Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

L’objectif global de cette procédure est de séparer et de comparer les fractions mono zone et poly ribosome des lysats cellulaires. Ceci est accompli en cultivant d’abord les cellules d’intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer le lysat cellulaire.

La troisième étape de la procédure consiste à centrifuger le lysat à travers un gradient de saccharose. La dernière étape de la procédure consiste à fractionner le gradient et à visualiser les différentes populations ribosomales à travers une trace UV. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des changements de traduction dans différentes conditions expérimentales grâce à l’analyse du profil des polyribosomes.

Bonjour, je suis Anthony Esposito du laboratoire du Dr Terry Goss Kinsey dans le département de génétique moléculaire, de microbiologie et d’immunologie de l’UMD et de la J Robert Wood Johnson Medical School. Et je m’appelle Marcus Lewis. Également du McKinsey Lab ici à R-W-J-M-S.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’analyse des polyribosomes. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les altérations et la synthèse des protéines qui découlent de mutations ou de facteurs environnementaux. Alors commençons. Saccharose.

Les dégradés doivent être préparés un jour avant l’utilisation pour permettre aux dégradés de devenir continus. Mélanger les volumes appropriés de solutions mères de saccharose à 7 % et 47 % pour obtenir 48 millilitres de chacune des concentrations de saccharose suivantes, 7 % 17 % 27 % 37 % et 47 % Ajouter une molaire de DTT à chaque solution de saccharose jusqu’à une concentration finale d’un millimolaire. Afin de verser les dégradés, fixez une pipette à pâtes à une seringue de 20 millilitres en fixant et en scellant avec un film para

Ajoutez sept millilitres de saccharose à 7 % au fond d’un tube à centrifuger en poly aamer ultra d’un pouce sur 3,5 pouces. Ensuite, ajoutez sept millilitres de solution de saccharose à 17 % sous la solution à 7 % en plaçant lentement la pointe de la pipette à pâtes près du bas de la pipette tubulaire. Il ne devrait pas falloir moins de 20 secondes pour verser chaque couche.

Répéter l’opération avec sept millilitres de solutions de saccharose à 27 %, 37 % et 47 % lorsque le gradient a été percé. Vous devez observer des lignes claires entre les couches indiquant qu’un mélange minimal s’est produit. Entreposez toutes les pentes de quatre degrés Celsius pendant la nuit, ainsi que les rotors, les bouteilles et les tubes qui seront utilisés pour prélever les échantillons.

Pour préparer des extraits de cellules de levure, commencez par cultiver cent 25 millilitres de culture de levure à un OD 600 de 0,8 pour un. Ajoutez de la cyclo-heide à la culture jusqu’à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre et continuez à agiter à 30 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, versez la culture dans une bouteille de centrifugeuse de 250 millilitres et remplissez de glace.

Gardez tout sur la glace à partir de ce point, centrifugez à 8 000 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Resus, suspendez la pastille dans 10 millilitres de glace, lyse à froid, tamponnez et transférez-la dans des tubes en polypropylène de 15 millilitres. Centrifugeuse à 5, 900 fois la gravité pendant trois minutes de quatre degrés Celsius Resus.

Suspendre la pastille dans 0,5 millilitre de tampon de lyse. Transférez la suspension dans un tube micro-fuge de 1,5 millilitre, puis ajoutez 0,5 millilitre de billes de verre lavées à l’acide cuites et réfrigérées. Vortex les cellules pendant quatre intervalles de 32e, appelant le tube sur la glace pendant 30 secondes entre chaque intervalle.

Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de tampon de lyse dans la centrifugeuse à tube de 1,5 millilitre à 5 000 fois. Gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans un nouveau microtube de centrifugation de 1,5 millilitre et centrifugez à vitesse maximale pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Enfin, transférez le supinate dans un nouveau tube micro centri de 1,5 millilitre. L’extrait peut être stocké à moins 80 degrés Celsius pour transférer le lysat au gradient de saccharose. Placez l’extrémité de la pipette contre la paroi du tube près de la surface du dégradé et superposez doucement le lysat sur le dégradé.

Pour une pente de 35 millilitres, 500 microlitres de lysat sont généralement chargés. À l’aide d’une pince, abaissez soigneusement la pente dans le godet d’un rotor à godets oscillants. Centrifugez les gradients à 100 000 fois la gravité pendant quatre heures à quatre degrés Celsius.

Environ 30 minutes avant la fin de la rotation de quatre heures. Fixez l’aiguille au perceur de tube et fixez le stylo au moniteur de fluorescence d’absorbance en ligne. Mettez le moniteur d’absorbance sous tension pour permettre d’atteindre une ligne de base stable avant d’analyser les échantillons.

L’acquisition électronique du profil PolyZone peut être facilement obtenue en temps réel en connectant une unité d’acquisition de données DI 1 48 U. Sur l’enregistreur graphique, remplissez le pousse-seringue avec 50 millilitres de noix de florin en utilisant le réglage rapide du débit inversé. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air.

Connectez le tuyau de la seringue au perceur de tube. Et allumez brièvement le débit de Flo inerte à six millilitres par minute dans le sens de l’avant. Pour éliminer les bulles d’air du tuyau, placez une série de tubes sous le tuyau à l’extrémité de la cellule d’écoulement pour recueillir les eaux de ruissellement de l’échantillon.

Préparez un seau à glace avec un puits préformé pour tenir le tube de centrifugation contenant le gradient de saccharose. Une fois la centrifugation de quatre heures terminée, retirez soigneusement les tubes de centrifugation du rotor de la centrifugeuse et placez-les sur de la glace. En prenant soin de ne pas perturber les pentes.

Pour analyser les extraits cellulaires, placez le tube à gradient sur le perceur de tube et connectez le haut du tube à la sortie et fixez-le. Soulevez l’étage inférieur jusqu’au tube de centrifugation de sorte que l’aiguille perce le fond du tube. Commencer le flux d’alerte Florin dans le sens de l’avant à six millilitres par minute.

Une fois que la cannelure a commencé à s’écouler dans le tube, surveillez le mouvement de l’aiguille sur le moniteur d’absorbance UV en ligne. Une fois que l’aiguille commence à bouger, activez le mouvement de la carte à une vitesse de 60. Lorsque l’extrémité du profil du polyribosome a été atteinte, coupez le flux de Flo inerte vers le tube à centrifuger et arrêtez le mouvement du graphique au niveau du moniteur de fluorescence d’absorbance.

Rétractez le Flo inerte du tube de centrifugation dans la seringue en commençant le flux dans le sens inverse à un rythme rapide, en veillant à ne pas aspirer le saccharose du tube dans la seringue. Dévissez le tube à centrifuger du perceur de tube, abaissez l’aiguille et retirez le tube. Une trace représentative d’un extrait de ribosome préparé à partir de levure en présence de cyclo heide est présentée ici.

Les pics d’absorbance UV contenant des polyribosomes et des ribosomes A TS 60 s et 40 s sont indiqués. Nous venons de vous montrer comment effectuer une analyse des polyribosomes lors de cette procédure. Il est important de ne pas oublier de travailler rapidement, en gardant les échantillons froids et sans ARN.

Donc c’est tout. Merci de regarder et bonne chance dans vos expériences.