Дрозофила Монитор активности (DAM): Метод измерения активности локомотива в мухах

- Монитор активности Drosophila, или DAM, держит центрированные пробки деятельности оборудованные с едой мухи на одном конце и воздух-проницаемым более близко на другом. Эта установка приспосабливает одиночные мухи во время экспериментов продолжительностью несколько дней или даже неделей.

Поместите DAM в контролируемую среду, такую как инкубатор с установленной температурой, влажностью и световым циклом. Проведте эксперимент в темной комнате и, при необходимости, используйте инфракрасный источник света для обработки устройства, которое в отличие от яркого света не влияет на циркадную систему мухи.

Для записи активности локомотива подключите аппарат к компьютерной системе, которая хранит показания детекторов DAM. Электроника DAM непрерывно обнаруживает целостность инфракрасного луча, который излучается через середину каждой трубки и периодически загружает данные в компьютерную систему.

По мере того как муха гуляет назад и вперед внутри пробки, она пересекает инфракрасный луч. Эти перерывы подсчитаны DAM над временем для каждой пробки и служят как измерение деятельности мухи.

В следующем протоколе мы будем использовать систему DAM для изучения циркадных ритмов у взрослых самцов Дрозофилы.

- Перед загрузкой летит в деятельности труб, включите инкубаторы, которые будут использоваться для лечения мониторов деятельности. Отрегулируйте температуру с помощью управления инкубатором и установите свет / темный режим с помощью контроллера света системы DAM или собственной системы управления светом инкубатора, в соответствии с желаемой экспериментальной конструкции.

Далее, обезболивать мух углекислым газом. Затем, используя тонкую кисть, аккуратно перенесите одну муху в трубку активности. Захватите середину одного куска пряжи, который составляет около половины дюйма с мелкими типсами и вставьте пряжу в непродовольственный конец трубки активности, чтобы подключить отверстие и предотвратить побег мухи во время эксперимента, в то же время позволяя поток воздуха в трубку.

Держите трубку уложенной на бок до тех пор, пока муха не пробудится, чтобы муха не застряла в пище. Вставьте трубки в мониторы активности. С более новой, более компактной моделью мониторов TriKinetics, необходимо держать трубки на месте с резинками, чтобы гарантировать, что инфракрасный луч проходит трубку в центре положения.

Наконец, поместите мониторы активности в инкубаторы и подключите их к системе сбора данных через телефонные провода. Проверьте, используя программное обеспечение для сбора систем DAM, что все мониторы подключены должным образом, и что данные собираются с каждого из них.

Теперь, когда мухи были загружены в трубки активности и система мониторинга активности локомотивов готова, данные теперь могут быть записаны. Мухи синхронизируются и переутомлены, подвергая их желаемому свету/темному, или LD, и температурному режиму в течение двух-пяти полных дней. Наиболее часто используемым состоянием вовлечения является светло-темный цикл 12 часов света/12 часов темноты при температуре 25 градусов по Цельсию.

Для изучения циркадных ритмов по отношению к этому протоколу, время, когда свет идти в инкубаторе определяется как zeitgeber время 0 и все другие времена по отношению к этому значению. В соответствии со стандартными 12:12 LD условиях, дикий тип Drosophila melanogaster обычно проявляют два приступа деятельности; один сосредоточены вокруг T0, называют утренний пик, а другой вокруг T12, термин вечерний пик.

Свободно бегущие ритмы локомотивной активности измеряются в постоянных темных и температурных условиях после периода обучения. Установка светового цикла может быть изменена в любое время в темной фазе в последний день ЛД, так что последующий день эксперимента представляет собой первый день DD. Семь дней сбора данных ПД достаточно для расчета циркадного периода и амплитуды или силы ритма мух.

Как правило, размер выборки не менее 16 мух необходим для получения надежных свободно работающих периодов для конкретного генотипа. По завершении эксперимента необработанные бинарные данные, собранные с помощью программного обеспечения системы DAM, загружаются на портативное устройство хранения данных, например, USB-ключ.

Необработанные бинарные данные обрабатываются с помощью DAM Filescan102X и суммируются в 15 и 30 минут бункеров при анализе циркадных параметров, или от 1 до 5 минут бункеров при анализе сна / отдыха параметров. В настоящее время пять смежных минут бездействия является стандартным определением сна / отдыха в Drosophila.