Name: Eucaryotes Analyse du profil polyribosome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez l'analyse du profil polyribosome chez les eucaryotes pour étudier la régulation de la traduction. Cette méthode par centrifugation sur gradient de saccharose permet de séparer et visualiser les populations ribosomiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tiennent à remercier John Woolford pour la première base de cette méthode, TGK est soutenu par les NIH et GM057483 AI076245 et PRC est soutenu par GM77073.

1. Préparation des gradients de sucrose 7-47% <ol><li> Préparer des gradients de sucrose un jour avant l'utilisation pour permettre aux gradients de devenir permanente. Faire stériles 7% et 47% de saccharose des solutions contenant 50 mM de NH 4 Cl, 7,0 50mM pH Tris-Acétate et 12mm MgCl 2 et stocker à 4 ° C 1. </li><li> Pour 6% des gradients de mélanger les 7 et 47% de saccharose solutions de stock pour faire 48 ml de chacune des concentrations de saccharose suivantes. Ajouter la TNT (1M stock) à chaque solution de saccharose à une concentration finale de 1 mM. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Concentration finale </td><td> 7% de saccharose </td><td> 47% de saccharose </td></tr><tr><td> 7% </td><td> 48 ml </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 17% </td><td> 36 ml </td><td> 12 ml </td></tr><tr><td> 27% </td><td> 24 ml </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td> 37% </td><td> 12 ml </td><td> 36 ml </td></tr><tr><td> 47% </td><td> 0 </td><td> 48 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Afin de verser les gradients, joignez une pipette Pasteur pour une seringue de 20 ml par la sécurisation et d'étanchéité avec Parafilm ou l'utilisation d'une aiguille longue. Ajouter 7 ml de saccharose à 7% au fond d'un 1 x 3.5 "tube d'ultracentrifugation polyallomère. Suivant ajouter 7 ml de solution de saccharose 17% dans la solution de 7% en plaçant la pointe pipette Pasteur près du fond du tube et de pipetage pas plus vite que 0,3 ml / sec. Répéter avec 7 ml chacun de 27%, 37% et des solutions de saccharose de 47%. Vous devez respecter les lignes claires entre les couches, ce qui indique que le mélange minimale est survenue. gradients de magasin à 4 ° C pendant la nuit avec les rotors, les bouteilles et des tubes qui seront utilisés pour récolter des échantillons. </li></ol> 2. Préparation de l'extrait de levure <ol><li> Cultivez 125 ml de culture de levure à une DO 600 de 0,8 à 1,0. Ajouter cycloheximide à la culture à une concentration finale de 100 pg / ml et continuer agitation à 30 ° C pendant 15 min. </li><li> Pendant ce temps, préparer un tampon de lyse contenant 80 pg / ml de cycloheximide, 200 pg / ml d'héparine, DEPC 0,2%, et 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M de NaCl, 30 mM MgCl 2. Gardez tout sur la glace à partir de ce point. </li><li> Verser la culture dans un flacon de 250 ml à centrifuger et remplir de glace. Centrifuger à 8000 xg (7250 rpm dans un rotor SLA-1500) pendant 5 min à 4 ° C. Laver le culot une fois avec 10 ml de tampon de lyse de la glace froide et le transfert des tubes de 15 ml en polypropylène. Centrifuger à 5900 xg (~ 6000 rpm dans un rotor SLA-600TC) pendant 3 min à 4 ° C. Reprendre le culot dans 0,5 ml de tampon de lyse, le transfert au tube 1.5ml et ajoutez 0,5 ml d'réfrigérés, cuits perles de verre lavée à l'acide. Vortex les cellules pour des intervalles de quatre secondes 30, le tube de refroidissement sur la glace pendant 30 secondes entre chaque intervalle. Ajouter une autre dose de 0,5 mL de tampon de lyse dans le tube de 1,5 ml. Centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse (14 000 rpm dans un microcentrifugeuse Eppendorf 5417R) pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml microtubes. Retirer 10 ul d'un tube séparé pour déterminer la DO 260 / DO 280 Ratio (voir l'étape 3.1 ci-dessous). Extraits Conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. Préparation des extraits de cellules de mammifères <ol><li> Pour les cellules adhérentes, grandir en 100 mm à plat confluent ~ 70%. Vous aurez besoin d'un plat de 100 mm par 11 ml de gradient (rendement typique est d'environ 20 260 unités OD). Échelle du montant linéairement pour des tailles plus grandes ou plus petites gradient. Pour des cellules non adhérentes, soit environ 1 x 10 7 cellules sont nécessaires par 11 ml de gradient. </li><li> Avant de lyse, ajouter cycloheximide à 100 pg / mL. Incuber à 37 ° C pendant 15 min. Transfert des plaques de glace et rincer les cellules à deux reprises en PBS glacé. Toutes les étapes futures doivent être effectuées à 0-4 ° C. </li><li> Enlevez toutes les traces de PBS par aspiration (laissez égoutter les plaques sur un lit d'angle de la glace) et ajouter 1 ml de tampon de lyse, gratter et transfert à l'avant-tube de 1,5 ml refroidi. Composants du tampon de lyse devra être optimisé pour le type de cellule et des conditions de croissance. Un tampon de départ serait de 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl2, 200 mM de KCl, 1% de Triton X-100 (v / v), 100 ug / ml de cycloheximide, 2 mM de DTT, et 1 mg / ml d'héparine. Les principales variables sont les concentrations de magnésium et de chlorure de potassium ainsi que l'inclusion ou l'exclusion de détergents non ioniques afin d'améliorer l'extraction du cytosquelette ou membrane polysomes liés. Lyse des cellules en passant à travers 27 aiguille de la seringue de calibre double ou par coups de 5-10 homogénéisation Dounce de type B en utilisant un pilon. La seringue ou homogénéisateur doit être pré-refroidis avant utilisation. </li><li> Centrifuger à 14000 xg pendant 5 min dans microcentrifugeuse réfrigérés. Transfert lysat frais au gradient de saccharose (pour les cellules de mammifères présente est constitué de tampon de lyse manque de Triton X-100 et l'héparine mais autrement comme décrit dans 1.2 et 1.3) ou geler éclair dans l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 4. La centrifugation de gradients <ol><li> Dégel lysats polyribosomes sur la glace. Déterminer la concentration d'acide nucléique dans le lysat en ajoutant l'échantillon de 10 uL réservés à 1 mL d'eau et de lecture de la DO 260 / DO 280 ratio avec un spectrophotomètre. Rendement typique d'une culture de levures cultivées comme décrit est de 50 unités de DO. </li><li> Avec une pipette avec la pointe placée contre le mur du tube près de la surface de la pente, doucement couche 25 DO 260 unités du lysat sur ​​le haut de la pente. Pour un gradient de 35 500 ml de lysat est habituellement chargé. Tampon de lyse peut être utilisé pour assurer tous les dégradés sont chargés avec un volume égal. Basse quantités de matière de rendement meilleure résolution. En utilisant des pinces, soigneusement bas les gradients dans des seaux d'un rotor swing. </li><li> Centrifuger les gradients à 100.000 xg (23 000 rpm dans un rotor de 630 Surespin) pendant 4 heures à 4 ° C. Ce protocole peut être adapté pour des gradients de plus petit volume. </li></ol> 5. Collecte des données et des fractions <ol><li> Environ 30 min avant la fin de la rotation de 4 heures à fixer l'aiguille le perceur tube modèle 184. Attacher le stylo pour le modèle en ligne Isco UA-5 Absorbance / Monitor fluorescence. Puissance sur l'absorbance suivre pour permettre à une base stable pour être atteint avant l'analyse des échantillons. Électroniques pour l'acquisition du profil de polysomes peut facilement être obtenue en attachant une unité DI-148U acquisition de données (DATAQ Instruments) à l'enregistreur graphique. Les profils peuvent ensuite être collectées en temps réel et sauvegardés pour plus tard en utilisant le logiciel d'annotation WinDaq accompagnement. </li><li> Remplir la pompe seringue avec 50 ml de Fluorinert utilisant le flux inverse, à prise rapide. Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air présentes. Raccordez le tuyau de la seringue pour le perceur tube et mettez brièvement sur les flux de Fluorinert à 3 mL / min dans le sens avant d'effacer le tuyau d'éventuelles bulles d'air. </li><li> Placer un bécher de déchets ou une série de tubes si la collecte de fractions sous le tuyau à l'extrémité de la cellule de flux pour recueillir l'échantillon de ruissellement. </li><li> Retirer délicatement les tubes à centrifuger polyallomère contenant le gradient de saccharose de rotor de la centrifugeuse et les placer sur la glace (pré-former des puits dans la glace avec un tube vide pour éviter de perturber les gradients). </li><li> Pour analyser des extraits de cellules, placer le tube de gradient sur le pierceur tube. Branchez le haut du tube à la sortie et sécurisé. Soulever l'étage inférieur du tube de centrifugation afin que l'aiguille perce le fond du tube. Une fois l'aiguille dépassait de la partie inférieure du tube de centrifugation, amorcer l'écoulement de Fluorinert dans le sens direct au 6mL/min. </li><li> Une fois le Fluorinert a commencé coule dans le tube, de surveiller le mouvement de l'aiguille sur le moniteur d'absorbance en ligne. Une fois que l'aiguille commence à se déplacer, tourner sur le mouvement graphique à un réglage de la vitesse de 60. Le moniteur enregistre la DO 254 en commençant par le matériel gratuitement suivie par la détection sous-unité ribosomale 40S et en continuant par le biais de complexes polyribosomes. Si vous êtes recueillant des fractions d'ARN ou d'analyse des protéines, typiquement 0,2 min fractions sont prises (1 ml). Pour l'analyse de l'ARN, les fractions doivent être recueillis directement dans des tubes contenant Trizol (Invitrogen), le phénol ou SDS / protéinase K, selon la méthode préférée de l'extraction. </li><li> Quand la fin du profil polyribosomes a été atteint, fermer le robinet de Fluorinert le tube de centrifugeuse et d'arrêter le mouvement graphique de l'absorbance / moniteur de fluorescence. </li><li> Rentrez les Fluorinert du tube à centrifuger dans la seringue en commençant par le flux dans le sens inverse à une vitesse rapide en veillant à ne pas tirer de saccharose dans le tube dans la seringue. Dévissez le tube de centrifugation de l'pierceur tube, abaisser l'aiguille, et retirer le tube. </li><li> Répétez les étapes 5.5 à 5.8 pour chaque gradient de saccharose. </li><li> Lorsque tous les gradients de sucrose ont été analysés, rétracter la Fluorinert du tuyau de retour dans la seringue. Retirez chaque partie de fractionnement (perceur de tubes et de cellules d'écoulement), y compris le tuyau de déchets situé en haut et bien rincer avec de l'eau. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1948/1948fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Oligo-Représentant de l'extrait préparé à partir de ribosome BY4741 souche de levure (tapis une his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ 0 ura3 Δ 0), en présence de cycloheximide. L'extrait a été fractionné en utilisant ribosomique un gradient de saccharose 7 47% et analysées en utilisant un appareil de la seringue de la pompe attachée à un détecteur UV. Peaks contenant polyribosomes et 80S, 60S et 40S des ribosomes sont indiqués.

<ol><li>Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+allowing+an+mRNA+secondary+structure+diminishes+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+iso-1-cytochrome+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
<li>Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stabilization+of+preinitiation+complexes+by+formaldehyde+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking.</a> Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).</li>
<li>Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+distribution+of+phospholipid+hydroperoxide+glutathione+peroxidase+mRNA%3A+evidence+for+a+block+in+elongation+at+the+UGA%2Fselenocysteine+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon.</a> Rna. 6, 1573-1584 (2000).</li>
<li>Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuan%2C+HJ+%22Analysis+of+mRNA+formation+and+function%22">Analysis of mRNA formation and function</a>. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).</li>
<li>Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenocysteine+codons+decrease+polysome+association+on+endogenous+selenoprotein+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs.</a> Genes Cells. 6, 121-129 (2001).</li>
<li>Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+upstream+open+reading+frame+regulates+translation+of+GADD34+during+cellular+stresses+that+induce+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).</li>
</ol>

Les informations obtenues par le profil de polyribosomes peuvent fournir des informations précieuses sur l&#39;état de translation de la cellule. En outre, le statut de l&#39;assemblage de sous-unités ribosomales eux-mêmes peuvent être déterminés 2. Par exemple la présence de halfmers ou 80S et les grands pics avec un léger épaulement vers la droite sur le profil indique une sous-unité 40S liés attendant 60S sous-unité d&#39;assemblage. Exécution de l&#39;expérience en l&#39;absence de toute cycloheximide ajouté ou autre inhibiteur de l&#39;allongement permet une analyse du taux de ruissellement, ce qui indique si oui ou non l&#39;élongation est modifiée 3. Les fractions sont eux-mêmes une source riche de réactifs pour la détermination ultérieure de l&#39;association d&#39;un ARNm spécifique ou protéine ribosomique avec des sous-populations par Northern blot ou Western des fractions. Le pool total des ARNm associés aux ribosomes actifs peut être déterminé via une puce associée 4 ou 5 profonde analyse par séquençage. Les associations de protéines peuvent également être stabilisés par l&#39;ajout approprié d&#39;une réticulation réactif 6. L&#39;analyse des cellules de mammifère polyribosome convient également de mentionner comme un protocole distinct en termes de difficultés apparentes dans l&#39;établissement des conditions requises pour obtenir polysomes stable. Les systèmes tampons rapportés dans la littérature sont très variables 7-10, donc il peut y avoir une exigence pour un type de cellule optimisation spécifique du tampon de lyse, ou il est tout aussi plausible que le système tampon n&#39;est pas aussi important que l&#39;attention désireux de travailler avec lysats frais conservés à basse température. A notre connaissance une évaluation systématique des paramètres affectant la formation de polysomes mammifères n&#39;a été signalé.

<table><tbody><tr><td>tube d'ultracentrifugation en polyallomère</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>326823</td><td>1 x 3,5 po (25x89 mm)</td></tr><tr><td>Fluorinert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7698</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td>D'autres souches fonctionnent tout aussi bien</td></tr></tbody></table>

eucaryotes analyse du profil polyribosome

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

La synthèse des protéines est un processus complexe cellulaire, qui est réglementé à plusieurs niveaux. Par exemple, la traduction globale peut être inhibé à la phase d&#39;initiation ou de la phase d&#39;élongation par une variété de stress cellulaires tels que la famine ou le retrait des acides aminés du facteur de croissance. Sinon, la traduction des ARNm individuels peuvent être régulées par la localisation d&#39;ARNm ou de la présence de microARN apparenté. Les études de synthèse des protéines utilisent fréquemment l&#39;analyse polyribosome faire la lumière sur les mécanismes de régulation de traduction ou de défauts dans la synthèse des protéines. Dans cet essai, l&#39;ARNm / ribosome complexes sont isolés à partir des cellules eucaryotes. Un gradient de densité de sucrose sépare ARNm liés aux ribosomes multiples connu sous le nom polyribosomes à partir d&#39;ARNm lié à un ribosome simple ou monosome. Fractionnement des gradients permet d&#39;isoler et de quantifier les différentes populations du ribosome et leurs ARNm ou des protéines associées. Les différences dans le rapport de polyribosomes au monosomes dans des conditions définies peuvent être indicatifs de défauts dans l&#39;initiation de traduction ou d&#39;élongation / résiliation. L&#39;examen des ARNm présents dans les fractions polyribosomes peuvent révéler si la cohorte des ARNm individuels en cours de traduction aux modifications des conditions expérimentales. En outre, l&#39;assemblage des ribosomes peut être surveillé par l&#39;analyse des pics de petites et grandes sous-unité ribosomale qui sont aussi séparés par la pente. Dans cette vidéo, nous présentons une méthode pour la préparation des extraits bruts ribosomique de cellules de levure, la séparation de l&#39;extrait par gradient de saccharose et de l&#39;interprétation des résultats. Cette procédure est facilement adaptable aux cellules de mammifères.

Cet article décrit un protocole pour l&#39;extraction de traduire les ribosomes des cellules eucaryotes. Une fois extraites, les ribosomes sont séparés en monosomes et polyribosomes par fractionnement sur gradient de saccharose pour permettre à différentes populations ribosomique pour être analysé. En tant que tel, cette méthode est le gold standard pour examiner la régulation de la traduction.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

La synthèse protéique est un processus cellulaire complexe qui est régulé à de nombreux niveaux. Par exemple, la traduction globale peut être inhibée lors de la phase d'initiation...

L'objectif général de cette procédure est de séparer et de comparer les fractions de monozones et de polyribosomes provenant de lysats cellulaires. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant les cellules d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à préparer le lysat cellulaire.La troisième étape de la procédure consiste à centrifuger le lysat à travers un gradient de saccharose. La dernière étape de la procédure consiste à fractionner le gradient et à visualiser les différentes populations de ribosomes au moyen d'un tracé UV. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des modifications de la traduction dans différentes conditions expérimentales grâce à l'analyse du profil des polyribosomes.Bonjour, je suis Anthony Esposito du laboratoire du Dr Terry Goss Kinsey, du département de génétique moléculaire, de microbiologie et d'immunologie à l'UMD et à la faculté de médecine J Robert Wood Johnson. Et je suis Marcus Lewis, également du laboratoire McKinsey ici à R-W-J-M-S.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'analyse des polyribosomes. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les modifications de la synthèse protéique résultant de mutations ou de facteurs environnementaux. Commençons. Saccharose.Les gradients doivent être préparés un jour avant leur utilisation afin de permettre leur homogénéisation. Mélangez les volumes appropriés de solutions mères de saccharose à 7 % et à 47 % pour obtenir 48 millilitres de chacune des concentrations suivantes de saccharose : 7 %, 17 %, 27 %, 37 % et 47 %. Ajoutez de la DTT à un molaire à chaque solution de saccharose pour obtenir une concentration finale de un millimolaire. Pour verser les gradients, fixez une pipette en forme de spaghetti à une seringue de 20 millilitres en assurant l’étanchéité à l’aide de film parafilm.Ajoutez sept millilitres de saccharose à 7 % au fond d'un tube de centrifugation ultracentrifugeuse en polyamère de 2,54 cm sur 8,9 cm. Ensuite, ajoutez sept millilitres de solution de saccharose à 17 % sous la solution à 7 % en plaçant la pointe de la pipette Pasteur près du fond du tube et en pipetant lentement. Il devrait falloir au moins 20 secondes pour verser chaque couche.Répétez avec sept millilitres de solutions de saccharose à 27 %, 37 % et 47 % une fois le gradient formé. Vous devriez observer des lignes nettes entre les couches, indiquant qu’un mélange minimal a eu lieu. Conservez tous les gradients à quatre degrés Celsius toute la nuit, ainsi que les rotors, flacons et tubes qui seront utilisés pour la récolte des échantillons.Pour préparer des extraits à partir de cellules de levure, commencez par cultiver cent cultures de 25 millilitres de levure jusqu'à une DO 600 comprise entre 0,8 et 1,0. Ajoutez du cycloheximide à la culture à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre et poursuivez l'agitation à 30 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, versez la culture dans un flacon de centrifugation de 250 millilitres et remplissez-le de glace.À partir de ce moment, maintenir tout sur de la glace ; centrifuger à 8 000 ×g pendant cinq minutes à 4 °C. Resus, suspendre le culot dans 10 millilitres de tampon de lyse glacé et transférer dans des tubes polypropylènes de 15 millilitres. Centrifuger à 5 900 ×g pendant trois minutes à 4 °C Resus.Suspendez le culot dans 0,5 millilitre de tampon de lyse. Transférez la suspension dans un tube microfuge de 1,5 millilitre, puis ajoutez 0,5 millilitre de billes de verre acidulées et calcinées refroidies. Vortexez les cellules par quatre intervalles de 30 secondes, en plaçant le tube sur de la glace pendant 30 secondes entre chaque intervalle.Ensuite, ajouter un autre 0,5 millilitre de tampon de lyse dans le tube de 1,5 millilitre et centrifuger à 5 000 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifuger à vitesse maximale pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Enfin, transférez le surnageant dans un nouveau tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre. L'extrait peut être conservé à moins 80 degrés Celsius avant le transfert du lysat sur le gradient de saccharose. Placez l'embout de la pipette contre la paroi du tube, près de la surface du gradient, et déposez délicatement le lysat en couche supérieure du gradient.Pour un gradient de 35 millilitres, on charge généralement 500 microlitres de lyzat. À l’aide de pinces, abaisser délicatement le gradient dans la godet d’un rotor à godets oscillants. Centrifuger les gradients à 100 000 × g pendant quatre heures à quatre degrés Celsius.Environ 30 minutes avant la fin de la rotation de quatre heures, fixez l'aiguille au perce-tube et reliez le stylo au moniteur en ligne d'absorbance et de fluorescence. Allumez l'alimentation du moniteur d'absorbance afin d'obtenir une ligne de base stable avant d'analyser les échantillons.L'acquisition électronique du profil PolyZone peut être facilement obtenue en temps réel en raccordant une unité d'acquisition de données DI 1 48 U. Au registreur graphique, remplissez la pompe à seringue avec 50 millilitres de florin nuts en utilisant le réglage rapide de flux inverse. Assurez-vous qu'il n'y ait aucune bulle d'air présente.Connectez le tuyau de la seringue au perforateur de tube. Ensuite, faites circuler brièvement le gaz inerte Flo à six millilitres par minute dans le sens direct. Pour éliminer les bulles d'air éventuelles du tuyau, placez une série de tubes sous l'extrémité du tuyau, à la sortie de la cellule d'écoulement, afin de recueillir l'écoulement de l'échantillon.Préparez un seau à glace avec un alvéole préformé pour maintenir le tube à centrifuger contenant le gradient de saccharose. Une fois la centrifugation de quatre heures terminée, retirez soigneusement les tubes à centrifuger du rotor de la centrifugeuse et placez-les sur de la glace, en prenant soin de ne pas perturber les gradients.Pour analyser les extraits cellulaires, placez le tube à gradient sur le perceur de tube et reliez le haut du tube à la sortie en fixant solidement. Élevez le plateau inférieur jusqu'au tube de centrifugeuse afin que l'aiguille perce le fond du tube. Démarrez le flux de Florin alert dans le sens direct à six millilitres par minute.Une fois que le flux a commencé à s'écouler dans le tube, surveillez le déplacement de l'aiguille sur le moniteur en ligne d'absorbance UV. Dès que l'aiguille commence à bouger, activez le déplacement du diagramme à une vitesse de 60. Lorsque l'extrémité du profil des polyribosomes est atteinte, arrêtez l'écoulement de Flo inert vers le tube de centrifugation et interrompez le déplacement du diagramme sur le moniteur d'absorbance et de fluorescence.Ramener le Flo inerte de la tube à centrifugerement dans la seringue en amorçant l'écoulement en sens inverse à un débit rapide, en veillant à ne pas aspirer le saccharose du tube dans la seringue. Dévisser le tube à centrifugerement du perforateur de tube, abaisser l'aiguille et retirer le tube. Un tracé représentatif d'un extrait de ribosomes préparé à partir de levure en présence de cycloheide est montré ici.Les pics d'absorbance UV contenant des polyribosomes ainsi que des ribosomes A TS 60 s et 40 s sont indiqués. Nous venons de vous montrer comment réaliser une analyse des polyribosomes. Lors de cette procédure, il est important de travailler rapidement, de maintenir les échantillons au froid et de préserver les ARN sans dégradation.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Ce protocole illustre modifications essentielles de polyribosome fractionnement afin d'étudier la translatome de vivo échantillons dans le SNC. Il permet une évaluation globale de la régulation de la traduction et de la transcription par l'isolement et la comparaison de l'ARN total à ribosome fractions d'ARN liés.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Régulation traductionnelle joue un rôle important dans le contrôle de l’abondance de la protéine. Nous décrivons ici une méthode de haut débit pour l’analyse quantitative de la traduction dans la levure Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide Quantification de la traduction dans la levure de bière par Ribosome profilage

L’objectif global de la technique de profilage polysome est analyse de l’activité traductionnelle de différents mRNAs ou transcriptome ARNm au cours de la synthèse des protéines. La méthode est importante pour les études de règlement de la synthèse de protéine, l’activation de la traduction et répression en santé et les maladies humaines multiples.

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

La traduction des ribosomes décode trois nucléotides par codon en peptides. Leur mouvement le long de l’ARNm, capturé par profilage des ribosomes, produit les empreintes présentant une périodicité caractéristique du triplet. Ce protocole décrit comment utiliser RiboCode pour déchiffrer cette caractéristique importante à partir des données de profilage des ribosomes afin d’identifier les cadres de lecture ouverts activement traduits au niveau du transcriptome entier.

De novo Identification de cadres de lecture ouverts activement traduits avec des données de profilage de ribosomes

Découvrez l'analyse du profil polyribosome chez les eucaryotes pour étudier la régulation de la traduction. Cette méthode par centrifugation sur gradient de saccharose permet de séparer et visualiser les populations ribosomiques.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Explorer plus de vidéos