Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

L'objectif général de cette procédure est de séparer et de comparer les fractions de monozones et de polyribosomes provenant de lysats cellulaires. Cela est réalisé en cultivant tout d'abord les cellules d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer le lysat cellulaire.

La troisième étape de la procédure consiste à centrifuger le lysat à travers un gradient de saccharose. La dernière étape de la procédure consiste à fractionner le gradient et à visualiser les différentes populations de ribosomes au moyen d'un tracé UV. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des modifications de la traduction dans différentes conditions expérimentales grâce à l'analyse du profil des polyribosomes.

Bonjour, je suis Anthony Esposito du laboratoire du Dr Terry Goss Kinsey, du département de génétique moléculaire, de microbiologie et d'immunologie à l'UMD et à la faculté de médecine J Robert Wood Johnson. Et je suis Marcus Lewis, également du laboratoire McKinsey ici à R-W-J-M-S.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'analyse des polyribosomes. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modifications de la synthèse protéique résultant de mutations ou de facteurs environnementaux. Commençons. Saccharose.

Les gradients doivent être préparés un jour avant leur utilisation afin de permettre leur homogénéisation. Mélangez les volumes appropriés de solutions mères de saccharose à 7 % et à 47 % pour obtenir 48 millilitres de chacune des concentrations suivantes de saccharose : 7 %, 17 %, 27 %, 37 % et 47 %. Ajoutez de la DTT à un molaire à chaque solution de saccharose pour obtenir une concentration finale de un millimolaire. Pour verser les gradients, fixez une pipette en forme de spaghetti à une seringue de 20 millilitres en assurant l’étanchéité avec du film parafilm.

Ajoutez sept millilitres de saccharose à 7 % au fond d'un tube de centrifugation ultracentrifugeuse en polyamère de 2,54 cm sur 8,9 cm. Ensuite, ajoutez sept millilitres de solution de saccharose à 17 % sous la solution à 7 % en plaçant la pointe de la pipette Pasteur près du fond du tube et en pipetant lentement. Il faut au moins 20 secondes pour verser chaque couche.

Répétez avec sept millilitres de solutions de saccharose à 27 %, 37 % et 47 % une fois le gradient formé. Vous devriez observer des lignes nettes entre les couches, indiquant qu’un mélange minimal a eu lieu. Conservez tous les gradients à quatre degrés Celsius toute la nuit, ainsi que les rotors, flacons et tubes qui seront utilisés pour la récolte des échantillons.

Pour préparer des extraits à partir de cellules de levure, commencez par cultiver cent cultures de 25 millilitres de levure jusqu'à une DO 600 comprise entre 0,8 et 1,0. Ajoutez du cycloheximide à la culture à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre et poursuivez l'agitation à 30 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, versez la culture dans un flacon de centrifugeuse de 250 millilitres et remplissez-le de glace.

À partir de ce moment, maintenir tout sur glace ; centrifuger à 8 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Resus, suspendre le culot dans 10 millilitres de tampon de lyse glacé et transférer dans des tubes polypropylènes de 15 millilitres. Centrifuger à 5 900 ×g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius Resus.

Suspendez le culot dans 0,5 millilitre de tampon de lyse. Transférez la suspension dans un tube microfuge de 1,5 millilitre, puis ajoutez 0,5 millilitre de billes de verre acidifiées, refroidies et calcinées. Vortexez les cellules par quatre intervalles de 32 secondes, en plaçant le tube sur de la glace pendant 30 secondes entre chaque intervalle.

Ensuite, ajouter encore 0,5 millilitre de tampon de lyse dans le tube de 1,5 millilitre et centrifuger à 5 000 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger à vitesse maximale pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Enfin, transférez le surnageant dans un nouveau tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre. L'extrait peut être conservé à moins 80 degrés Celsius avant le transfert du lysat sur le gradient de saccharose. Placez l'embout de la pipette contre la paroi du tube près de la surface du gradient et déposez délicatement le lysat en couche supérieure du gradient.

Pour un gradient de 35 millilitres, on charge généralement 500 microlitres de lyzat. À l’aide de pinces, abaisser délicatement le gradient dans le godet d’un rotor à godets oscillants. Centrifuger les gradients à 100 000 ×g pendant quatre heures à quatre degrés Celsius.

Environ 30 minutes avant la fin de la rotation de quatre heures, fixez l'aiguille au perce-tube et reliez le stylo au moniteur en ligne d'absorbance et de fluorescence. Allumez l'alimentation du moniteur d'absorbance afin d'obtenir une ligne de base stable avant d'analyser les échantillons.

L'acquisition électronique du profil PolyZone peut être facilement obtenue en temps réel en raccordant une unité d'acquisition de données DI 1 48 U. Au registreur graphique, remplissez la pompe à seringue avec 50 millilitres de florin nuts en utilisant le réglage rapide de flux inverse. Assurez-vous qu'il n'y ait aucune bulle d'air présente.

Connectez le tuyau de la seringue au perforateur de tube. Ensuite, faites circuler brièvement le gaz inerte Flo dans le sens direct à un débit de six millilitres par minute. Pour éliminer les bulles d'air éventuelles du tuyau, placez une série de tubes sous l'extrémité du tuyau, à la sortie de la cellule d'écoulement, afin de recueillir l'écoulement de l'échantillon.

Préparez un seau à glace avec un alvéole préformé pour maintenir le tube de centrifugation contenant le gradient de saccharose. Une fois la centrifugation de quatre heures terminée, retirez soigneusement les tubes de centrifugation du rotor de centrifugeuse et placez-les sur de la glace, en prenant soin de ne pas perturber les gradients.

Pour analyser les extraits cellulaires, placez le tube à gradient sur le perceur de tube et reliez le haut du tube à la sortie en fixant solidement. Relevez le plateau inférieur jusqu'au tube de centrifugeuse afin que l'aiguille perce le fond du tube. Démarrez le flux de Florin alert dans le sens direct à six millilitres par minute.

Une fois que le flux a commencé à s'écouler dans le tube, surveillez le déplacement de l'aiguille sur le moniteur en ligne d'absorbance UV. Dès que l'aiguille commence à bouger, activez le déplacement du diagramme à une vitesse de 60. Lorsque l'extrémité du profil du polyribosome est atteinte, arrêtez l'écoulement de Flo inert vers le tube de centrifugation et interrompez le déplacement du diagramme sur le moniteur d'absorbance et de fluorescence.

Ramener le Flo inert dans la seringue à partir du tube de centrifugation en amorçant l'écoulement en sens inverse à un débit rapide, en veillant à ne pas aspirer le saccharose du tube dans la seringue. Dévisser le tube de centrifugation du perforateur de tube, abaisser l'aiguille et retirer le tube. Un tracé représentatif d'un extrait de ribosomes préparé à partir de levure en présence de cyclo heide est montré ici.

Les pics d'absorbance UV contenant des polyribosomes ainsi que les ribosomes A TS 60 s et 40 s sont indiqués. Nous venons de vous montrer comment réaliser une analyse des polyribosomes. Lors de cette procédure, il est important de travailler rapidement, de maintenir les échantillons au froid et de préserver les ARN sans dégradation.

Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.