Non radioactifs In situ Applicable pour l'épinette de Norvège et d'un éventail d'espèces végétales
17 avril 2009
Nous décrivons une DIG modifiés In situ, qui est rapide et applicable sur une large gamme d'espèces de plantes, y compris l'épinette de Norvège. Avec quelques ajustements, notamment modifié la RNase traitement et la protéinase K concentration, le protocole peut être utilisé dans les études sur les différents tissus et espèces.
Protocole d'hybridation in situ non radioactive applicable pour l'épicéa commun et un large éventail d'espèces végétales. Carre et al. Bonjour, je m'appelle AM GaN, et nous travaillons à l'Université OBS et à l'Université suédoise des sciences agricoles à obs en Suède.
Nous avons établi un protocole de visite d'insectes appliqué à plusieurs espèces végétales différentes. Aujourd'hui, nous allons vous montrer certaines étapes exigeantes. Dans ce protocole, nous allons vous présenter l'inclusion, la coupe et les différentes étapes de l'expérience réelle de visite d'insectes.
Passons au laboratoire Un, fixation et inclusion, étapes neuf à onze du protocole. Étape neuf, préchauffer les boîtes de Pétri et les moules à 60 degrés Celsius. Étape dix, chauffer une paire de pinces et répartir uniformément les tissus dans une boîte.
Ajoutez plus de paraffine pour recouvrir les tissus. Étape 11 : laissez durcir la paraffine à température ambiante. Deux étapes sexuelles, 12 à 19, dans le protocole.
Allumez les plaques chauffantes et préparez du paraffine fondue. Sortez les échantillons de la chambre froide. Étape 13 : utilisez un scalpel pour découper soigneusement un bloc de tissu inclus dans la paraffine.
Donner une forme à la pièce afin de faciliter la découpe. Étape 14 : chauffer le bloc à froid et faire fondre le talon pour les assembler. Laisser la préparation durcir à quatre degrés centigrades.
Étape 15 : découper le bloc de cire en sections de six à huit micromètres d'épaisseur. À l’aide d’un microtome, les sections forment un ruban long et continu. Détacher un ruban et le transférer sur du papier.
À ce stade, il est possible d'inspecter les sections individuelles au microscope stéréo afin de sélectionner les sections d'intérêt. L'inspection sera facilitée si les tissus sont colorés à l'éosine. Étape 17 : ajouter de l'eau Milli Q libre d'ARN sur les lames.
Coupez le ruban en morceaux plus petits et placez-les sur les lames. Déplacez les lames sur la plaque chauffante. Étape 17 : laissez les rubans s'aplatir sur une plaque à 42 degrés Celsius pendant une à deux minutes.
Éliminer l'eau en utilisant l'huile Kim. Étape 19, incuber les lames à 42 degrés Celsius toute la nuit afin que les tissus adhèrent aux lames pour l'hybridation in situ 4.1, section in situ. Étapes de prétraitement 36 à 48 du protocole.
Étape 36 : déshydratation des sections dans la couche histologique. Les lames sont espacées uniformément et placées dans un porte-lames afin de faciliter le transfert entre différents récipients, puis déshydrater les sections. Dans une série d'éthanol, ajouter de l'anhydride acétique tout en agitant vigoureusement.
Étape 45, mise en place pour le traitement par anhydride acétique 4.2 d'hybridation in situ. Étapes 49 à 52 d'un protocole. Étape 51, vieillissement des lames pro one plus.
La solution est visqueuse. Essayez d'éviter les bulles. Incubez les lames dans une chambre humide.
4.3 init. Après l'hybridation, étapes 53 à 72 du protocole. Étape 62, incuber les lames avec le bloc burer dans un récipient en plastique.
Étape 63, ajouter suffisamment de solution de blocage pour recouvrir juste les lames. Les anticorps sont ajoutés sur les lames à l’aide du vieillissement. Le vieillissement ne fonctionne qu’avec les lames prob bon plus. Pour les lames d’un design similaire, étape 65, laisser les forces capillaires remonter la solution d’anticorps anti-dig.
Cette étape est répétée. Étape 70, comme précédemment, insérez et aspirez la solution bleue Western. Remarquez que la solution bleue Western est aspirée deux fois, tout comme nous l'avons fait pour la solution d'anticorps anti-dig.
Et à l’étape 65, à l’étape 71, incuber les lames à l’abri de la lumière pendant un à cinq jours. À température ambiante, le suivi des signaux d’hybridation peut être effectué au microscope stéréo. Tant que les lames sont encore en sandwich, il devrait être possible d’observer des taches allant du violet au brunâtre.
Voici à quoi ressemblent en réalité les résultats de l'expérience en station CW. Vous pouvez voir le signal ici sous forme de coloration violette ou brunâtre.
Aperçu
Cet article présente un protocole modifié d'hybridation in situ avec DIG, efficace et adaptable à diverses espèces végétales, notamment l'épicéa commun. Le protocole intègre des ajustements spécifiques, tels que des modifications du traitement par l'ARNase et de la concentration de protéinase K, afin d'améliorer son applicabilité à différents tissus et espèces.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie végétale
- Biologie moléculaire
- Techniques d'hybridation in situ
Contexte
- L'hybridation in situ est une technique précieuse pour l'étude de l'expression génique dans les tissus.
- Les méthodes traditionnelles peuvent être longues et spécifiques à chaque espèce.
- Des modifications apportées aux protocoles existants peuvent améliorer l'efficacité et la polyvalence.
- Cette étude porte sur un protocole adapté à un large éventail d'espèces végétales.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole d'hybridation in situ plus rapide et plus adaptable.
- Démontrer l'applicabilité du protocole à l'épicéa commun et à d'autres espèces végétales.
- Fournir des étapes procédurales détaillées aux chercheurs.
Méthodes utilisées
- Inclusion et sectionnement des tissus végétaux.
- Étapes de prétraitement et d'hybridation pour l'analyse in situ.
- Utilisation de réactifs spécifiques et de conditions optimisées pour améliorer les résultats.
- Surveillance des signaux d'hybridation au microscope.
Résultats principaux
- Le protocole modifié facilite avec succès l'hybridation in situ chez plusieurs espèces végétales.
- Des ajustements du traitement par la RNase et de la concentration en protéinase K améliorent la compatibilité tissulaire.
- Une visualisation nette des signaux d'hybridation a été obtenue.
- Le protocole est efficace et reproductible pour diverses applications.
Conclusions
- Le protocole modifié d'hybridation in situ avec DIG constitue un outil précieux pour la recherche végétale.
- Il permet une analyse rapide et efficace de l'expression génique dans divers tissus végétaux.
- Des études futures pourront s'appuyer sur ce protocole pour des applications plus larges en biologie végétale.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole permet une analyse de l'expression génique spatiale à haute résolution dans les systèmes végétaux, en appuyant la validation des cibles en phase de découverte précoce grâce à la confirmation de profils d'expression spécifiques aux tissus. Il réduit la dépendance aux radioisotopes et aux optimisations étendues spécifiques à chaque espèce, améliorant ainsi la reproductibilité et l'évolutivité pour les études comparatives interspécifiques. La méthode apporte une valeur de dé-risque mécanistique pour le criblage phénotypique et la découverte de biomarqueurs translationnels dans les filières biopharmaceutiques à base de plantes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Confirme la localisation tissulaire spécifique des ARNm afin d'interroger des hypothèses thérapeutiques et de clarifier la fonction des gènes dans les voies de développement reproductif.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à la visualisation directe de l'expression génique dans les organes reproducteurs mâles de modèles gymnospermes et angiospermes.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance prédictive en démontrant des profils d'expression conservés pour des gènes homologues (par exemple, les homologues de AP3) dans les structures florales d'Arabidopsis, de Brassica et de l'épicéa de Norvège.
Tests et développement de dosages
- Prêt de l'essai : Prépare des sections tissulaires standardisées pour des essais d'hybridation en aval, avec une détection de signal cohérente à l'aide de sondes marquées à la DIG.
- Reproductibilité : Élimine le traitement par RNase et ajuste la concentration de protéinase K afin de renforcer le signal et de réduire la variabilité entre les espèces.
- Extensibilité : Permet une application à haut débit sur diverses espèces végétales avec des ajustements minimes du protocole, facilitant la réutilisation de la plateforme en génomique comparative.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Démontre l'applicabilité des angiospermes modèles aux gymnospermes, soutenant l'extrapolation des résultats à des systèmes ligneux pérennes pertinents pour la production de biomasse et de biopolymères.
- Déminimisation des risques mécanistiques : Réduit l'ambiguïté dans l'attribution de la fonction génique en reliant l'homologie de séquence à l'expression spatiale dans des structures développementales conservées.
- Alignement des biomarqueurs : Permet la corrélation spatiale de l'expression génique avec des caractères phénotypiques dans les tissus reproducteurs, facilitant la découverte de biomarqueurs en agriculture moléculaire végétale.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase de biologie de la découverte, permettant une identification ciblée fondée sur des hypothèses avant le criblage de composés leaders dans des systèmes d'expression végétaux.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en validant l'expression spatiale de gènes candidats dans des tissus spécifiques et à des stades de développement particuliers.
- Écrantage : Génère des signaux spatiaux quantitatifs permettant de concevoir des tests pour surveiller l'effet de composés sur des tissus transgéniques ou traités.
- Analyse : Produit des signaux chromogènes détectables (allant du violet au brunâtre) compatibles avec l'imagerie et l'analyse comparative entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Relie les profils d'expression génique à des phénotypes développementaux dans les organes reproducteurs, appuyant ainsi les décisions d'avancement dans les filières de validation de caractères.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un flux de travail standardisé et adaptable pour l'analyse d'expression génique interspécifique, réduisant les efforts redondants d'optimisation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles grâce à une détection directe et résolue spatialement des ARNm, sans risques liés aux matières radioactives.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité en supprimant le traitement par RNase et en standardisant l'utilisation de la protéinase K, réduisant ainsi les taux d'échec du protocole.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'orientation (go/no-go) dans le choix des cibles en fournissant dès les premières étapes de la découverte des données d'expression sans ambiguïté.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles fondée sur des profils d'expression conservés entre espèces, améliorant les taux de succès dans les applications en aval.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histologie, en inclusion tissulaire et en sectionnement de matériaux végétaux.
- Dépend de l'accès à des microtomes, à des fours d'hybridation et à des systèmes de détection chromogéniques.
- Exige une standardisation de la concentration de la protéinase K en fonction de la densité tissulaire et de la teneur en composés phénoliques.
- Implique l'adaptation des durées et températures d'incubation selon les espèces et la longueur des sondes.
- Est limitée par l'autofluorescence du tissu et la pénétration des composés dans les échantillons fortement lignifiés ou riches en métabolites secondaires.
