Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince
April 29th, 2007
Cette vidéo montre la préparation d'un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Désorption Ionisation Mass Spectrometry (MALDI-MS).
Bienvenue dans le tutoriel du CHI Lab sur la méthode de la couche ultra mince, qui est particulièrement utile pour la détermination précise de la masse des protéines. En raison de la nature sensible de la spectrométrie de masse, nous n’utilisons que des réactifs de qualité HPLC ainsi que des gants en latex ou en nitrile sans poudre pour nettoyer la plaque. Rincez alternativement avec de l’eau au méthanol, puis enfin à nouveau du méthanol.
Entre chaque rinçage, essuyez délicatement l’excès de solvant à l’aide d’un chiffon pour lentilles. Vous pouvez répéter ces étapes de lavage autant de fois que nécessaire pour produire une assiette propre. Et une fois nettoyée et sèche, la plaque doit être utilisée immédiatement.
Appliquez et étalez 20 à 30 microlitres de solution de substrat en couche mince sur la plaque MALDI propre. Ici, nous utilisons une pointe de pipette P deux 50 pour répartir uniformément la solution tout en évitant de rayer la plaque. Au fur et à mesure que la fine couche sèche, retirez toutes les gouttelettes d’eau restantes si elles sont présentes en épongeant doucement avec une lingette kim.
Ensuite, essuyez doucement la plaque d’un mouvement fluide avec une lingette Kim pour bien former la fine couche. Enfin, nettoyez les bords de la plaque pour éviter de contaminer le spectromètre de masse. Il est crucial de tester la couche mince avant d’appliquer votre échantillon.
Si le point d’essai met trop de temps à sécher là où les cristaux ne sont pas homogènes, le problème peut résider dans la couche mince elle-même ou dans la solution matricielle, nettoyez la plaque, réappliquez la couche mince et testez à nouveau. Lorsque vous faites des taches sur la fine couche, vous ne voulez pas que vos taches s’évaporent jusqu’à la sécheresse. Au lieu de cela, une fois que la cristallisation a ralenti et s’est arrêtée, retirez l’excès de solvant.
La présence de contaminants tels que les sels et les détergents, ainsi qu’une concentration élevée d’analyte peuvent interférer avec la cristallisation. Une dilution supplémentaire de l’échantillon peut améliorer la cristallisation Repérez les fourmis à proximité de l’échantillon. Cela permettra un pseudo-étalonnage interne dans lequel la plaque est déplacée du point d’échantillonnage au point d’étalonnage.
Lors de l’acquisition d’échantillons, en ajoutant quelques tirs laser du CAS au spectre, cette approche garantit un étalonnage avec une précision de masse plus élevée que l’étalonnage externe seul. Il est très important de laver tous les contaminants tels que le sel ou le détergent qui pourraient interférer avec l’analyte. Ionisation. Pour ce faire, déposez de l’acide acétique tri-fluor à 0,1 % dans la HPLC, de l’eau directement sur les taches.
Retirez la solution de lavage à l’aide d’un aspirateur comme indiqué ici. Cette méthode produit d’excellents spectres pour les protéines membranaires et solubles.
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Aperçu
Cette vidéo démontre la préparation d'une couche ultra-mince de matrice/analyte pour l'analyse des peptides et des protéines par spectrométrie de masse à désorption/ionisation assistée par laser (MALDI-SM). La méthode est essentielle pour une détermination précise de la masse des protéines.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Spectrométrie de masse
- Analyse des protéines
- Chimie analytique
Contexte
- La spectrométrie de masse est une technique sensible pour l'analyse des biomolécules.
- La préparation de la plaque d'échantillon est cruciale pour des résultats précis.
- Les réactifs de grade HPLC sont recommandés pour le nettoyage.
- Des techniques de manipulation et de nettoyage appropriées améliorent la qualité de l'analyse.
Objectif de l'étude
- Démontrer la méthode de couche ultra-mince pour MALDI-SM.
- Assurer une détermination précise de la masse des protéines.
- Fournir un tutoriel sur les meilleures pratiques de préparation des échantillons.
Méthodes utilisées
- Utilisation de réactifs de grade HPLC.
- Nettoyage de la plaque avec du méthanol et de l'eau.
- Essuyage de l'excès de solvant avec du papier tissu.
- Utilisation immédiate de la plaque nettoyée pour l'analyse.
Résultats principaux
- Démonstration de méthodes de nettoyage efficaces pour la plaque d'échantillon.
- Mise en évidence de l'importance d'utiliser des matériaux appropriés.
- Exposition des étapes de préparation d'une couche ultra-mince.
- Apport d'informations sur le maintien de l'intégrité de l'échantillon.
Conclusions
- La méthode de couche ultra-mince est vitale pour une spectrométrie de masse précise.
- Les techniques de nettoyage et de préparation appropriées sont essentielles.
- Le suivi des meilleures pratiques peut améliorer significativement les résultats de l'analyse.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Accurate mass determination of proteins is critical for target validation and lead identification in early discovery. The ultra-thin layer MALDI sample preparation method enhances data quality by improving tolerance to impurities and spatial uniformity, supporting reliable compound evaluation. This method enables predictive confidence in protein characterization, reducing mechanistic ambiguity in preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables accurate mass determination of proteins, supporting therapeutic hypothesis interrogation and functional target validation.
- Operational Value: Provides greater tolerance to salts and detergents, reducing false negatives in impurity-prone samples.
- Predictive Value: Improves resolution and spatial uniformity, increasing confidence in protein identity and modification status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-quality, reproducible spectra essential for assay standardization and quantitative readout consistency.
- Operational Value: Uses simple, robust steps compatible with high-throughput screening environments.
- Scalability: Enables preparation of validated sample plates for downstream workflows, supporting platform reuse across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports analysis of both membrane and soluble proteins, enabling disease-relevant system characterization.
- Mechanistic De-risking: Facilitates accurate mass determination of proteins with wide mass ranges (up to 380 kDa), aiding in lead optimization.
- Preclinical Model Alignment: Applicable to ion channels, transporters, and receptors, supporting target validation in physiologically relevant models.
Pipeline & Workflow Integration
The ultra-thin layer method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical profiling, enabling reliable protein analysis at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing accurate mass data for protein identification and characterization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs that enable reliable compound evaluation in assay development.
- Analytics: Generates high-resolution mass spectra with spatial uniformity, improving data comparability across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through consistent protein mass analysis across sample types.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, robust sample preparation capability applicable across multiple protein classes and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in protein mass determination, reduction of mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and tolerance to common contaminants like salts and detergents.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved data quality, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable protein characterization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry sample handling and MALDI-MS principles.
- Needs access to HPLC-grade reagents, vacuum aspirator, and MALDI-compatible plates.
- Demands standardized cleaning and drying procedures to ensure layer uniformity.
- Requires adaptation for varying analyte concentrations and sample matrices.
- Limited by the need for immediate plate use after cleaning to prevent recontamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
