Split-ubiquitine membrane à base de levure double hybride (MYTH) Système: Un outil puissant pour identifier les interactions entre protéines

Le système myth repose sur le concept de l'ubiquitine fractionnée, qui fait référence à la capacité de l'ubiquitine à être stablement séparée en deux moitiés, l'une N-terminale appelée NUBI et l'autre C-terminale appelée CUB, capables de se réassembler en une molécule pseudo-ubiquitine complète. Bien que cette réassemblage soit spontané lorsqu'on utilise la forme sauvage de NUBI, l'introduction d'une mutation isoleucine 13 en glycine, produisant un fragment appelé NUBG, réduit fortement son affinité pour CUB, bloquant ainsi la formation de la pseudo-ubiquitine. Si NUBG et CUB sont fusionnés respectivement à la protéine A et à la protéine B, et que A et B sont capables d'interagir, alors la molécule de pseudo-ubiquitine peut à nouveau se former.

Dans le système MYTH, les amorces membranaires intégrales sont fusionnées à un domaine d'attache composé du fragment CUB lié à un facteur de transcription artificiel. Tandis que les proies sont fusionnées au fragment NUBG, une interaction entre l'amorce et la proie conduit à la reconstitution d'une pseudo-ubiquitine, qui peut ensuite être reconnue par des enzymes déubiquitinantes cytosoliques, illustrées sous forme de ciseaux. Ces enzymes effectuent une coupure après le C-terminal du CUB, libérant ainsi le facteur de transcription, qui peut ensuite pénétrer dans le noyau et activer le système rapporteur, permettant l'isolement sélectif et l'identification des cellules dans lesquelles se produisent des interactions entre BA et proies.

Bonjour, je suis Janie Snyder du laboratoire Igor STAARs, dans les départements de génétique moléculaire et de biochimie à l'Université de Toronto. Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure de double hybride sur membrane, ou myth, que nous utilisons dans notre laboratoire pour étudier les interactions entre protéines membranaires intégrales. Commençons donc.

Avant de procéder à l'analyse myth, vérifiez que votre protéine cible possède son extrémité N-terminale ou C-terminale dans le cytosol de la cellule. La balise CUB Lex A VP 16 doit être fusionnée à votre protéine à l'une de ces extrémités. Étant donné que les enzymes déubiquitinantes nécessaires à la libération du facteur de transcription se trouvent dans le cytosol, si la topologie de votre protéine cible n'est pas connue, vous pouvez générer des constructions portant une balise à l'extrémité N-terminale ou C-terminale et utiliser le test témoin N-U-B-G-I décrit ci-après, afin de déterminer si l'une d'elles convient pour l'analyse myth, indiquant ainsi qu'une extrémité particulière est cytosolique.

Ensuite, déterminez quelle variante des deux grands types de myth convient à votre expérience. Pour les protéines natives de levure, la méthode privilégiée est le myth intégré, ou immy. Dans immy, les protéines sont marquées de façon endogène avec une étiquette CUB-LexA-VP16, ce qui les maintient sous le contrôle de leur promoteur natif.

Cela présente un avantage car le niveau d'expression du type sauvage de Bates permet d'éliminer les problèmes associés à la surexpression protéique, tels qu'un nombre accru de faux positifs pour les protéines non natives de levure. On peut utiliser le mythe traditionnel ou le T mythe, dans lequel l'appât marqué CU B Lex A V VP 16 est surexprimé de façon ectopique à partir d'un plasmide. Nous nous concentrerons sur le T mythe dans ce protocole, car cette forme de mythe est plus largement applicable. Hormis la construction initiale de l'appât et le milieu utilisé, les deux formes de mythe sont réalisées de manière essentiellement identique. L'appât doit être cloné dans un vecteur approprié pour le marquage et l'expression.

Plusieurs vecteurs T myth sont actuellement disponibles, tels que BV four, p, a, BV four et PCM BV four, qui permettent la construction de Bates, Beit Cub Lexie, VP 16, marqués en C-terminal, sous le contrôle d'un promoteur TF un très fort, d'un promoteur A DH un fort et d'un promoteur CYC un faible, respectivement. Une fois que l'effecteur cible a été sélectionné, une digestion par enzymes de restriction est effectuée sur le plasmide au site de restriction approprié. La coupure doit se produire uniquement à proximité immédiate de l'étiquette CU B Lxe VP 16 en amont de la marque pour un marquage en C-terminal ou en aval pour un marquage en N-terminal.

Par exemple, lors de l'utilisation du vecteur PAM BV, SFI est un choix idéal ; après digestion du plasmide, conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu'à son utilisation. La prochaine étape consiste à concevoir des amorces pour l'amplification et le clonage du gène d'intérêt. L'extrémité 5' de votre amorce directe doit correspondre à environ 35 à 40 nucléotides en amont du site de restriction, tandis que l'extrémité 3' doit correspondre aux 18 à 20 premiers nucléotides du gène cible, qui est un DRB2 codant pour le récepteur bêta deux et générique.

Dans notre exemple, l'extrémité 5' de l'amorce reverse doit correspondre au complément inverse d'environ 35 à 40 nucléotides en aval du site de restriction. L'extrémité 3' doit correspondre au complément inverse des 18 à 20 derniers nucléotides du gène cible, en omettant le codon d'arrêt si une étiquette CU B Lex VP 16 est placée au niveau du terminus C, comme c'est le cas dans l'exemple présenté. Selon qu'un marquage en N- ou en C-terminus est effectué, assurez-vous que les 35 à 40 nucléotides sélectionnés de la séquence plasmidique utilisés dans l'amorce directe ou reverse permettent le clonage du gène cible en phase avec le CU B Lex et l'étiquette VP 16. Étant donné que, dans notre exemple, le terminus C de la protéine A DRB deux sera marqué.

Les 35 bases de la séquence A MBV présentes dans l'amorce reverse ont été choisies de manière à ce que les séquences du gène A DRB deux et du gène CUB se trouvent dans le même cadre de lecture ; amplifiez le gène d'intérêt par PCR en utilisant les amorces sélectionnées. Les paramètres de la PCR dépendront de l'enzyme particulière et des amorces spécifiques utilisées afin de fournir un environnement propice à la recombinaison homologue par réparation de lacune. Le plasmide préalablement digéré et le gène d'intérêt amplifié sont transformés dans une souche de levure appropriée en utilisant un protocole standard de transformation de levure, tel que celui décrit par Geets et Woods.

Une fois que la levure transformée a poussé sur la boîte, sélectionnez une colonie unique de la souche et inoculez-la dans cinq millilitres de milieu SD privé de leucine. Faites croître le milieu liquide à 30 degrés Celsius pendant la nuit, après que la culture ait atteint la saturation. Centrifugez les cellules à 700 ×g pendant cinq minutes, éliminez le surnageant, puis isolez l'ADN plasmidique du leurre à partir du culot cellulaire à l'aide de n'importe quel kit de minipréparation commercial.

Suivez le protocole standard avec une modification afin de garantir une lyse cellulaire suffisante des levures à un petit volume de 0,5 millimolaire de billes en verre sodocalcique ajouté au culot après la resuspension initiale, puis vortexez vigoureusement pendant cinq minutes. Ensuite, poursuivez selon le protocole commercial habituel. Transformez l'ADN de levure isolé dans une souche d'e coli chimiquement compétente, adaptée à la propagation de plasmides, avec une efficacité de transformation d'au moins 1 × 10⁷ cellules par microgramme d'ADN.

Après avoir récupéré l'ADN plasmidique des e coli transformés, vérifiez la construction correcte du plasmide d'appât par séquençage avant utilisation. Les souches d'appât doivent être analysées afin de s'assurer que les protéines d'appât sont correctement localisées dans la membrane des levures. La localisation est déterminée par microscopie à fluorescence. L'incorporation d'une molécule YFP dans la séquence du marqueur d'appât permettra une visualisation directe des cellules vivantes et est couramment utilisée en imy.

Alternativement, une approche standard d'immunofluorescence utilisant un anticorps dirigé contre les composants Lex A ou VP 16 de l'étiquette peut être utilisée une fois la localisation adéquate de l'appât établie. Il est nécessaire de s'assurer que l'appât n'active pas par lui-même l'IE, c'est-à-dire qu'il n'active pas le système rapporteur seul ou en présence d'une protéine contrôle non interagissante ; pour vérifier que l'appât n'est pas auto-activateur, nous utilisons le test N-U-B-G-I. Dans ce test.

L'appât est transformé avec un contrôle positif interactif et un contrôle négatif non interactif, puis différentes dilutions de chaque transformant sont déposées sur un milieu sélectif approprié. L'appât doit croître sur le milieu sélectif en présence du témoin positif et ne doit pas croître en présence du témoin négatif afin d'être adapté à une utilisation en MYTH. Une fois l'appât validé, la souche rapporteur MYTH contenant l'appât peut être transformée avec une bibliothèque d'éléments pièges d'intérêt afin de rechercher des interactions protéine-protéine.

Pour commencer cette transformation à grande échelle chez la levure, inoculer une colonie unique de la souche rapporteur myth contenant votre appât dans cinq millilitres de milieu SD privé de leucine et incuber toute la nuit à 30 degrés Celsius sous agitation. Diluer la culture de nuit dans 200 millilitres de milieu SD privé de leucine et incuber à 30 degrés Celsius sous agitation jusqu'à ce qu'une DO 600 de 0,6 à 0,7 soit atteinte. Une fois la DO 600 cible atteinte, répartir la culture de 200 millilitres dans quatre tubes de centrifugation de 50 millilitres à bouchon vissable et récolter les cellules par centrifugation.

Après avoir lavé les culots avec de l'eau doublement distillée stérile et une solution de tris-acétate de lithium DTA, nous suspendons chaque culot dans 600 microlitres de solution de tris-acétate de lithium DTA dans chacun des quatre tubes coniques de 15 millilitres. Ajouter 2,5 millilitres de solution de PEG-acétate de lithium à 600 microlitres de cellules resuspendues, 100 microlitres de solution d'ADN de sperme de saumon et sept microgrammes d'ADN de la banque de proies quatre. Agiter les tubes pendant une minute afin d'assurer un mélange complet, puis incuber dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 45 minutes.

Mélanger brièvement toutes les 15 minutes après l'incubation de 45 minutes. Ajouter 160 microlitres de diméthylsulfoxyde ou DMSO dans chaque tube et mélanger immédiatement en retournant les tubes. Incuber dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Lorsque le choc thermique est terminé, recueillir les cellules par centrifugation et resus. Suspendre chaque culot dans trois millilitres de deux X-Y-P-A-D. Rassembler tous les échantillons dans un seul tube à centrifuger de 50 millilitres à bouchon vissé.

Incuber les cellules à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes pour la récupération cellulaire. Centrifuger les cellules et resuspendre le culot cellulaire dans 4,9 millilitres de chlorure de sodium stérile à 0,9 % en utilisant 100 microlitres de cellules resuspendues. Préparer des dilutions sérielles dix fois dans du chlorure de sodium stérile à 0,9 % allant de 10 x à 10 000 x, déposer 100 microlitres des dilutions 100 x et 1000 x sur un milieu sélectif et incuber à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.

Ces plaques servent de témoin et sont utilisées pour calculer de manière équivalente l'efficacité de la transformation. Répartir les 4,8 millilitres restants de cellules resuspendues et les ensemencer sur de grandes plaques de 150 millimètres, puis incuber à 30 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Une fois les colonies développées, resuspendre individuellement des colonies isolées, chacune représentant des cellules contenant un couple appât-partenaire d'interaction potentiel, dans 100 microlitres de chlorure de sodium à 0,9 %, et ensemencer des aliquotes de cinq microlitres dans un milieu sélectif contenant du XG ; laisser croître pendant deux à quatre jours seulement.

Les colonies présentant une croissance vigoureuse et une couleur bleue sont sélectionnées pour une analyse supplémentaire. Après avoir isolé et séquencé les plasmides à partir des colonies de levure positives, compilez et analysez toutes les données de séquençage afin d'établir votre liste préliminaire d'interacteurs. Pour vérifier à nouveau ces interactions, on utilise le test de dépendance à l'appât.

Dans ce test, tous les plasmides prédateurs exprimant les interagisseurs identifiés sont transformés à nouveau dans la souche appât d'origine ainsi que dans la souche contenant un appât artificiel contrôle composé d'un seul domaine transmembranaire fusionné au CUB Lex, une étiquette VP16. Resuspendre des colonies isolées issues de ces transformations dans 100 microlitres d'eau stérile doublement distillée et déposer des volumes de cinq microlitres sur le milieu sélectif approprié contenant du X sc. Idéalement, plusieurs transformants doivent être sélectionnés pour chaque prédateur, et à la fois l'appât d'origine et l'appât artificiel doivent être déposés sur la même boîte de culture. Incuber les boîtes pendant deux à quatre jours à 30 degrés Celsius. Les souches de levure portant l'appât artificiel dans lesquelles un prédateur provoque l'activation du système rapporteur sont considérées comme promiscues, et ce prédateur spécifique est éliminé de la liste des interagisseurs.

Des éloges qui provoquent une croissance et une coloration bleue chez la levure contenant l'appât d'intérêt, mais pas l'appât artificiel. Confirmer une interaction spécifique. Toutefois, si les levures contenant l'élément cible et votre appât d'intérêt ne croissent pas.

Cette proie est retirée de la liste des interagisseurs. Les proies restantes constituent la liste complète des interagisseurs identifiés lors du criblage myth. Une fois la procédure myth terminée, vous disposerez d'une carte d'interactions.

Ceci représente une collection d'interactions candidates que le chercheur doit analyser plus en détail à l'aide d'études spécifiques déterminées au cas par cas. Pour évaluer la signification biologique de chacune, nous venons de vous montrer comment réaliser la membrane E deux hybride, ou procédure myth, afin d'identifier les partenaires d'interaction d'une protéine d'intérêt. Lors de la réalisation de la procédure myth, il est important de vérifier que votre protéine d'intérêt possède son extrémité N-terminale ou C-terminale située dans le cytosol de la cellule, et de concevoir votre stratégie de marquage en conséquence.

En outre, il est important d'évaluer attentivement que vos souches d'appât expriment correctement l'appât et que celui-ci soit correctement localisé. Par ailleurs, il est essentiel de réaliser le test de contrôle NUB GI, car il est utile pour aider à établir les conditions de criblage. Enfin, veillez à vérifier indépendamment toutes les interactions que vous détectez à l'aide du système myth.

Suivre ces étapes simples devrait vous permettre d'obtenir les meilleurs résultats possibles avec la procédure myth. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.