Marquage fluorescent Drosophile Coeur

Bonjour, je m’appelle Nikita Ari et je travaille au laboratoire de Ralph Boer dans le cadre du programme Développement et vieillissement de l’Institut Burnham pour la recherche médicale. Je suis Gil ler également du laboratoire du bas. Aujourd’hui, nous allons vous montrer les procédures de marquage fluorescent des structures cardiaques Laval et présolaires adultes.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour préparer les tubes cardiaques à l’analyse morphologique et structurale par microscopie confocale ou fluorescente afin de marquer par fluorescence les structures cardiaques chez la drosophile adulte. Tout d’abord, faites une seule incision entre le thorax et l’abdomen chez un adulte semi-intact pour séparer les segments du corps. Coupez ensuite les bords ventraux en surplomb de la cuticule adulte.

Ensuite, transférez et étiquetez les échantillons de larves adultes ou disséquées avec des anticorps primaires et secondaires. Après l’étiquetage, montez les échantillons adultes lavés en tenant les bords de la cuticule et en les plaçant côté cœur vers le bas sur une goutte de bouclier vectoriel sur une lamelle, inversez la lamelle sur une goutte de milieu flanquée de deux lamelles sur une lame pour former un pont. Les cœurs sont maintenant suspendus à la verticale pour le montage des cœurs larvaires.

Transférez les échantillons sur une lame, les côtés ventraux vers le bas, montez deux lamelles de chaque côté de la lame. Enfin, formez un pont avec une troisième lamelle en la plaçant d’abord sur la lamelle près des extrémités postérieures des larves. Les cœurs sont maintenant prêts pour l’imagerie.

Avant de commencer cette procédure, préparez le tampon relaxant A DH suivant contenant un DH comme décrit dans un autre protocole vidéo de cette série avec 10 fixateurs EGTA millimolaires composés de 4 % de formaldéhyde dans un X-P-B-S-P-B-S, TX, et des anticorps primaires correctement dilués et des anticorps secondaires marqués par fluorescence. Dans PBS TX, disséquez des drosophiles adultes et larvaires pour exposer les tubes cardiaques en suivant la préparation du cœur de la drosophile semi-intacte montrée dans les protocoles vidéo visualisant le cœur battant chez la drosophile et le protocole de dissection NMJ larvaire de la drosophile. Mais avec des modifications, utilisez un DH oxygéné pendant la dissection de la larve et déplacez légèrement les broches postérieures de la larve ventrale médiane.

Coupez le long de la ligne médiane ventrale. Ne retirez aucun tissu avant la fixation dans les étapes suivantes. Commencez la procédure d’étiquetage en vérifiant au microscope que tous les cœurs se contractent et se détendent rythmiquement en A DH oxygéné. Ensuite, remplacez rapidement un DH par un tampon relaxant et réexaminez chaque tube cardiaque pour vous assurer que les contractions sont inhibées.

Procédez à la fixation des cœurs en remplaçant le tampon relaxant par un fixateur. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes en secouant doucement. Notez que pour les préparations larvaires, il n’est pas nécessaire de secouer à aucune étape et peut même nuire à l’intégrité du tissu cardiaque.

Au bout de 20 minutes, retirez le fixateur et lavez les échantillons trois fois pendant 10 minutes à chaque fois avec P-B-S-T-X. À température ambiante avec agitation continue pour les adultes, faites une seule incision entre l’abdomen et le thorax avec soin et propreté. Séparez les deux segments du corps pour minimiser les dommages à la région antérieure du cœur.

Veillez à ne pas couper dans la section abdominale antérieure où se trouve la chambre conique du cœur. Examinez l’échantillon au microscope pour vous assurer qu’une coupe nette a été faite. Ensuite, coupez soigneusement les bords ventraux en surplomb de la cuticule abdominale, de sorte que ce qui reste soit plus elliptique et moins rond.

Pour les cœurs larvaires à l’aide de pinces fines, retirez soigneusement le corps adipeux. Exécutez ceci avec une extrême prudence. Étant donné que le cœur larvaire est particulièrement fragile et qu’il est très peu soutenu par d’autres muscles ou tissu conjonctif, n’enlevez pas les branches trachéales car cela pourrait endommager le cœur.

Ensuite, incubez avec l’anticorps primaire, qui est dilué dans PVS TX et distribué à 50 microlitres par puits d’une plaque de 96 puits. Pour les mouches adultes, tenez la cuticule dorsale coupée par les bords sans toucher le tube cardiaque situé au centre et transférez-la sur la plaque. Ne placez pas plus de 12 spécimens par puits et incubez à température ambiante pendant deux heures avec une agitation continue.

Tenez les échantillons larvaires par le bord à l’aide d’une pince et transférez-les dans des échantillons remplis de P-B-S-T-X. Eh bien encore une fois, ne secouez pas les spécimens larvaires à la fin de l’incubation. Retirez la solution d’anticorps primaire.

Lavez les cœurs trois fois pendant 10 minutes, à chaque fois avec 100 microlitres P-B-S-T-X à température ambiante après le dernier lavage à 100 microlitres de l’anticorps secondaire dans PBS tx complété par Alexa 5 9 4 Phin. Gardez les échantillons couverts pour éviter le blanchiment au fluoro quatre à partir de maintenant et incubez pendant une heure à température ambiante. Retirez la solution d’anticorps secondaire et lavez les cœurs trois fois pendant 10 minutes à chaque fois avec 100 microlitres de P-B-S-T-X à température ambiante.

Enfin, retirez le TRITTON X 100 en rinçant les cœurs dans 100 microlitres de PBS pendant 10 minutes. Les spécimens peuvent être stockés dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours avant d’être montés. Tout d’abord, préparez la glissière pour le montage.

Appliquez trois gouttes de 10 microlitres de support de montage de bouclier vectoriel régulièrement espacées sur un microscope. Faites glisser et placez deux lamelles de 18 x 18 millimètres sur les gouttes extérieures, en gardant les lamelles à environ 10 à 15 millimètres l’une de l’autre.

De plus, placez 20 microlitres de bouclier vectoriel au centre d’une troisième lamelle. Ensuite, tenez la mouche adulte disséquée par les bords extrêmes de la cuticule. Pour le retirer soigneusement de la solution de lavage PVS, placez-le délicatement avec le cœur vers le bas sur la goutte de support de montage sur la troisième lamelle de couverture, pas plus de cinq cœurs par goutte sur la lamelle.

Après avoir placé les cœurs sur la goutte, qui se trouve sur la lamelle, vérifiez au microscope pour vous assurer que tous les cœurs sont orientés vers le bas. Maintenant, inversez soigneusement la lamelle avec les cœurs et placez-la rapidement sur la diapositive en tenant la paire de lamelles de sorte que la gouttelette de la lamelle inversée contenant les tubes cardiaques fusionne avec la gouttelette de bouclier vectoriel reposant dans l’espace entre les lamelles. De cette façon, les trois lamelles forment un pont.

Les cœurs seront suspendus entre la lamelle centrale et le microscope. Glissez sous le pont, vérifiez au microscope que les cœurs des mouches adultes sont maintenant tournés vers le haut à l’aide de vernis à ongles. Fixez les lamelles de recouvrement sur leurs bords.

Les cœurs sont maintenant prêts à être imagés par microscopie fluorescente ou confocale. Pour monter les cœurs larvaires, placez une goutte d’environ 20 microlitres de bouclier BTA sur une lame de microscope à l’aide de pinces fines. Saisissez les larves sur les bords de la cuticule et transférez-les soigneusement dans la goutte.

Orientez les larves côté dorsal vers le bas à l’aide d’aiguilles de tungstène. Placez jusqu’à deux larves sur une lame. Ensuite, tirez chaque spécimen hors du support de montage et alignez les larves en parallèle.

Placez une lamelle de chaque côté des cœurs alignés à l’aide d’une pince. Placez d’abord un troisième couvercle sur le dessus en posant un côté sur le couvercle avant et en l’abaissant jusqu’au couvercle arrière. Formant ainsi un pont.

Les forces capillaires provoqueront un flux de bouclier vectoriel de l’arrière vers l’avant, ce qui aide à un bon alignement du cœur larvaire. Enfin, fixez toutes les lamelles sur leurs bords avec du vernis à ongles et remplissez soigneusement l’espace entre les lamelles avec 20 à 30 microlitres de vernis à ongles et conservez-les à quatre degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 20 degrés Celsius pour une période plus longue. Lorsqu’ils sont exécutés correctement, tous les composants et tissus associés du vaisseau dorsal doivent rester intacts et être facilement visualisés.

La fluorescence de fond doit être minimale pour les adultes. La couche musculaire longitudinale ventrale se tache très bien et produit un signal substantiel. Les cardiomyocytes circulaires sous-jacents, cependant, ont tendance à ne pas produire un signal aussi intense que celui qui provient de la couche ventrale sus-jacente.

Les myocytes de la chambre conique antérieure du cœur adulte contiennent une quantité substantielle de matériel contractile et, par conséquent, cette région apparaît comme la plus robuste par rapport au reste du tube cardiaque. L’image du cœur larvaire montre un arrangement myofibrillaire en spirale. Semblable à celui des cardiomyocytes contractiles adultes, nous venons de montrer votre protocole de préparation et de coloration des cœurs ovulaires pour la microscopie fluorescente et confocale.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de limiter toute manipulation inutile. Cela garantira une structure cardiaque mieux intacte et préservée. Ce protocole ne sert que de point de départ.

Comme pour toute autre immunohistochimie, différents anticorps nécessitent des conditions différentes et doivent être optimisés individuellement. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos taches.