Détection SDS-PAGE/Immunoblot de multimères de Aßi tissu cortical humain homogénats utilisant l'antigène démas

Ce protocole permet la détection d'une bêta maltase dans un tissu cortical humain. Tout d'abord, le tissu homogénéisé est soumis à une sonication par sonde et clarifié par une centrifugation à faible vitesse. Ensuite, les échantillons réduits sont portés à ébullition dans un tampon SDS et chargés sur un gel de polyacrylamide.

Les protéines du gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose et la membrane est chauffée à la vapeur dans une solution saline tamponnée au phosphate. Enfin, sur un agitateur orbital, la membrane est incubée toute la nuit dans un anticorps primaire, puis un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort, puis dans un réactif de luminol et de peroxyde avant exposition à un film radiographique. Bonjour, je suis Rebecca Rosen du laboratoire de Larry Walker du Département des neurosciences du Centre de recherche primatologique national Yerkes à l'Université Emory.

Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment détecter les multimères d'Abeta et l'homogénéité corticale à l'aide d'une électrophorèse sur gel SDS et d'un immunoblotting avec une récupération d'antigène induite par la chaleur. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les niveaux et la répartition des multimères d'Abeta distincts dans des tissus corticaux non fixés provenant de sujets humains atteints de la maladie d'Alzheimer et de primates non humains âgés. Commençons donc.

Commencez avec environ cent milligrammes de tissu cortical non fixé et homogénéisez en utilisant environ 400 microlitres de tampon glacé avec environ 30 mouvements réguliers du piston. Pour une concentration de 20 % poids par volume, le rapport entre la masse du tissu et le volume de tampon doit être d’un milligramme pour quatre microlitres. Après homogénéisation, transférez les homogénats dans un tube polypropylène de quatre millilitres et soumettez-les à une sonication par sonde trois fois cinq secondes à la puissance cinq.

Après la sonication, transférez les homogénats dans des tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre et centrifugez pendant cinq minutes à 3000 ×g. Retirez soigneusement les surnageants clarifiés et conservez des aliquotes de 50 microlitres de ces extraits à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. Ensuite, déterminez la concentration totale en protéines pour des aliquotes fraîchement décongelées d'homogénats clarifiés à l'aide d'un dosage au bio-acide ou au BCA, selon les instructions du fabricant. Les homogénats corticaux clarifiés à 20 % doivent présenter une concentration en protéines supérieure à cinq microgrammes par microlitre et peuvent donc être dilués au 1/10 pour se situer dans la plage de mesure du lecteur de plaques. Pour le dosage au BCA, préparez des réactions d'échantillons dénaturants en utilisant les mêmes aliquotes d'homogénats clarifiés.

Utilisez environ 50 à 60 microgrammes de protéines totales et ajustez le volume des homogénats corticaux en conséquence, de sorte que chacun contienne la même quantité totale de protéines. Préparez les échantillons à un volume total de 25 microlitres pour chaque gel trice 10 à 20 %. Pour chaque gel, préparez un témoin positif composé de 10 à cent nanogrammes de peptide synthétique a bêta 40 ou a bêta 42 dilué dans 1 X PBS jusqu'à 10 microlitres, avec 12,5 microlitres de tampon d'échantillonnage 2 X SDS et 2,5 microlitres d'agent réducteur 10 X.

Après avoir préparé tous les échantillons, y compris un vortex de contrôle bêta pendant cinq à dix secondes, chauffez-les dans un bain sec à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis faites rapidement tourner tous les tubes afin d'éliminer la condensation présente sur les bouchons. Chargez les échantillons sur un gel plongé dans du tampon de migration SDS-Tris contenu dans une cuve à gel, et chargez au moins un puits avec 10 microlitres d'un marqueur de poids moléculaire non dilué. Faites migrer le gel à une tension constante de 125 volts pendant environ 90 minutes, ou jusqu'à ce que le marqueur de quatre kilo Daltons se trouve à environ un centimètre du bas du gel.

Retirez soigneusement les gels des boîtiers en plastique et assemblez le sandwich de transfert selon les instructions du fabricant. Pré-humidifiez les tampons de transfert et pointez les membranes en nitrocellulose au micromètre avec du tampon tris glycine. Transférez le tampon et éliminez toutes les bulles présentes sur les tampons de transfert ou sur le sandwich composé de papier filtre et de membrane.

Remplir la chambre intérieure de l'appareil de transfert avec du tampon de transfert et la chambre extérieure avec de l'eau distillée. Effectuer le transfert pendant deux à trois heures à un courant constant de 25 milliampères. Une fois le transfert terminé, démonter le « sandwich » et placer les gels dans un récipient rempli d'eau distillée, tandis que les membranes sont placées dans un récipient contenant du 1 XPBS pour toutes les étapes du protocole.

Veillez à ce que les gels et les membranes soient entièrement recouverts de liquide afin d'éviter qu'ils ne s'assèchent. Pour visualiser l'efficacité du transfert des protéines, colorez les gels avec du colorant Simply Blue Safe non dilué pendant environ une heure et les membranes avec du colorant PON S red à 1 x pendant environ cinq minutes. Selon les instructions du fabricant, cette coloration n'interférera pas avec le immunoblotting.

Si la coloration révèle un transfert inefficace des protéines, modifiez le temps de transfert à l'étape trois pour la récupération de l'antigène. Dans un appareil de cuisson à la vapeur, scellez thermiquement la membrane dans un sachet en plastique CapEx de qualité supérieure rempli d'environ 50 millilitres de PBS 1X à température ambiante. Une fois que le sachet commence à gonfler, placez-le à plat dans un cuiseur vapeur préchauffé à 100 degrés Celsius et incubez pendant 15 minutes supplémentaires avant de l'extraire du cuiseur vapeur.

Laisser refroidir lentement la membrane avant de l'extraire de son sachet afin d'éviter tout froissement excessif à température ambiante. Retirer soigneusement la membrane du sachet et la rincer pendant cinq minutes dans un X1 PBS sur un agitateur orbital, suivi d'un rinçage de cinq minutes dans du TBST sur un agitateur orbital. Incuber ensuite la membrane dans la solution de blocage pendant une heure sur un agitateur orbital sans rinçage préalable, puis transférer la membrane dans un récipient contenant l'anticorps primaire 6E10, spécifique à la région terminale d'Abêta, dilué au 1/1000 à 1/5000 dans la solution de blocage.

Incuber pendant une heure sur un agitateur orbital à température ambiante, puis de 24 à 48 heures avec agitation à quatre degrés Celsius. Après un rinçage rapide, laver la membrane pendant 30 minutes. Effectuer ensuite trois rinçages de 10 minutes chacun dans du TBST sur un agitateur orbital.

Incuber la membrane dans l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase, dilué au 1/10 000 dans la solution de blocage, pendant 90 minutes sur agitateur à température ambiante. Dans ce protocole, nous utilisons un anticorps anti-US provenant de mouton. Rincer à nouveau la membrane pendant 30 minutes dans du TBST, en commençant par un rinçage rapide, suivi de trois rinçages de 10 minutes chacun sur un agitateur orbital.

Après le dernier rinçage, incuber la membrane dans des réactifs ECL Super Signal West Pico fraîchement préparés et non dilués pendant cinq minutes. Sur l'agitateurbain à haute vitesse, retirer la membrane et éliminer l'excès de réactif. À l'aide de papier filtre sans peluches ou de lingettes Kim, placer la membrane dans une cassette à film entre des pochettes plastiques, puis éponger l'excédent de réactif Super Signal avec des lingettes Kim sans poussière.

Si nécessaire, exposer le film Kodak Biomax MR à des intervalles de 30 secondes, jusqu'à 30 minutes, puis révéler dans un révélateur pour film. Après cinq minutes, les bandes du monomère A bêta seront probablement saturées dans cette expérience. Des homogénats clarifiés contenant 50 microgrammes de protéines totales provenant de sept sujets humains ont été analysés afin de détecter la présence de bêta-amyloïde multimérique ou d'A bêta, ainsi que de la protéine précurseur de l'amyloïde ou APP, la protéine transmembranaire à partir de laquelle le peptide A bêta est clivé.

Ici, nous présentons des images représentatives d'une expérience de western blot Aβ-PP après une exposition de 30 minutes et de cinq minutes. Une exposition de 30 minutes permet de visualiser les bandes beaucoup plus faibles correspondant au dimère, trimère, tétramère et aux formes de poids moléculaire plus élevé ou aux bandes ligamentaires d'Abeta, mais surexpose les autres bandes lors d'un temps d'exposition de cinq minutes. La même bande tétramérique est présente, mais faible, ce qui permet de visualiser clairement les autres bandes.

Des homogénats corticaux provenant de sujets atteints de la maladie d'Alzheimer ou MA sont visibles dans les bandes une à trois, un sujet humain diagnostiqué avec une démence avec corps de Lewy ou DCL et maladie d'Alzheimer apparaît dans la bande quatre, des cas de démence avec corps de Lewy sont observés dans les bandes cinq et six, ainsi qu'un cas témoin humain âgé non-dément. Dans la bande sept, un immunoblotting avec l'anticorps 6C10 a révélé des monomères, dimères, trimères, tétramères de bêta-amyloïde ainsi qu'un APP dans tous les cas d'Alzheimer, ainsi que d'abondantes formes de poids moléculaire plus élevé de multimères de bêta-amyloïde dans deux cas de MA, ce qui indique l'hétérogénéité de la bêta-amyloïdation entre les sujets humains synthétiques.

Un bêta 40 dans la voie droite confirme l'identité des bandes de poids moléculaire inférieur. Nous venons de vous montrer une expérience de Western blot SDS-PAGE afin d'identifier les multimères d'Abêta dans des homogénats de tissus non fixés provenant du cerveau de patients humains atteints de maladies neurodégénératives. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de préparer un homogénat cortical fortement concentré pour la séparation par électrophorèse sur gel, afin de révéler les multimers d'Abêta présents en faible abondance.

Il est également important de réaliser une récupération des épitopes antigéniques induite par la chaleur avant le transfert immunologique avec un anticorps dirigé contre le peptide Abeta. La récupération de l'antigène permet de révéler les épitopes Abeta masqués afin d'optimiser la liaison de l'anticorps lors du transfert immunologique. Tout appareil tel qu'un cuit-vapeur, un micro-ondes ou un bain-marie capable de maintenir une température de 100 degrés Celsius convient.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.