Isoler des cellules souches à partir des tissus mous musculo-squelettiques

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules souches adultes des tissus mous musculo-squelettiques tels que les muscles squelettiques. Ceci est accompli en prenant d’abord une biopsie des tissus mous, en les débridant et en les hachant finement. La deuxième étape de la procédure consiste à digérer le tissu par voie enzymatique.

La troisième étape de la procédure consiste à isoler les cellules souches à l’aide d’étapes répétées de pré-placage. La dernière étape de la procédure est l’identification des cellules souches isolées. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les comportements morphologiques et cellulaires des cellules en utilisant l’immunofluorescence, la microscopie et/ou la cytométrie en flux.

Bonjour, je m’appelle Lee et je travaille au laboratoire de pathologie moléculaire du département de chirurgie orthopédique de l’Université de Pittsburgh. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment isoler une cellule souche adulte des tissus mous du système squelettique de Mus, tels que le muscle squelettique. Bonjour, je suis le Dr Johnny Ward.

Je suis professeur à la faculté de médecine de l’Université de Pittsburgh au sein du département de chirurgie orthopédique. J’ai travaillé en étroite collaboration avec le Dr Young Lee et ces procédures pour isoler, vous savez, différents types de cellules souches des muscles squelettiques et modifier les tissus tels que la norme. Nous utilisons les procédures de notre laboratoire pour isoler les cellules souches pour des études de recherche sur les applications de la médecine translationnelle.

Alors étudions-nous. Les tissus à partir desquels les cellules souches peuvent être isolées comprennent les tendons et les muscles squelettiques prélevés sur le tibia ou les muscles soléaires du membre postérieur des souris de type sauvage. Après avoir retiré les restes de peau et d’os, placez les tissus dans une boîte contenant du HBSS froid complété par 5 % de FBS.

Ensuite, placez le tissu séparément sur des plats enrobés de collagène contenant du HBSS froid. Nous utiliserons les tissus musculaires squelettiques pour démontrer les procédures de base de la dissociation et de la digestion des tissus. Utilisez des micro-ciseaux et/ou des lames de scalpel pour hacher les tissus squelettiques en une boue grossière pH digestion enzymatique des tissus.

Commencez par transférer les boues tissulaires MIT dans des tubes séparés de 15 millilitres dans une centrifugeuse à environ 3 500 tr/min à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le lavage SANE en suspendant un HBSS et répétez la centrifugation. Après avoir retiré le supernat, digérez les boues en ajoutant 10 millilitres de préchauffage.0,2 % de collagénase.

Incubez de type 11 pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius, en secouant les tubes à la main toutes les 10 minutes lorsque l’incubation de 60 minutes est terminée. Centrifuger puis remettre en suspension les boues dans 10 millilitres de solution spatiale DYS. Incuber pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius, en secouant à la main toutes les 10 minutes après l’incubation de 45 minutes, centrifuger et suspendre les boues en 10 millilitres de 0,2 % dans la solution HBSS.

Nous incubons généralement pendant 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius tout en inversant les tubes toutes les 10 minutes, l’incubation est terminée. Lorsqu’un nombre suffisant de cellules individuelles sont libérées des tissus, comme illustré ici, centrifugez les cellules résultantes et suspendez la pastille cellulaire dans cinq millilitres de prolifération. Les PM moyens dissocient la suspension cellulaire en passant l’extrait à travers une série d’aiguilles deux fois à travers une aiguille de calibre 18, puis une fois à travers une aiguille de calibre 23 et enfin une fois à travers une aiguille de calibre 27.

Enfin, passez l’extrait cellulaire dans une passoire cellulaire de 70 microns pour commencer la technique prepl. Centrifugez l’extrait cellulaire qui vient d’être préparé et remettez les granulés en suspension en prolifération. Placez cinq millilitres du mélange cellulaire sur un flacon T 25 enduit de collagène et commercialisez-le sous forme de PP incubé à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures.

Au bout de deux heures. Transférez les cellules de non-adhérence dans une nouvelle fiole T 25 enrobée de collagène et commercialisez-les en tant que PP deux. Ajoutez cinq millilitres de PM dans la fiole T 25 précédente étiquetée PP

Remettez les deux flacons dans l’incubateur pendant 24 heures. Après 24 heures, transférez les cellules non adhérentes du PP deux vers un nouveau flacon T 25 enrobé de collagène ENC et marquez-le comme PP trois. Ajoutez cinq millilitres de milieu de prolifération dans la fiole étiquetée PP deux.

Remettez les flacons dans l’incubateur. Répétez la procédure toutes les 24 heures jusqu’à la population PP six. La population de cellules souches est créée.

Les six cellules PP isolées sont très peu nombreuses et doivent être maintenues dans un milieu de prolifération riche en FBS. Cela a changé tous les jours. Bien que la plupart des cellules de la culture PP six mourront au cours de la à deux semaines suivantes de culture.

Une grande population saine de PP six est généralement créée après une à deux semaines supplémentaires d’expansion. Entretenez également tous les autres groupes de cellules en suspension, en leur permettant de proliférer et examinez-les régulièrement à l’aide d’un microscope inversé. Les cellules adhérentes précoces qui se fixent aux flacons PP un et PP deux sont principalement des cellules fibrotiques.

Cellules qui adhèrent aux flacons enrobés de collagène après une période plus longue dans les 48 à 96 heures. Les PP trois et PP quatre sont principalement des myoblastes. Alors que les cellules satellites musculaires sont souvent observées principalement dans la PP cinq, les cellules prépl plus tardives de 96 heures ou plus tard dans la PP 6 sont considérées comme des cellules souches adultes et apparaissent petites, rondes et translucides.

Au début de leur isolement, ils peuvent être caractérisés par immunohistochimie pour leur expression de marqueurs de cellules souches tels que la cellule souche, l’antigène un et le CDC 34. Nous venons de vous montrer comment isoler une cellule souche à partir d’une deuxième masse de la souris. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir les stéroïdes pendant toutes les procédures.

Une fois que la cellule souche a été isolée, assurez-vous de cultiver ces cellules en faible densité pour maintenir les caractéristiques des cellules souches des cellules. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec votre expérience Et je vous souhaite bonne chance pour essayer d’utiliser cela dans votre expérience.

Merci.