Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l'utilisation dans l'imagerie 2-photons

Résumé

Présentation de l'antigène dans les organes lymphoïdes secondaires par des cellules dendritiques est crucial pour l'initiation de la cellule T médiée réponse immunitaire adaptative. Ici nous démontrons la culture de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées de souris, l'activation et d'étiquetage pour les deux photons d'imagerie.

Résumé

Plusieurs méthodes pour la préparation de cellules dendritiques murines peuvent être trouvés dans la littérature. Ici, nous présentons une méthode qui produit plus de 85% CD11c haute cellules dendritiques en culture que chez les ganglions lymphatiques drainant, après injection sous-cutanée et l'antigène présent à cellules T spécifiques d'antigènes (voir vidéo). De plus, nous utilisons des instruments Essen Incucyte pour suivre la maturation des cellules dendritiques, où, au jour 10, la morphologie des cellules cultivées est typique d'une cellule dendritiques matures et <85% des cellules sont CD11chigh. L'étude de la présentation des antigènes dans les ganglions lymphatiques périphériques par l'imagerie 2-photons ont révélé qu'il existe trois phases distinctes de cellules dendritiques et l'interaction des cellules T ^{1, 2.} La phase I consiste à brève série de contacts entre les cellules antigènes très mobiles T spécifiques d'antigènes et de la réalisation des cellules dendritiques ^{1, 2.} La deuxième phase est marquée par des contacts prolongés entre l'antigène des cellules T spécifiques d'antigènes et des cellules dendritiques portant ^{1, 2.} Enfin, la phase III est caractérisé par des cellules T détachant les cellules dendritiques, retrouver la motricité et le début de diviser ^{1, 2.} Ceci est un exemple du type d'antigène spécifique des interactions qui peuvent être analysés par imagerie à deux photons de l'antigène de cellule-chargé Tracker colorant étiquetés cellules dendritiques.

Protocole

1) Retirer les deux os du fémur d'une souris

1. Utilisez des ciseaux pour couper la dissection musculaire et exposent l'os du fémur dessus et en dessous des articulations (genou et hanche). Saisir le centre du fémur avec des pincettes dissection et coupe au-dessus et en dessous des joints de laisser autant de l'épiphyse intacte que possible.
2. Nettoyez le muscle le plus possible en utilisant des ciseaux de dissection petits. Transfert du fémur dans un plat de RPMI.
3. Toutes les procédures doivent être effectuées dans la hotte partir de ce point, en utilisant uniquement les supports stériles, les instruments, embouts de pipette et de....

Discussion

Les cellules dendritiques sont des médiateurs clés de la réponse immunitaire adaptative et la cellule d'antigènes les plus efficaces de présenter caractérisé à ce jour. Méthodes pour l'homme et la culture de cellules dendritiques de souris dans la littérature diffèrent par le type de cytokines utilisées pour influencer le développement de différents types de cellules dendritiques. Notamment, le GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, le TNF-alpha et IFN-gamma sont utilisés dans différentes combinaisons pour produire matures, immatures, inflammato.......