Name: Marquage fluorescent Drosophile Coeur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-13T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Découvrez le marquage fluorescent des cœurs de larves et d'adultes chez Drosophila melanogaster pour l'analyse morphologique par microscopie confocale. Cette méthode permet une visualisation détaillée des structures cardiaques.

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Les auteurs remercient SI Bernstein (San Diego State University) pour une lecture critique et des suggestions utiles concernant la préparation de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH pour SI Bernstein, SDSU, et à R. Bodmer, BIMR, et par une bourse post-doctorale de l&#39;affiliation Ouest des États de l&#39;American Heart Association à G. Vogler et à A. Cammarato.

Avant de commencer <ol><li> Préparer les solutions suivantes: <ol class="lalpha"><li> mémoire tampon de détente (artificielle drosophile hémolymphe (ADH) (voir &quot;Visualisation du cœur battant de la drosophile&quot;) qui contient 10 mM EGTA) </li><li> fixateur (formaldéhyde à 4% dans du PBS 1X) </li><li> PBSTx (PBS contenant 0,1% de Triton-X-100) </li><li> Convenablement diluée primaire et spécifique à l&#39;espèce marqué par fluorescence des anticorps secondaire dans PBSTx </li></ol></li><li> Disséquer la drosophile pour exposer les tubes cardiaques (des mouches adultes et / ou larves) suite <ol class="lalpha"><li> le protocole de semi-intactes drosophile préparation cardiaque dans «Visualiser le cœur battant de la drosophile», ou </li><li> Drosophile larvaire Dissection JNM 1 du protocole avec les modifications suivantes: Utilisez oxygénée ADH pendant la dissection des larves et de déplacer la broche postérieure légèrement de la ligne médiane ventrale. Les larves sont coupés le long de la ligne médiane ventrale. Ne pas enlever tout tissu avant la fixation. </li></ol></li></ol> Révélation <ol><li> Vérifier que tous les cœurs sont frappant en cadence dans oxygénée ADH. Remplacer rapidement l&#39;ADH à la détente de la mémoire tampon. Examinez chaque tube cardiaque à assurer les contractions sont inhibées. </li><li> Fixer les cœurs en remplaçant le tampon de détente avec fixateur. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes en remuant doucement. (Pour secouer la préparation des larves n&#39;est pas nécessaire à n&#39;importe quelle étape, et peut être considéré comme préjudiciable à l&#39;intégrité du tissu cardiaque). </li><li> Lavez échantillons à trois reprises pendant dix minutes avec PBSTx à température ambiante avec agitation continue. </li><li> Pour les adultes, soigneusement tailler les bords ventraux de la cuticule abdominale telle que ce qui reste est plus elliptique et moins arrondis. En outre, avec une seule coupure entre l&#39;abdomen et du thorax, avec soin et proprement séparées deux segments du corps et assurer un minimum de dommages à la région antérieure du cœur. Pour les cœurs des larves, retirez soigneusement le corps gras à l&#39;aide de pinces fines. L&#39;élimination de la graisse doit être exécuté avec une extrême prudence, puisque le cœur des larves est particulièrement fragile et a très peu de soutien d&#39;autres muscles ou les tissus conjonctifs. Ne pas enlever les branches trachéale car cela peut endommager le coeur. </li><li> Transfert de la région dorsale parés de la cuticule abdominale par les bords, en évitant tout contact avec le tube situé cardiaque, dans une plaque de 96 puits avec des puits qui contiennent de 50 à 100 pi d&#39;anticorps primaire dilué dans PBSTx. Ne placez pas plus de 12 spécimens par puits. Incuber à température ambiante pendant 2 heures avec une agitation continuelle. L&#39;incubation peut aussi être fait durant la nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer solution d&#39;anticorps primaire. Lavez le cœur à trois reprises pendant dix minutes avec 100 ul PBSTx à température ambiante avec une agitation continuelle. </li><li> Après élimination du tampon de lavage final, ajouter 100 pi d&#39;anticorps secondaire dans PBSTx, complétée par Alexa594-phalloïdine (1:1000). Incuber pendant une heure avec agitation constante à température ambiante. Conserver les échantillons couverts pour éviter fluorophore blanchiment. </li><li> Après incubation du secondaire, se laver le cœur à trois reprises pendant dix minutes avec 100 pi de PBSTx à température ambiante avec une agitation continuelle. Conserver les échantillons couvertes au long des étapes de lavage. </li><li> Pour le retrait de Triton-X-100, rincer les cœurs une dernière fois dans 100 ul de PBS pendant 10 minutes. Les échantillons peuvent être stockés dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant plusieurs jours avant le montage. </li></ol> Montage pour Hearts adultes <ol><li> Adhérer deux 18 x 18 mm à lamelles une lame de microscope avec 10 ul de milieu Vectashield montage. Les lamelles doivent être espacés de ~ 10-15 mm. Placer une petite goutte tiers de milieu de montage en entre les deux lamelles. </li><li> Placer 20 ul de Vectashield dans le centre d&#39;une lamelle tiers. </li><li> Retirez soigneusement chacun des coeurs de la solution de lavage PBS par les bords extrêmes de la cuticule, et placez doucement les coeur vers le bas sur la goutte de milieu de montage sur la lamelle tiers. Ne placez pas plus de cinq coeurs par goutte sur la lamelle. </li><li> Vérifiez sous un microscope pour s&#39;assurer que tous les cœurs sont vers le bas. </li><li> Retourner avec précaution la lamelle contenant le cœur et rapidement le placer sur la diapositive contenant la paire de lamelles de telle sorte que la goutte avec fusibles tubes cardiaque avec la gouttelette Vectashield entre la paire de lamelle. Un «pont» doit être formé par les lamelles. Les coeurs seront suspendus entre une lamelle et la lame de microscope. </li><li> Vérifiez sous un microscope pour s&#39;assurer que les cœurs sont maintenant confrontés à la hausse. </li><li> Fixer des lamelles à leurs bords avec des vernis à ongles. </li><li> Les cœurs sont maintenant prêts à être imagée par microscopie fluorescente ou confocale. </li></ol><ol><li> Déposer une goutte (~ 20 pl) Vectashield sur une lame de microscope. </li><li> Soigneusement de transfert jusqu&#39;à deux spécimens de larves dans le Vectashield et les orienter face dorsale vers le bas en utilisant des aiguilles de tungstène. </li><li> Individuellement glisser les spécimens hors du milieu de montage et d&#39;aligner chacune en parallèle. </li><li> Placer une lamelle sur des côtés opposés de l&#39;échantillon. En utilisant des pinces, placer une lamelle troisième sommet, d&#39;abord par la pose d&#39;un côté sur la lamelle postérieure et l&#39;abaisser jusqu&#39;à la lamelle antérieure formant ainsi un pont. Forces capillaires provoquera un flux de Vectashield d&#39;arrière en avant qui permet un bon alignement du cœur larvaire. </li><li> Fixer tous les lamelles en place, à leurs bords, avec du vernis à ongles et remplissez soigneusement l&#39;espace entre les lamelles avec 20-30 Vectashield ul. </li><li> Sceller avec du vernis à ongles et stocker à 4 ° C, ou pour stockage à long terme à -20 ° C. </li></ol> Les résultats représentatifs Lorsqu&#39;il est exécuté correctement, tous les composants et les tissus associés du vaisseau dorsal doit rester intact et être facilement visualisés. La fluorescence de fond devrait être minime. Pour les adultes, la ventrale longitudinale taches couche musculaire très bien et produit un signal important (Figure 1 et Figure 2). Les cardiomyocytes sous-jacente circulaires ont cependant tendance à ne pas produire un signal plus intense que celle de la couche recouvrant ventrale. Les myocytes de l&#39;antérieur &quot;chambre conique» du cœur adulte contient une quantité importante de matériel contractile et, par conséquent, cette région apparaît comme le parent le plus robuste pour le reste du tube cardiaque. Le cœur des larves montre un agencement en spirale myofibrillaire similaire à celle de l&#39;cardiomyocytes adultes contractiles (Figure 3). <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1atmb.jpg" alt="Figure 1a" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1423/1423fig1btmb.jpg" border="0" alt="Figure 1b" /> Figure 1: Haut. Une micrographie montrant le tube fluorescent toute cardiaque d&#39;un adulte de Drosophila melanogaster qui exprime la myosine-GFP. L&#39;image a été prise avec un microscope Zeiss Z1 Imager fluorescents équipés d&#39;un module Apotome coulissantes. Myosine-GFP est représenté en vert, l&#39;actine est coloré avec AlexaFluor phalloïdine ® 594 (rouge) et α-actinine est étiqueté avec des anti-α-actinine anticorps (bleu). Notez la procédure de préparation permet la récupération des échantillons coeur avec des structures bien conservées. CC = coniques chambre; AM = muscle Alary; V = interne de soupape; VLL = couche musculaire ventrale longitudinale. Bottom. Une région du tube cardiaques adultes de la CC à travers le 3ème segment abdominal de coeur juste sous la couche ventrale longitudinale montrant l&#39;agencement en spirale myofibrille des cardiomyocytes contractiles. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1a.jpg">cliquez ici</a> pour une version agrandie de la figure 1a, et <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig1b.jpg">ici</a> pour une version agrandie de la figure 1b <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Représentant des piles confocale d&#39;une partie antérieure du cœur adulte colorés avec AlexaFluor phalloïdine ® 594 (rouge) et un anti-Pericardin (collagène de type IV) (vert) d&#39;anticorps. Pericardin est associé avec le cœur le long de la surface ventrale, vraisemblablement originaires du myofibrilles orientées longitudinalement de la couche musculaire ventrale. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig2.jpg">cliquez ici</a> pour une version agrandie de la figure 2. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1423/1423fig3tmb.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: Une micrographie fluorescence du segment A7 du cœur d&#39;un bon trois étapes larve de drosophile. L&#39;image a été prise avec un microscope Zeiss Z1 Imager fluorescents équipés d&#39;un module Apotome coulissantes. L&#39;actine est étiqueté avec AlexaFluor phalloïdine ® 594 (vert) et α-actinine est taché avec des anti-α-actinine anticorps (rouge). S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1423/1423fig3.jpg">cliquez ici</a> pour une version agrandie de la figure 3.

<ol><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Molina, M. R., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ostia%2C+the+inflow+tracts+of+the+Drosophila+heart%2C+develop+from+a+genetically+distinct+subset+of+cardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells.</a> Mech Dev. 1, 51-59 (2001).</li>
<li>Dulcis, D., Levine, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+innervation+of+the+heart+initiates+retrograde+contractions+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 2, 271-280 (2005).</li>
<li>Zeitouni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+adult+heart+formation+revealed+by+gene+expression+profiling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila.</a> PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).</li>
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<li>Mery, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).</li>
</ol>

Nous présentons ici un protocole utile pour la préparation et la coloration du navire Drosophila melanogaster dorsale et des tissus attenants à l&#39;imagerie par microscopie fluorescente ou confocale. Nous fournissons un compte rendu concis des étapes affiné par et couramment employées dans notre laboratoire pour la coloration efficace qui permet de bien résolu à l&#39;imagerie in situ de la larve et adulte tubes cardiaques chez la drosophile. D&#39;autres ont décrit des méthodes similaires s...

<table><tbody><tr><td>Acide éthylène glycol-bis (2-aminoéthyléther) -N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tétra-acétique (EGTA)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde, 10 %, sans méthanol, Ultra Pur</td><td>Réactif</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;#174; 594 phalloïdine</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de montage Vectashield&amp;#174; pour la fluorescence avec DAPI</td><td>Réactif</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Épingles en tungstène</td><td>Réactif</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Support d'épingle</td><td>Réactif</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td></td></tr></tbody></table>

marquage fluorescent drosophile</emouvrages d&#39;art> coeur

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

L&#39;<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Vaisseau dorsal, ou du coeur, est une structure tubulaire composé d&#39;une seule couche de cardiomyocytes contractiles, cellules péricardiques qui s&#39;alignent le long de chaque côté de la paroi cardiaque, les muscles de soutien et Alary, chez les adultes, une couche de cellules musculaires longitudinales ventrales. La maison contractiles des fibres conservé constituants de la cytoarchitecture musculaires y compris les faisceaux denses et complexes des myofibrilles protéine du cytosquelette / submembranous, qui interagissent avec les composantes homologues de la matrice extracellulaire. Nous décrivons ici un protocole pour la fixation et le marquage fluorescent des éléments particuliers du myocarde du cœur des larves disséquées et semi-intactes pour adultes<em&gt; Drosophile</em&gt;. Plus précisément, nous démontrons l&#39;étiquetage des sarcomériques F-actine et d&#39;α-actinine dans les coeurs des larves. De plus, nous effectuons l&#39;étiquetage des F-actine et α-actinine dans myosine-GFP exprimer mouches adultes et d&#39;α-actinine et pericardin, un collagène de type IV de la matrice extracellulaire, dans les cœurs sauvages adulte type. Une attention particulière est accordée à une stratégie de fixation pour les adultes semi-coeurs intacts qui minimise la manipulation et optimise la possibilité de maintenir l&#39;intégrité des tubes cardiaques et les tissus associés. Ces préparations sont adaptés à l&#39;imagerie par microscopie fluorescente et confocale. Globalement, cette procédure permet une analyse attentive et détaillée des caractéristiques structurelles du coeur d&#39;un puissant système de modèle génétiquement maniable.

Nous décrivons ici un protocole de base pour le marquage fluorescent des différents éléments de tubes coeur de la larve et l&#39;adulte<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;. Ces spécimens sont bien adaptés pour l&#39;imagerie par microscopie fluorescente ou confocale. Cette technique permet une analyse détaillée des caractéristiques structurelles des cœurs d&#39;un organisme modèle puissant.

Marquage fluorescent Drosophile</emOuvrages d&#39;art> Coeur

Le vaisseau dorsal, ou cœur, de Drosophila melanogaster est une structure tubulaire composée d'une seule couche de cardiomyocytes contractiles, de cellules péricardiques...

Bonjour, je suis Nikita Ari du laboratoire de Ralph Boer, dans le cadre du programme Développement et Vieillissement à l'Institut de recherche biomédicale Burnham. Je suis également Gil ler du laboratoire inférieur. Aujourd'hui, nous allons vous montrer les procédures d'étiquetage fluorescent des structures cardiaques larvaires et adultes de Presolar.Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour préparer les tubes cardiaques en vue d'une analyse morphologique et structurale par microscopie confocale ou microscopie fluorescente afin de marquer de manière fluorescente les structures cardiaques chez la drosophile adulte. Commencez par effectuer une incision unique entre le thorax et l'abdomen d'un adulte semi-intact afin de séparer les segments corporels. Ensuite, recoupez les bords ventraux en saillie de l'exosquelette de l'adulte.Ensuite, transférez et étiquetez les spécimens adultes ou les larves disséquées avec les anticorps primaires et secondaires. Après l'étiquetage, montez les spécimens adultes lavés en tenant les bords de la cuticule et en les plaçant côté cœur vers le bas sur une goutte de vector shield déposée sur une lame couvre-objet ; retournez ensuite la lame couvre-objet sur une goutte de milieu, flanquée de deux lames couvre-objets placées sur une lame porte-objet afin de former un pont. Les cœurs se retrouvent ainsi suspendus verticalement pour le montage des cœurs larvaires.Transférez les spécimens sur une lame avec les faces ventrales orientées vers le bas ; placez deux lamelles de chaque côté de la lame. Enfin, formez un pont avec une troisième lamelle en la posant d'abord sur la lamelle située près des extrémités postérieures des larves. Les cœurs sont désormais prêts à être observés en imagerie.Avant de commencer cette procédure, préparez le tampon relaxant A DH contenant A DH tel que décrit dans un autre protocole vidéo de cette série, avec un fixatif composé de 10 millimolaire de EGTA, de 4 % de formaldéhyde dans du PBS 1X, et des anticorps primaires dilués de façon appropriée ainsi que des anticorps secondaires marqués au fluorochrome. Dans du PBS-TX, disséquez des drosophiles adultes et des larves afin d'exposer les tubes cardiaques, en suivant la préparation du cœur de drosophile semi-intacte présentée dans les protocoles vidéo visualisant le cœur battant chez la drosophile et le protocole de dissection de la jonction neuromusculaire larvaire de drosophile. Toutefois, avec des modifications : utilisez du A DH oxygéné lors de la dissection des larves et déplacez légèrement vers l'arrière les épingles par rapport à la ligne médiane ventrale de la larve.Couper le long de la ligne médiane ventrale. Ne retirer aucun tissu avant la fixation lors des étapes suivantes. Commencer la procédure d'étiquetage en vérifiant au microscope que tous les cœurs se contractent et se relâchent de manière rythmique dans un A DH oxygéné. Remplacer ensuite rapidement le DH par un tampon relaxant et réexaminer chaque tube cardiaque afin de s'assurer que les contractions sont inhibées.Procéder à la fixation des cœurs en remplaçant le tampon relaxant par un fixateur. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes avec agitation douce. Noter que, pour les préparations larvaires, l'agitation n'est nécessaire à aucune étape et pourrait même nuire à l'intégrité du tissu cardiaque.À la fin des 20 minutes, retirez le fixateur et lavez les spécimens trois fois pendant 10 minutes à chaque fois avec du P-B-S-T-X. À température ambiante et sous agitation continue pour les adultes, effectuez une incision unique entre l'abdomen et le thorax soigneusement et proprement. Séparez les deux segments corporels afin de minimiser les dommages dans la région antérieure du cœur.Veillez à ne pas couper dans la section abdominale antérieure où se trouve la chambre conique du cœur. Examinez l'échantillon au microscope afin de vous assurer qu'une coupe nette a été réalisée. Ensuite, retirez soigneusement les bords ventraux en surplomb de la cuticule abdominale, de sorte que ce qui reste soit plus elliptique que rond.Pour les cœurs de larves, utilisez une pince fine afin de retirer soigneusement le corps adipeux. Effectuez cette manipulation avec une extrême prudence. Étant donné que le cœur de la larve est particulièrement fragile et dispose de très peu de soutien provenant d'autres muscles ou tissus conjonctifs, n'enlevez pas les branches trachéennes car cela pourrait endommager le cœur.Ensuite, incuber avec l'anticorps primaire, dilué dans du PVS TX et ajouté à raison de 50 microlitres par puits d'une plaque 96 puits. Pour les mouches adultes, tenir l'exocuticule dorsale découpée par les bords sans toucher le tube cardiaque situé au centre, puis transférer dans la plaque. Placer au maximum 12 spécimens par puits et incuber à température ambiante pendant deux heures sous agitation continue.Tenez les spécimens larvaires par le bord à l’aide de pinces et transférez-les dans un puits rempli de P-B-S-T-X. Encore une fois, n’agitez pas les spécimens larvaires à la fin de l’incubation. Éliminez la solution d’anticorps primaire.Laver les cœurs trois fois pendant 10 minutes chaque fois avec 100 microlitres de P-B-S-T-X à température ambiante après le dernier lavage avec 100 microlitres d'anticorps secondaire dans du PBS tx supplémenté en Alexa 5 9 4 Phin. Garder les échantillons couverts afin d'éviter le photoblanchiment des fluorochromes à partir de maintenant et incuber pendant une heure à température ambiante. Retirer la solution d'anticorps secondaire et laver les cœurs trois fois pendant 10 minutes chaque fois avec 100 microlitres de P-B-S-T-X à température ambiante.Enfin, éliminer le TRITTON X 100 en rinçant les cœurs dans 100 microlitres de PBS pendant 10 minutes. Les échantillons peuvent être conservés à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours avant la monture. Préparez d’abord la lame pour le montage.Appliquez trois gouttes de 10 microlitres de milieu de montage Vector Shield réparties uniformément sur une lame de microscope. Placez deux couvre-objets de 18 sur 18 millimètres sur les gouttes extérieures, en espaçant les couvre-objets d'environ 10 à 15 millimètres.En outre, déposez 20 microlitres de vector shield au centre d'une troisième lame. Ensuite, tenez la drosophile adulte disséquée par les bords extrêmes de la cuticule. Pour la retirer soigneusement de la solution de lavage PVS, placez-la délicatement, côté cœur vers le bas, sur la goutte de milieu de montage située sur la troisième lame, avec pas plus de cinq cœurs par goutte sur la lame.Après avoir placé les cœurs sur la goutte, qui se trouve sur la lamelle, vérifiez au microscope que tous les cœurs sont orientés vers le bas. Inversez maintenant délicatement la lamelle avec les cœurs et placez-la rapidement sur la lame contenant la paire de lamelles, de sorte que la goutte de la lamelle inversée contenant les tubes cardiaques fusionne avec la goutte de protection vectorielle située dans l'espace entre les lamelles. Associées de cette manière, les trois lamelles forment un pont.Les cœurs seront suspendus entre la lame couvre-objet du milieu et le microscope. Faire glisser sous le pont et vérifier au microscope que les cœurs de drosophiles adultes sont désormais orientés vers le haut à l’aide de vernis à ongles. Fixer les lames couvre-objets sur leurs bords.Les cœurs sont désormais prêts à être observés par microscopie fluorescente ou confocale. Pour monter les cœurs de larves, déposez une goutte d'environ 20 microlitres de BTA shield sur une lame de microscope à l'aide de pinces fines. Saisissez la larve aux bords de la cuticule et transférez-la délicatement dans la goutte.Positionner les larves avec le côté dorsal vers le bas à l'aide d'aiguilles en tungstène. Placer jusqu'à deux larves sur une lame. Ensuite, déplacer délicatement chaque spécimen hors du milieu de montage et aligner les larves parallèlement.Placez un lamelle de chaque côté des cœurs alignés à l’aide de pinces. Placez une troisième lamelle par-dessus en posant d’abord un côté sur la lamelle frontale, puis en l’abaissant vers la lamelle arrière, formant ainsi un pont.Les forces capillaires provoqueront un écoulement du bouclier vecteur de l'arrière vers l'avant, ce qui facilite l'alignement correct du cœur larvaire. Enfin, fixez toutes les lamelles en place sur leurs bords avec du vernis à ongles et remplissez soigneusement l'espace entre les lamelles avec 20 à 30 microlitres de scellant bouclier vecteur au vernis à ongles, puis conservez à quatre degrés Celsius pour une conservation à court terme ou à moins 20 degrés Celsius pour une période plus longue. Lorsque la procédure est correctement réalisée, toutes les composantes et les tissus associés du vaisseau dorsal doivent rester intacts et être facilement visualisables.La fluorescence de fond doit être minimale chez les adultes. La couche musculaire longitudinale ventrale se colore très bien et produit un signal important. Les cardiomyocytes circulaires sous-jacents, en revanche, ont tendance à produire un signal moins intense que celui provenant de la couche ventrale sus-jacente.Les myocytes de la chambre conique antérieure du cœur adulte contiennent une quantité importante de matériel contractile, et par conséquent, cette région apparaît comme la plus robuste par rapport au reste du tube cardiaque. L'image du cœur larvaire montre un arrangement spiralé des myofibrilles. Semblable à celui des cardiomyocytes contractiles adultes, nous venons de présenter votre protocole de préparation et de coloration des cœurs ovulaires pour la microscopie fluorescente et confocale.Lors de cette procédure, il est important de limiter toute manipulation inutile. Cela permettra de préserver au mieux l'intégrité de la structure cardiaque. Ce protocole ne constitue qu'un point de départ.Comme pour toute autre immunohistochimie, différents anticorps nécessitent des conditions différentes et doivent être optimisés individuellement. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos colorations.

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Nous présentons une technique pour l'étiquetage des neurones simples dans le système nerveux central (SNC)...

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d'ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l'intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement.

Cellule étiquetage et l&#39;injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris

Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Ce protocole présente une méthode efficace pour l’imagerie du neuroépithélium de l’œil nymphal vivant de la drosophile. Cette méthode compense le mouvement des tissus et la topologie inégale, améliore la visualisation des limites cellulaires grâce à l’utilisation de plusieurs protéines de jonction marquées GFP et utilise un banc d’imagerie facile à assembler.

Live-imagerie de la Drosophila Nymphe yeux

Le protocole d’ARN décrit in situ hybridation permet la détection de l’ARN dans des embryons de drosophile entiers ou tissus disséqués. À l’aide de microplaques 96 puits et amplification de signal tyramide, transcriptions peuvent être détectées à un débit, sensibilité et haute résolution et à un coût relativement faible.

Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

Au début de l’embryon de drosophile , de nombreux organites sont mobiles. En principe, ils peuvent être photographiés en direct via des sondes fluorescentes spécifiques, mais la coquille d’œuf empêche l’application directe sur l’embryon. Ce protocole décrit comment introduire de telles sondes par microinjection, puis analyser le mouvement des organites en vrac via la vélocimétrie d’image de particules.

Visualisation du trafic dépendant du cytosquelette d’organites contenant des lipides dans des embryons de drosophiles

Le présent protocole décrit la génération d’opsines de Drosophila melanogaster exprimant des opsines eNpHR2.0 ou ReaChR dans le cœur pour l’imagerie OCT et la stimulation cardiaque optogénétique. Des instructions détaillées pour l’imagerie de la TCO de la drosophile et la modulation des battements cardiaques, y compris la simulation d’un arrêt cardiaque réparable, d’une bradycardie et d’une tachycardie chez des animaux vivants à différents stades de développement, sont rapportées.

Développement de modèles de Drosophila melanogaster pour l’imagerie et le contrôle optogénétique de la fonction cardiaque

Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

Le protocole de sectionnement cardiaque et d’imagerie par fluorescence de la drosophile simplifie l’étude de la structure et des pathologies cardiaques. Cette approche implique une section, une coloration et une imagerie simples, en contournant l’expertise technique nécessaire à la dissection traditionnelle. Il améliore l’accessibilité, faisant de la drosophile un modèle plus largement utilisable pour la recherche liée à la cardiologie au sein de la communauté scientifique au sens large.

Méthode nouvelle et efficace pour la coloration par fluorescence du cœur de la drosophile avec cryosectionnement

Découvrez le marquage fluorescent des cœurs de larves et d'adultes chez Drosophila melanogaster pour l'analyse morphologique par microscopie confocale. Cette méthode permet une visualisation détaillée des structures cardiaques.

Marquage fluorescent Drosophile Coeur

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