fluorescence en cytométrie à flux multicolore. Ici, la protéine de liaison à l’immunoglobuline A/G/L (Protéine A/G/L) contenant plusieurs domaines de liaison à l’immunoglobuline a été exprimée dans Escherichia coli (E. coli), purifiée par chromatographie d’affinité au nickel, et couplée covalentement à des microsphères de polystyrène carboxylée via la chimie EDC/NHS. Les billes résultantes lient des anticorps provenant de diverses espèces et sous-classes, générant des signaux de fluorescence forts et distincts, adaptés à la mise en place de la compensation. Ces résultats fournissent des indications pratiques pour sélectionner le diamètre des billes et la charge en protéines afin d’atteindre des intensités de fluorescence adaptées à différents besoins de compensation. La réussite de l’exécution du protocole est attestée par une purification efficace des protéines et un pic de fluorescence clair et à haute intensité des billes conjuguées comparé aux billes témoins lors de l’analyse par cytométrie en écoulement. Cette approche simple et évolutive permet la préparation régulière de billes de compensation stables et polyvalentes dans des laboratoires standards, réduisant ainsi les coûts tout en améliorant la flexibilité pour les applications de cytométrie en flux.

Introduction

La cytométrie en flux est devenue un outil indispensable en immunologie, biologie cellulaire et recherche clinique pour l’analyse multiparamétrique des populationscellulaires 1,2,3. Un défi crucial en cytométrie à flux multicolore traditionnelle est le débordement de fluorescence, où le spectre d’émission d’un fluorochrome se recoupe dans plusieurs canaux de détecteur, entraînant une contamination du signal et une interprétationerronée 4,5. Par conséquent, une compensation adéquate est essentielle pour une interprétation précise des données.

Traditionnellement, les contrôles de compensation sont préparés à l’aide de cellules colorées monocolorées. Cependant, le nombre limité de cellules, l’expression variable des antigènes et la liaison différentielle des anticorps aux cellules posent des défis6. En conséquence, des billes synthétiques modifiées pour se lier aux anticorps conjugués au fluorochrome sont apparues comme alternative pratique 7,8. Les billes offrent les avantages d’une capacité de liaison constante, d’une intensité de fluorescence élevée et d’une indépendance vis-à-vis des niveaux d’expression antigénique cellulaire9. Comparé aux réactifs de capture à espèce unique ou à restriction Fc, l’incorporation de plusieurs domaines de liaison immunoglobulines (protéine A, G et L) élargit la couverture des espèces et la compatibilité des formats d’anticorps, permettant à une seule perle de préparation pour accueillir divers anticorps conjugués au fluorochrome.

Parmi les billes utilisées pour la compensation, le couplage de protéines liant les immunoglobulines telles que la protéine A, la protéine G et la protéine L offre une large compatibilité avec les isotypes d’anticorps de différentes espèces. Les protéines A et G se lient à la région Fc de nombreuses sous-classes d’IgG, tandis que la protéine L se lie aux chaînes légères κ des immunoglobulines et étend ainsi la capacité de liaison aux fragments de Fab et aux anticorps à chaîneunique 10,11.

Bien que des billes de compensation commerciales existent, leur coût relativement élevé peut être prohibitif pour les laboratoires à budgets limités, limitant ainsi leur applicationgénéralisée 3. Face à ces défis, il est nécessaire de disposer de plateformes de billes flexibles et personnalisables permettant aux chercheurs de définir la taille des billes, le domaine de liaison des anticorps et les types d’anticorps utilisés pour les contrôles de compensation. L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode simple, économique et reproductible pour préparer des billes de compensation compatibles multi-espèces pour la cytométrie en flux multicolore. Ce protocole décrit la conception, l’expression et la purification d’une protéine de fusion recombinante contenant plusieurs domaines de liaison à l’immunoglobuline provenant des protéines A, G et L, suivie de sa conjugaison covalente avec des billes de polystyrène modifiées par le carboxyle de diamètres définis.

Le protocole décrit la conception moléculaire de la protéine de fusion, son expression et sa purification dans E. coli, ainsi que la préparation de réactifs de compensation à base de billes compatibles avec plusieurs anticorps conjugués au fluorochrome. Ce protocole est destiné aux laboratoires réalisant une cytométrie à flux multicolore dans divers contextes de recherche, notamment l’immunologie, l’oncologie et les études translationnelles, en particulier lorsque la réduction des coûts, la compatibilité interespèces et des contrôles de compensation flexibles sont nécessaires.

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Protocole

REMARQUE : Préparez tous les tampons et réactifs fraîchement comme indiqué dans le Tableau 1. Préparer immédiatement les solutions EDC et NHS avant utilisation ; Ne les stockez pas. Pour tous les autres tampons (Lysis, Liaison, Lavage, Élution, MES, PBS, Tris), préparez les solutions d’origine à l’avance et stockez-les à 4 °C. Équilibrez les tampons stockés à la température de réaction appropriée (température ambiante ou 4 °C) avant utilisation. Assurez-vous que le tampon FACS et le tampon de stockage sont préparés fraîchement ou stockés à 4 °C.

1. Expression et purification de la protéine recombinante A/G/L

  1. Expression de la protéine recombinante A/G/L
    1. Transformez le plasmide A/G/L de la protéine pET28 en cellules compétentes pour E. coli BL21(DE3) en utilisant un protocole standard de choc thermique.
    2. Placez les cellules transformées sur une agare LB contenant 50 μg·mL-1 kanamycine et incubez toute la nuit à 37 °C.
    3. Inoculez une seule colonie dans 5 à 10 mL de bouillon LB contenant de la kanamycine (50 μg·mL-1) et cultivez pendant la nuit à 37 °C avec un secouage à 200 × g.
    4. Transférez la culture nocturne dans 200 mL de LB contenant de la kanamycine (concentration finale 50 μg·mL-1) à une dilution 1:100.
    5. Faire pousser la culture à 37 °C jusqu’à ce que la densité optique à 600 nM (OD600) atteigne 0,6–0,8.
    6. Induire l’expression des protéines en ajoutant de l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,5 mM et incuber à 28 °C pendant 12 à 16 heures.
    7. Prélever les cellules par centrifugation à 4 °C, 4000 × g pendant 10 minutes.
    8. Jetez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans le tampon de lyse. Procédez immédiatement ou stockez les granulés à -80 °C.
      Point de pause : Les granulés cellulaires peuvent être conservés à -80 °C pendant plusieurs semaines avant la lyse.
  2. Lyse cellulaire
    1. Resuspendez la granule bactérienne dans 10 mL de tampon de lyse par gramme de masse de cellules humides.
    2. Lysez les cellules à l’aide d’un homogénéiseur haute pression réglé à 1000 bars, en faisant passer la suspension pendant 2 à 3 cycles jusqu’à ce que la solution devienne moins visqueuse et translucide.
      Note : Sinon, la disruption cellulaire peut être réalisée par une sonication sur glace en mode impulsion (5 s ALLUMÉ / 10 secondes ÉTEINT) pendant 8 à 12 cycles, évitant ainsi la surchauffe. Assurez-vous d’une lyse complète en examinant une petite aliquote au microscope.
    3. Centrifugez le lysat à 12000 × g pendant 30 minutes à 4 °C.
    4. Collectez le surnageant comme fraction protéique soluble pour purification.
  3. Purification d’affinité Ni-NTA
    1. Équilibrage de colonnes et charge d’échantillon
      1. Équilibrer la colonne Ni-NTA avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon de liaison contenant 10 mM d’imidazole.
      2. Filtrez le lysat clarifié à 0,45 μM, ajoutez de l’imidazole à une concentration finale de 10 mM, puis chargez-le sur la colonne à 0,5 CV·min-1.
      3. Collectez la fraction de flux pour surveiller l’efficacité de liaison.
    2. Lavage
      1. Lavez la colonne avec 10 CV de tampon de liaison et de tampon de lavage contenant 20 mM d’imidazole à un débit de 1 CV·min-1.
    3. Élution
      1. Éluvez la protéine cible avec un tampon d’élution à un débit de 1 CV·min-1.
      2. Collectez des fractions et surveillez A280 pour identifier les fractions contenant des protéines.
    4. Échange de tampons et stockage des protéines
      1. Transférez la solution protéique purifiée dans un tube centrifuge à ultrafiltration à coupure de poids moléculaire (MWCO) de 50 kA.
      2. Centrifugez à 3 500 × g pendant 15 à 20 minutes à 4 °C jusqu’à atteindre la concentration souhaitée.
      3. Éliminez le flux et ajoutez un volume égal de tampon PBS (pH 7,4) au retentat pour l’échange de tampons.
      4. Répétez la centrifugation et le remplacement du PBS 2 à 3 fois pour remplacer complètement le tampon d’origine par le PBS.
      5. Après la dernière étape de concentration, collectez le rétentat et mesurez la concentration en protéines.
      6. Vérifier les fractions élues par SDS-PAGE ; la masse moléculaire attendue de la protéine A/G/L est d’environ 90 kDa.
      7. Aliquote la protéine purifiée et conserve à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
        REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause à cette étape. La protéine purifiée A/G/L peut être stockée à -80 °C pour une conjugaison ultérieure des billes. Après concentration, environ 10 mg de protéine purifiée A/G/L ont été obtenus à partir de 200 mL de culture bactérienne, avec une concentration finale de 2 à 5 mg·mL⁻1.

2. Conjuguer les billes à la protéine A/G/L

  1. Pré-lavage des billes
    1. Le vortex applique la bille à vitesse maximale pendant 20 à 30 s à température ambiante (20–25 °C) pour se resuspendre uniformément. Transférez 0,2 mL de bille 8 μM (5 mg) dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    2. Pellets par centrifugation, 5000 × g pendant 3 minutes à température ambiante.
    3. Aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans déranger la pellete.
    4. Ajouter 1 mL de tampon MES 0,1 M, resuspendre doucement par pipette ou vortex délicat, centrifuger à nouveau 5000 × g pendant 3 minutes à température ambiante, et retirer le surnageant. Répétez ce lavage une fois (au total deux lavages de MES).
  2. Activation avec EDC/NHS
    ATTENTION : L’EDC et le NHS sont des irritants et doivent être manipulés avec un équipement de protection individuelle approprié dans une hotte à fumée.
    1. Resuspendez les billes dans un tampon MES de 0,5 mL, puis ajoutez séquentiellement 50 μL de 50 mg·mL-1 NHS et 100 μL de 50 mg·mL-1 EDC.
      Note : Les solutions EDC et NHS doivent être préparées fraîches immédiatement avant utilisation.
    2. Les billes de vortex s’écouvent sur un shaker rotatif à température ambiante pendant 30 minutes pour s’activer.
  3. Retirer les réactifs d’activation et laver
    1. Granulés de billes : 5000 × g, 3 min, à température ambiante. Retirez soigneusement le surnageant.
    2. Ajoutez 1 mL de tampon PBS, resuspendez doucement, centrifugez (5000 × g, 3 min, à température ambiante), et retirez le surnageant. Effectuez un lavage PBS pour éliminer les réactifs d’activation.
  4. Couplage protéique
    1. Résuspendez la pellete de billes activée à 0,4–0,5 mL PBS (cible de volume de réaction finale 0,5–0,6 mL). Gardez un volume bas pour augmenter la concentration efficace en protéines.
    2. Ajoutez 100 μg de protéines A/G/L. Mélangez délicatement.
    3. Incubez la réaction sur un shaker roulant à température ambiante pendant 2 h pour un couplage rapide, ou 4 °C pendant la nuit. Maintenez un roulement doux pour éviter que les perles ne se déposent.
  5. Réaction d’extinction/terminaison
    1. Pellets (5000 × g, 3 min) et retirer le surnageant.
    2. Ajouter 1 mL 0,1 M Tris (pH = 7,4) pour éteindre les esters restants du NHS. Resuspendez et faites éclore sur un shaker roulant pendant 30 minutes à température ambiante.
    3. Pellets et lavez avec 1 mL de PBS dans le même tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifugez à nouveau (5000 × g, 3 min) et jetez le surnageant. Ensuite, resuspendez les billes avec un tampon de stockage de 0,5 mL.
      Point de pause : Le protocole peut être mis en pause à cette étape. Les billes de resuspension peuvent être stockées à 4 °C.
  6. Mélanger et conserver
    1. Compter les perles conjuguées et les perles non conjuguées. Mélangez les billes conjuguées et non conjuguées à un ratio de 25 % à 75 % dans le nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 mL.
    2. Suspendez le mélange de billes dans 1 mL de tampon de stockage (PBS contenant 1 % de BSA et 0,05 % de conservateur antimicrobien).
    3. Transférez la suspension dans un tube marqué et conservez à 4 °C. La protection de la lumière n’est pas nécessaire. Suspendez doucement avant utilisation pour assurer une répartition uniforme des billes. Dans ces conditions, les billes restent stables pendant au moins 6 mois.

3. Contrôle qualité représentant

  1. Incuber 10 μL de billes conjuguées avec 1 μL d’anticorps fluorescent dans un tampon FACS de 100 μL pendant 15 à 30 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : Chaque tube ne doit contenir qu’un seul anticorps fluorescent.
  2. Laver les billes avec 1 mL PBS, resuspendre à 300–500 μL PBS et faire fonctionner sur le cytomètre en flux.
  3. Réglez le canal de détection selon le fluorophore conjugué à l’anticorps (par exemple, laser 488 nM avec détecteur FITC pour les anticorps conjugués au FITC). Une plage de tension représentative à tube photomultiplicateur (PMT) de 0 à 200 V peut être utilisée comme point de départ et ajustée en fonction des performances de l’instrument. Collectez au moins 10 000 événements par échantillon.
  4. Porte sur perles par FSC/SSC. Les billes positives doivent montrer un pic unique clair avec un MFI élevé dans le canal du fluorophore ; Le contrôle négatif doit afficher uniquement le fond.

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Résultats

La protéine de fusion recombinante A/G/L se compose de 816 acides aminés avec un poids moléculaire calculé de 90,5 kDa (fichier supplémentaire 1). Cette protéine de fusion conserve cinq domaines B liant à l’IgG de la protéine A, deux domaines de liaison à l’IgG de la protéine G, et cinq domaines B liant la chaîne légère κ de la protéine L, tandis que le domaine de liaison à l’albumine a été retiré (Figure 1A, tableau des compléments ...

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Discussion

Ce protocole décrit un flux de travail pratique et efficace pour la préparation de billes de compensation fluorescentes basées sur la protéine recombinante A/G/L. La procédure comprend l’expression bactérienne, la purification par affinité Ni-NTA et le couplage covalent de la protéine purifiée à des microspheres de polystyrène modifiées carboxyle en utilisant la chimie EDC/NHS. Les billes résultantes peuvent lier des anticorps de plusieurs espèces et sous-classes, offrant un outil polyva...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts et qu’ils n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche scientifique de la Commission d’éducation de Tianjin (2021KJ224).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AF647 Rat Ig2aBioLegend141711
Souris APC IgG1BioLegend353311
BL21(DE3) Cellules compétentesSangonB528414
BSASolarbioA8010
EDCThermo Fisher22980CAS : 1892-57-5
FITC Arménien Hamster IgGBioLegend400905
ImidazoleSigma-AldrichI202CAS : 288-32-4
IPTGGoldBioI2481CCAS : 367-93-1
Kanamycine  ;SangonA600286CAS : 8063-07-8
KClAladdinP112134CAS : 7447-40-7
KH2PO4AladdinP434010CAS : 7778-77-0
MESSigma-AldrichM3671CAS : 145224-94-8
Na2HPO4AladdinS274390CAS : 7558-79-4  ;
NaClAladdinC111549CAS : 7647-14-5
NHSThermo Fisher24500CAS : 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FFSmart-LifesciencesSA005005
Souris PE IgG2aBioLegend362603
ProClean 300BeyotimeST853
Tris  ;Sigma-Aldrich252859CAS : 77-86-1  ;
TryptoneOxoïdeLP0042
Ultra filtre centrifuge, MWCO de 50 kDaMilliporeUFC9050
Microspheres uniformes de polystyrène carboxileTomicro Biotech10 ml, 25 mg/mlShanghai, Chine
Extrait de levureOxoïdeLP0021

Références

  1. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2005).
  2. Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
  3. Bhowmick, D., Lowe, S. K., Ratliff, M. L. Side-by-side comparison of compensation beads used in polychromatic flow cytometry. Immunohorizons. 7 (12), 819-833 (2023).
  4. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  5. Tang, H., et al. Economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice. J Vis Exp. (185), e63125(2022).
  6. Sun, J., Kroeger, J. L., Markowitz, J. Introduction to multiparametric flow cytometry and analysis of high-dimensional data. Methods Mol Biol. 2194, 239-253 (2021).
  7. Blazer, L. L., Roman, D. L., Muxlow, M. R., Neubig, R. R. Use of flow cytometric methods to quantify protein-protein interactions. Curr Protoc Cytom. 53, 13.11-13.15 (2010).
  8. Zheng, Z., Chinnasamy, N., Morgan, R. A. Protein l: A novel reagent for the detection of chimeric antigen receptor (car) expression by flow cytometry. J Transl Med. 10, 29(2012).
  9. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), 612-620.e5 (2018).
  10. Patella, V., Casolaro, V., Bjorck, L., Marone, G. Protein l. A bacterial ig-binding protein that activates human basophils and mast cells. J Immunol. 145 (9), 3054-3061 (1990).
  11. Eliasson, M., et al. Chimeric igg-binding receptors engineered from staphylococcal protein a and streptococcal protein g. J Biol Chem. 263 (9), 4323-4327 (1988).
  12. Hattori, T., et al. Multiplex bead binding assays using off-the-shelf components and common flow cytometers. J Immunol Methods. 490, 112952(2021).
  13. Hermanson, G. T. Bioconjugate techniques. , Academic press. (2013).

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