Article de méthode

Un dosage de la chromatine pour les tissus du cerveau humain

DOI :

10.3791/717

21 mars 2008

Dans cet article

Résumé

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Jusqu'à récemment, les études d'expression sur le cerveau humain ont été limités à la quantification de l'ARN ou les protéines. Avec les techniques d'immunoprécipitation de chromatine décrites dans ce document, il sera possible de cartographier la méthylation des histones et d'autres régulateurs épigénétiques de l'expression des gènes dans le cerveau post-mortem.

Résumé

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Chronique maladies neuropsychiatriques comme la schizophrénie, la maladie bipolaire et l'autisme sont considérés comme le résultat d'une combinaison de facteurs génétiques et environnementaux qui pourraient résulter de modifications épigénétiques de l'expression génique et d'autres pathologie moléculaire. Traditionnellement, cependant, les études d'expression dans le cerveau post-mortem ont été confinés à la quantification de l'ARNm ou de protéines. Les limites rencontrées dans la recherche du cerveau post-mortem tels que des variabilités dans le temps et l'autolyse des tissus intégrités sont également susceptibles d'affecter toutes les études des structures supérieures chromatine ordre. Cependant, l'organisation de l'ADN génomique nucléosomiques y compris l'ADN: core histones contraignant - semble largement préservées dans des échantillons représentatifs fournis par les banques du cerveau différentes. Par conséquent, il est possible d'étudier le modèle de méthylation et d'autres modifications covalentes des histones fondamentales définies au loci génomiques dans le cerveau post-mortem. Ici, nous présentons une version simplifiée natif immunoprécipitation de la chromatine (NChIP Protocol) pour les échantillons congelés du cerveau (jamais fixe) humaine. En commençant par la nucléase micrococcal digestion des homogénats de cerveaux, NChIP suivie par qPCR peut être complété dans les trois jours. La méthodologie présentée ici devrait être utile pour élucider les mécanismes épigénétiques de l'expression des gènes dans le cerveau humain normal et pathologique.

Protocole

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Procédure:

1 er jour

1. Homogénéiser 50-500 mg de tissu congelé matières post-mortem gris avec Douncing Tampon.

! ATTENTION - Les tissus humains doivent être manipulés avec soin dans des conditions de sécurité strictes. Il doit être manipulé à des normes de sécurité BSL-2 ou supérieur.

  1. Prenez précédemment disséqué, post-mortem du cerveau de -80 ° C, les Dounce de volume du cerveau de tampon 5X Douncing, et les placer dans le tube 2,0 ml microtubes. Matched échantillon et le contrôle des paires sont traitées simultanément.

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Discussion

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Le protocole décrit ici est particulièrement utile pour les chercheurs intéressés dans les signatures de méthylation des histones et / ou de l'ADN du cerveau humain, parce que ces marques chromatine peuvent être moins enclins à des artéfacts post mortem par rapport à d'autres types de modifications, y compris (histones) acétylation et la phosphorylation 1, 2. Le cerveau post-mortem se prêtent à l'étude de la mono-nucléosomes préparations; l'ADN reste largement attachée à la histones, au moins dans les échantillons.......

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Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Mental Health (5R01MH071476).

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Matériaux

Solutions:

  • Tampon nChIP Douncing: Tris 10 mM, MgCl 2 4 mM, 1 mM de CaCl2 ajuster le pH à 7,5
  • 10x FSB: EDTA 50 mM, 200 mM de Tris, 500 mM NaCl ajuster le pH à 7,5
  • Tampon salin de lavage à basse: 0,1% SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM (pH 8), 150 mM de NaCl
  • Tampon du sel de lavage haute: 0,1% SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM (pH 8), 500 mM de NaCl
  • Tampon de chlorure de lithium: 1% IGEPAL CA-630, 1% d'acide désoxycholique, EDTA 1 mM (pH 8), Tris 10 mM (pH 8), 0,25 M de LiCl
  • Tampon TE: Tris 10 mM (pH 8), EDTA 1 mM
  • Tampon d'élution: 0,1 M de NaHCO 3, 1% de SDS
  • Tampon de digestion protéinase K (10X): 1 M de Tris, EDTA 50 mM, SDS 2%, NaCl 2M ajuster le pH à 8,0
  • Acétate de sodium 3 M: 24,61 g d'acétate de sodium anhydre (MW = 82,03) dans 100 ml d'eau distillée en autoclave. Ajuster le pH à 5,2 à l'aide d'acide acétique concentré.

Références

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in sc....

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Mots-clés

Immunopr cipitation de la chromatineDigestion la nucl ase micrococciqueProtocole de ChIP nativeAnalyse de la m thylation des histonesRecherche post mortem sur le cerveauM canismes pig n tiquesDigestion la prot inase KExtraction au ph nol chloroformeAnalyse par qPCR

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