Pulse-chase Analyse des chaînes de sucre N-glycoprotéines liées à des cellules de mammifères

L'analyse des chaînes glucidiques non liées sur les glycoprotéines commence par le marquage des glycanes et des cellules avec du mannose tritié. La boîte de pulse est refroidie sur de la glace tandis que la boîte de chase est incubée sans marqueur pendant une durée de chase souhaitée. Ensuite, les échantillons sont lysés et une glycoprotéine d'intérêt est immunopurifiée, dénaturée, puis ses glycanes sont libérés enzymatiquement.

Les oligosaccharides sont ensuite purifiés par filtration moléculaire, qui les sépare des protéines et des autres contaminants de taille supérieure à 30 kilodaltons. Les glycanes sont ensuite séparés par HPLC. La quantité de chaque forme de glycan est déterminée en mesurant l'intensité du signal radioactif dans chaque fraction élutée.

Bonjour, je suis Edward Azo du laboratoire de Hi Geraldo Letter Kremer, du Département de recherche cellulaire et d'immunologie de l'Université de Tel Aviv. Je fais également partie du bloc Gerardo Letter Kremer. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement et d'analyse d'oligosaccharides marqués métaboliquement et liés.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la dynamique du traitement des chaînes glucidiques, tant pour les pools totaux de glycoprotéines cellulaires que pour des glycoprotéines individuelles. Bon, maintenant, commençons. Pour débuter cette procédure, utilisez des cellules NIH 3T3 cultivées pendant une nuit dans une boîte de 90 millimètres.

Pour chaque échantillon, la culture est sous-confluente afin de priver les cellules de glucose ; préparez un nouveau milieu sans glucose deux fois concentré, supplémenté avec 20 % de FCS dialysée et 8 millimolaire de pyruvate de sodium. Diluez un volume de la quantité souhaitée du milieu deux fois concentré avec un volume d'eau déionisée. Préchauffez le milieu, puis incubez chaque échantillon cellulaire dans 5 millilitres du milieu frais préchauffé pendant 5 à 15 minutes. Si une phase de chase de plus de 12 heures est requise, les cellules doivent être manipulées en conditions stériles.

À la fin de la période d'incubation, marquer les boîtes correspondant aux échantillons pulse et chase. Pour marquer les glycanes N en vue de l'analyse des glycoprotéines par immunoprécipitation, remplacer le milieu de privation par un millilitre de milieu sans glucose préchauffé, supplémenté avec 400 microcuries par millilitre de deux manoses marqués au tritium. Utiliser 65 microcuries par millilitre pour le marquage et l'analyse des glycoprotéines totales.

Après avoir remplacé le milieu de privation, incuber les cellules dans des conditions normales de culture tissulaire pendant une heure. À la fin de l'incubation d'une heure, retirer le milieu de marquage de tous les échantillons. Ajouter soigneusement deux millilitres de PBS à quatre degrés Celsius aux échantillons correspondant au pulse et les placer sur de la glace. Ces échantillons sont appelés pulses.

Utilisez deux millilitres de milieu de culture complet normal préchauffé. Rincez les échantillons de chase trois fois. Ensuite, ajoutez cinq millilitres du milieu régulier préchauffé aux cellules.

Placer les échantillons de chasse dans un incubateur à dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant les durées de chasse souhaitées. Pendant l'incubation des échantillons de chasse, rincer les échantillons de pulse, laissés sur de la glace, trois fois avec deux millilitres de PBS glacé. Ensuite, utiliser un grattoir à cellules pour détacher les cellules de la boîte.

Dans deux millilitres de PBS, placer les cellules libérées dans un tube EOR de deux millilitres. Faire une courte centrifugation des cellules à 16 000 ×g pendant six à dix secondes pour éliminer le surnageant et congeler le culot cellulaire à moins 80 degrés Celsius. Une fois l'incubation des échantillons de relargage terminée, les rincer.

Faire centrifuger et conserver comme indiqué ci-dessus pour les échantillons de pouls. Une fois prêt à poursuivre la lyse cellulaire, retirer les cellules du congélateur. Pour l'analyse par IP, lyser les cellules en ajoutant 300 microlitres de tampon.

Vortexer brièvement et incuber 20 minutes sur de la glace. Pour l'analyse des échantillons de glycoprotéines totales, ajouter 300 microlitres de tampon B. Incuber les cellules 20 minutes sur de la glace, puis réaliser une sonication quatre fois, 10 secondes à chaque fois, à amplitude maximale. Ensuite, faire bouillir les échantillons pendant cinq minutes.

Enfin, centrifuger tous les lysats à 16 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un nouveau tube EOR et éliminer le culot. Passer à l'IP pour examiner une protéine d'intérêt par immunoprécipitation de la glycoprotéine H deux A présentée ici.

Ajouter 20 microlitres par échantillon de protéine A agro speeds et trois microlitres par échantillon de l'anticorps polyclonal de lapin anti H deux A du laboratoire au surnageant des cellules lysées. Incuber les échantillons pendant quatre à 16 heures à quatre degrés Celsius, en mélangeant constamment par rotation lente. À la fin de l'incubation, centrifuger les billes et retirer soigneusement le surnageant à l’aide d’un vide, puis rincer les billes quatre fois en ajoutant 500 microlitres de tampon T.

Effectuez quatre centrifugations en vortexant les billes et en éliminant le surnageant pour libérer les protéines liées aux billes. Ajoutez 10 microlitres de tampon dénaturant provenant du kit endo H au culot de billes et faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes. Centrifugez à nouveau les billes et transférez le surnageant dans un nouveau tube EOR.

Les protéines ellu sont désormais prêtes pour la déglycosylation. Les glycanes sont libérés à partir des échantillons d'IP et des échantillons totaux de protéines à l'aide de l'enzyme et de OH. Pour les échantillons d'IP, ajoutez 0,5 microlitre d'enzyme endo H à chaque échantillon, ainsi que 10 microlitres de tampon de réaction endo H deux fois concentré. Incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant trois heures.

Pour les glycoprotéines totales, appliquez le surnageant des lysats cellulaires sur un filtre MicroCon ayant un seuil de coupure de 30 kilodaltons. Lavez l'extrait protéique total trois fois avec 100 microlitres de tampon E par des centrifugations répétées à 14 000 Gs pendant trois minutes. Ajoutez trois microlitres de tampon de réaction endo H 10 x et 1,5 microlitre de l'enzyme endo H sur le MicroCon, là où les protéines lavées sont retenues, puis incubez pendant trois heures à 37 degrés Celsius en parallèle avec les échantillons d'IP.

À la fin de l'incubation de trois heures, diluez l'échantillon d'IP cinq fois avec de l'eau déionisée et déposez-le sur un nouveau filtre MicroCon. Centrifugez à 14 000 G pendant trois minutes. Procédez au lavage des échantillons d'IP et de protéines totales en ajoutant 50 microlitres d'eau déionisée, puis centrifugez les échantillons. Répétez cette opération deux fois supplémentaires. Conservez le flux sortant contenant les glycanes clivés si désiré, à travers les tampons contenant les glycoprotéines résistantes à l'endo H. Incubez ensuite les glycoprotéines résistantes avec 200 milliunités de N-glycosidase F dans 15 microlitres de tampon C à 37 degrés Celsius pendant 16 heures.

L'élution avec de l'eau déionisée est effectuée comme vient de l'être montré. Sécher complètement les échantillons à l'aide d'un concentrateur à vortex chauffé jusqu'à 45 degrés Celsius pour accélérer le processus. Re-suspendre les culots secs dans 12 microlitres de solvant HPLC et charger les échantillons sur une colonne sphère ou amino installée dans l'appareil HPLC.

Exécutez les échantillons comme décrit dans le protocole écrit joint. Récupérez 48 fractions pour chaque injection d'échantillon. Utilisez un compteur à scintillation pour mesurer les valeurs de CPM des fractions recueillies et tracez la lecture de CPM en fonction du numéro de fraction.

Calculez le pourcentage de résidus de manos parmi toutes les espèces de glycanes comme décrit dans le protocole écrit d'accompagnement. Voici des résultats représentatifs de l'analyse des chaînes glucidiques de glycoprotéines totales provenant d'un échantillon marqué en pulse d'une heure. Le signal en CPM des fractions HPLC est tracé en fonction du numéro de fraction dans le profil obtenu.

Chaque pic représente une espèce spécifique de glycanes identifiée par une course de chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) à l'aide d'étalons de glycanes connus. Pour chaque espèce de glycanes, son pourcentage molaire par rapport au total des glycanes est tracé en fonction du temps de rétention. Le temps indiqué ici correspond à une telle analyse pour une glycoprotéine mal repliée spécifique, isolée par immunoprécipitation à partir d'un échantillon traité avec l'inhibiteur du protéasome MG 1 32.

L'espèce de glycan tronqué M cinq six s'accumule pendant la période de poursuite, conduisant à la conclusion que les oligosaccharides présents sur une protéine mal repliée subissent un élagage important du mannose avant leur dégradation. Ceci contraste avec les oligosaccharides présents sur l'ensemble des glycoprotéines provenant d'échantillons traités de la même manière : ici, M neuf huit reste l'espèce majeure de glycan pendant la poursuite, avec seulement une légère augmentation de la quantité de M cinq six. Cela conduit à la conclusion que seule une petite fraction du pool total de glycoprotéines est ciblée vers la dégradation des protéines associées au réticulum endoplasmique.

Raccourci rad. Comme expliqué plus en détail dans le protocole écrit accompagnant, nous venons de vous montrer comment utiliser une combinaison de palase dans des cellules vivantes et d'analyse par HPLC afin de suivre la dynamique de la composition des oligosaccharides libres au cours de la durée de vie d'une glycoprotéine. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'éviter toute contamination des échantillons de relais par des traces de substances radioactives, ce qui entraînerait un marquage indésirable des glycanes pendant les périodes de relais lors de la séparation par taille.

Il est également important de régler la HPLC à une pression constante afin d'assurer la reproductibilité de la fractionnement des glycanes. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.