Split-ubiquitine membrane à base de levure double hybride (MYTH) Système: Un outil puissant pour identifier les interactions entre protéines

Le système mythique est basé sur le concept d’ubiquitine divisée, qui fait référence à la capacité de l’ubiquitine à être séparée de manière stable en moitiés terminales terminales et CUB terminales UBI et C capables de se reconstituer en une molécule de pseudo ubiquitine pleine longueur. Alors que cette reconstitution est spontanée lors de l’utilisation d’un NUBI de type sauvage, l’introduction d’un ISIN 13 à la mutation de la glycine, la production d’un fragment appelé NUBG réduit considérablement son affinité pour le CUV, bloquant ainsi la formation de pseu ubiquitine. Si le NUBG et le CUB sont fusionnés respectivement avec les protéines A et B et que A et B sont capables d’interaction, alors la molécule d’ubiquitine pseu peut à nouveau être formée.

Dans le mythe, les appâts à membrane intégrale sont fusionnés à l’attaque en se composant du fragment CUB lié à un facteur de transcription artificiel. Alors que les éloges sont fusionnés au fragment NUBG, une interaction entre l’appât et la proie conduit à la reconstitution de la pseudo ubiquitine, qui à son tour peut être reconnue par des enzymes cytosoliques de ubiquitination illustrées par des ciseaux. Ces enzymes se clivent après l’extrémité C de CUB, libérant le facteur de transcription, qui peut ensuite pénétrer dans le noyau et le système rapporteur de l’activateur, ce qui permet l’isolement sélectif et l’identification des cellules dans lesquelles se produisent des interactions BA proies.

Bonjour, je m’appelle Janie Snyder et je travaille dans le laboratoire d’Igor STAARs, dans les départements de génétique moléculaire et de biochimie de l’Université de Toronto. Aujourd’hui, je vais vous montrer une procédure pour l’utilisation membranaire de deux hybrides ou mythes, et nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les interactions des protéines membranaires intégrales. Alors commençons.

Avant d’effectuer une analyse de mythe, vérifiez que votre protéine d’appât a son extrémité N et / ou C dans le cytosol de la cellule. L’étiquette CUB Lex A VP 16 doit être fusionnée à votre protéine à une telle extrémité. Étant donné que les enzymes désubiquitinées nécessaires à la libération du facteur de transcription sont situées dans le cytosol, si la topologie de votre protéine d’appât n’est pas connue, vous pouvez générer des constructions marquées à la fois à l’extrémité NNC et à l’aide du test de contrôle N-U-B-G-I décrivez brièvement, voyez si l’un ou l’autre d’entre eux convient à une utilisation dans le mythe, indiquant ainsi qu’une terminaison particulière est cytosolique.

Ensuite, décidez laquelle des deux principales variantes du mythe convient à votre expérience. Pour les protéines de levure natives, la méthode intégrée myth ou immy est la méthode de choix. À Imy, les Bates sont étiquetés de manière endogène avec le CUB Lex un tag VP 16, ce qui les laisse sous le contrôle de leur promoteur natif.

Ceci est avantageux car le niveau d’expression de type sauvage de Bates aide à éliminer les problèmes associés à la surexpression des protéines, tels qu’un nombre accru de faux positifs pour les protéines de levure non natives, un mythe traditionnel ou un mythe T peut être utilisé dans lequel les appâts de marquage CU B Lex A V VP 16 sont surexprimés ECT localement à partir d’un plasmide. Nous nous concentrerons sur le mythe T dans ce protocole puisque cette forme de mythe est plus largement applicable à l’exception de la construction initiale de l’appât et des supports utilisés, les deux formes de mythe sont réalisées de manière essentiellement identique. L’appât doit être cloné en un vecteur approprié pour le marquage et l’expression.

Une variété de vecteurs du mythe T sont actuellement disponibles, tels que BV quatre, p, a, BV quatre et PCM BV quatre, qui permettent la construction de c marqué en phase terminale Bates, Beit Cub Lexie, VP 16 sous le contrôle d’un TF très fort, d’un fort A DH et d’un faible CYC un promoteur respectivement. Une fois que l’effecteur de l’équipe a été sélectionné, la restriction digère le plasmide au site de restriction approprié. Le clivage ne doit avoir lieu qu’à proximité immédiate de l’étiquette CU B Lxe VP 16 en amont de l’étiquette pour l’étiquetage des bornes C ou en aval pour l’étiquetage des bornes N.

Par exemple, lors de l’utilisation du vecteur PAM BV, SFI one est un choix idéal, une fois que le plasmide a été digéré, stocké à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi, l’étape suivante consiste à concevoir des amorces pour l’amplification et le clonage du gène d’intérêt. L’extrémité cinq premières de votre amorce directe doit correspondre à environ 35 à 40 nucléotides en amont du site de restriction. Alors que les trois premières extrémités doivent correspondre aux 18 à 20 premiers nucléotides du gène cible, qui est un DRB deux codant pour le bêta deux et le récepteur générique.

Dans notre exemple, l’extrémité cinq premières de l’amorce inverse doit correspondre au complément inverse d’environ 35 à 40 nucléotides en aval du site de restriction. Avec les trois extrémités premières correspondant au complément inverse des 18 à 20 derniers nucléotides du gène cible, en omettant le code d’arrêt si l’étiquette CUB Lex disons VP 16 est placée à l’extrémité C comme c’est le cas dans l’exemple illustré, selon que l’étiquetage terminal N ou C est effectué, s’assurer que les 35 à 40 nucléotides sélectionnés de la séquence plasmidique utilisés dans l’amorce directe ou inverse aboutissent au clonage du gène cible dans le cadre avec le CU B Lex, une balise VP 16. Puisque dans notre exemple, l’extrémité C de la protéine A DRB two sera marquée.

Les 35 bases de la séquence A MBV dans l’amorce inverse ont été sélectionnées de telle sorte que les séquences des gènes A DRB two et CUB se trouvent dans le même cadre de lecture, amplifient le gène d’intérêt par PCR à l’aide des amorces sélectionnées. Les paramètres de la PCR dépendront de l’enzyme particulière et des amorces spécifiques utilisées pour fournir un environnement dans lequel la recombinaison homologue de réparation de l’espace peut se produire. Le plasmide précédemment digéré et le gène d’intérêt amplifié sont transformés en une souche de levure appropriée à l’aide d’un protocole standard de transformation de levure tel que celui décrit par Geets et Woods.

Une fois que la levure transformée s’est développée sur l’assiette, prélevez une seule colonie de la souche et inocunez-la dans cinq millilitres de SD moins la leucine. Les milieux liquides poussent à 30 degrés Celsius pendant la nuit après que la culture ait poussé pendant la nuit et atteint la saturation. Centrifugez les cellules à 700 GS toutes les cinq minutes et retirez l’ADN plasmatique de l’appât d’isolat surnageant de la pastille cellulaire à l’aide de n’importe quel mini kit de préparation commercial.

Suivez le protocole standard avec une modification afin d’assurer une lyse suffisante des cellules de levure à un petit volume de 0,5 millimolaire de billes de verre sodocalcique sur le granulé après la suspension initiale du réus et tourbillonnez vigoureusement pendant cinq minutes. Procédez ensuite au protocole commercial comme d’habitude. Transformer l’ADN de levure isolé en une souche d’e coli chimiquement compétente adaptée à la propagation plasmidique avec une efficacité de transformation d’au moins une fois 10 à la septième cellule par microgramme d’ADN.

Après avoir récolté l’ADN plasmatique de l’e coli transformé, vérifiez la bonne construction du plasmide de l’appât par séquençage avant utilisation. Les souches d’appât doivent être analysées pour s’assurer que les protéines de l’appât sont correctement localisées à la membrane de la levure. La localisation est déterminée à l’aide de la microscopie à fluorescence. L’inclusion d’une molécule YFP dans la séquence de l’étiquette d’appât permettra une visualisation directe des cellules vivantes et est couramment utilisée dans le monde.

Alternativement, une approche standard d’immunofluorescence utilisant des anticorps contre les composants Lex A ou VP 16 de l’étiquette peut être utilisée une fois que la localisation appropriée de l’appât a été établie. Il est nécessaire de s’assurer que l’appât ne s’active pas automatiquement, qu’il n’active pas le système de rapporteur seul ou en présence d’éloges non interactifs pour s’assurer que l’appât ne s’active pas automatiquement, nous utilisons le test N-U-B-G-I. Dans ce test.

L’appât est transformé avec des éloges de contrôle positifs et négatifs non interactifs, puis différentes dilutions de chaque transformant sont repérées sur des milieux sélectifs appropriés. Abate doit se développer sur un milieu sélectif en présence du témoin positif et ne se développe pas en présence du témoin négatif afin de pouvoir être utilisé dans le mythe. Une fois l’appât validé, la souche rapporteuse de mythe contenant l’appât peut être transformée avec une bibliothèque de proies d’intérêt pour dépister les interactions protéiques-protéines.

Pour commencer cette transformation de levure à grande échelle, inoculez une seule colonie de la souche mytho-rapporteuse contenant votre appât dans cinq millilitres de SD moins leucine milieu et incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius en secouant. Diluez la culture de nuit dans 200 millilitres de milieu SD moins leucine et incubez à 30 degrés Celsius en secouant jusqu’à ce qu’elle atteigne une DO 600 de 0,6 à 0,7. Lorsque l’objectif OD 600 a été atteint, répartissez la culture de 200 millilitres entre quatre tubes à centrifuger à bouchon à vis de 50 millilitres et récoltez les cellules par centrifugation.

Après avoir lavé les granulés avec de l’eau stérile doublement distillée et une solution d’acétate de lithium trissy DTA, nous suspendons chaque granulé dans 600 microlitres de solution d’acétate de lithium trissy DTA dans chacun des quatre tubes à centrifuger à vis de 15 millilitres. Ajoutez 2,5 millilitres de solution d’acétate de lithium PEG, deux 600 microlitres de cellules remises en suspension, 100 microlitres de solution d’ADN de spermatozoïde de saumon et sept microgrammes d’ADN de proie. Textez les tubes pendant une minute pour assurer un mélange complet, puis incubez dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 45 minutes.

Mélanger brièvement toutes les 15 minutes après l’incubation de 45 minutes. Ajoutez 160 microlitres de diméthylsulfoxyde ou DMSO dans chaque tube et mélangez immédiatement en inversant les tubes. Incuber au bain-marie à 42 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Lorsque le choc thermique est terminé, collectez les cellules par centrifugation et réanimation. Suspendez chacun des granulés dans trois millilitres de deux X-Y-P-A-D. Rassemblez tous les échantillons dans un seul tube à centrifuger à bouchon à vis de 50 millilitres.

Incuber les cellules à 30 degrés Celsius pendant 90 minutes pour la récupération cellulaire. Centrifugez les cellules et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 4,9 millilitres de chlorure de sodium stérile à 0,9 % en utilisant 100 microlitres de cellules remises en suspension. Préparez une dilution en série dix fois plus importante dans du chlorure de sodium stérile à 0,9 % allant de 10 x à 10 000 x plaque, 100 microlitres de dilution 100 x et 1000 x sur un milieu sélectif et incubez à 30 degrés Celsius pendant deux à trois jours.

Ces plaques servent de contrôle et sont utilisées pour calculer l’efficacité de la transformation de manière égale. Répartissez les 4,8 millilitres restants de cellules remises en suspension et la plaque sur de grandes plaques de 150 millimètres et incubez à 30 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Une fois que les colonies ont grandi, résanimez suspendre des colonies uniques représentant chacune des cellules contenant une paire de proies appât en interaction potentielle dans 100 microlitres de chlorure de sodium à 0,9 % et plaquez cinq aliquotes de microlitres dans des milieux sélectifs contenant XG pour permettre de croître pendant deux à quatre jours seulement.

Les colonies qui présentent une croissance robuste et une couleur bleue sont sélectionnées pour une analyse plus approfondie. Après avoir isolé et séquencé les plasmides des colonies de levures positives, compilez et analysez toutes les données de séquençage pour assembler votre liste préliminaire d’interacteurs. Pour revérifier ces interactions, le test de dépendance de l’appât est utilisé.

Dans cet essai, tous les plasmes de proie exprimant les interacteurs identifiés sont retransformés en souche d’appât d’origine ainsi qu’en souche hébergeant un appât artificiel témoin composé d’un seul domaine transmembranaire fusionné au CUB Lex, d’une étiquette VP 16 qui remet en suspension des colonies uniques de ces transformations dans 100 microlitres d’eau stérile doublement distillée et de volumes de cinq microlitres sous le milieu sélectif approprié plus X sc. Idéalement, Plusieurs transformants doivent être sélectionnés pour chaque proie et l’appât d’origine et l’appât artificiel doivent être repérés sur la même plaque. Incuber les plaques pendant deux à quatre jours à 30 degrés Celsius, les levures transportant l’appât artificiel chez les proies qui provoquent l’activation du système rapporteur sont considérées comme des promiscuités et cette proie spécifique est retirée de la liste des interacteurs.

Éloge qui provoque la croissance et la coloration bleue chez les levures avec l’appât d’intérêt mais pas l’appât artificiel. Confirmez une interaction spécifique. Si toutefois, les levures hébergeant la proie et votre appât d’intérêt ne poussent pas.

Cette proie est retirée de la liste des interacteurs. Les éloges restants constituent la liste complète des interacteurs identifiés dans l’écran du mythe. À la fin de la procédure de mythe, vous aurez une carte d’accueil interactive.

Il s’agit d’un ensemble d’interactions candidates que le chercheur doit analyser davantage à l’aide d’études spécifiques déterminées au cas par cas. Pour évaluer la signification biologique de chacun, nous venons de vous montrer comment réaliser la procédure de membrane E deux hybride ou mythe pour identifier les partenaires en interaction d’une protéine d’intérêt. Lors de l’exécution de la procédure de mythe, il est important de vérifier que votre extrémité et / ou l’extrémité C de votre objet d’intérêt sont situées dans le cito de la cellule, et de concevoir votre stratégie de balisage en conséquence.

De plus, il est important d’évaluer soigneusement que vos souches d’appât expriment correctement l’appât et que l’appât est correctement localisé. De plus, il est important d’effectuer le test de contrôle gastro-intestinal NUB, car il est utile pour aider à établir les conditions de dépistage. Enfin, assurez-vous de vérifier de manière indépendante toutes les interactions que vous détectez à l’aide de myth.

En suivant ces étapes simples, vous devriez vous assurer d’obtenir les meilleurs résultats possibles de la procédure du mythe. Eh bien, c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.