Name: La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez un protocole d'immunofluorescence pour quantifier les foci γH2AX dans les tissus de souris. Cette méthode permet d'évaluer les cassures double-brin de l'ADN et la réponse aux radiations ionisantes.

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Le soutien de l&#39;Institut australien des sciences et techniques nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix AINSE. Laboratoire de médecine épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council de l&#39;Australie (566 559). LM est soutenue par la recherche de Melbourne (Université de Melbourne) et biomédicale bourses d&#39;imagerie complémentaires CRC. Le soutien de Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody et Iska Carmichael) a été inestimable pour ce travail. MMT est reconnaissant pour l&#39;assistance d&#39;experts et de conseils du Dr Olga Sedelnikova du National Institutes of Health.

Les tissus <ol><li> Le tissu pulmonaire, embarqués dans des moules de la température de coupe optimale (PTOM) composé 4583, a été sectionné (5 um) en utilisant un Leica CM 1950 cryostat et montées sur la poly-L-lysine diapositives. </li></ol> Les échantillons congelés ont été obtenus à partir de Dr Simon Royce à l&#39;enfance Murdoch Research Institute. Le tissu pulmonaire a été obtenu à partir de souris Balb traitées / souris c et à partir d&#39;un modèle murin de la maladie chronique des voies respiratoires allergiques qui montre de nombreuses caractéristiques pathologiques de l&#39;asthme humain 6. Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Comité d&#39;éthique animale de l&#39;Institut de recherche des enfants de Murdoch, qui adhère au Code australien des pratiques pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire à des fins scientifiques. <ol start="2"><li> Les articles ont été autorisés à l&#39;air sec à température ambiante pendant 1 heure. </li></ol> Immunofluorescence <ol><li> Les articles ont été fixées avec 2% (p / v) paraformaldéhyde en tampon phosphate salin (PBS) pendant 20 minutes. </li><li> Les articles ont été équilibrées avec deux lavages en PBS pendant 15 minutes chacun. </li><li> Les articles ont été traités avec de l&#39;éthanol à 70% (refroidi à -20 ° C) pendant 20 minutes, suivie de trois lavages en PBS pendant 10 minutes chacun. </li></ol> A ce point diapositives peuvent être stockés dans des conteneurs scellés à 4 ° C pendant 2 semaines. <ol start="4"><li> Les sections ont été lavées trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacun et ensuite bloqués avec 100 ul fraîchement préparé dans du PBS contenant de la BSA 8% dans du PBS contenant 0,5% de Tween-20 et 0,1% de Triton X-100 (PBS-TT) pendant 1 h à température ambiante . Toutes les incubations ont été effectuées dans une auge coloration humidifié. </li><li> Les sections ont été lavées avec du PBS-TT pour 5 minutes et un périmètre hydrophobe a été marquée dans le tissu avec un stylo de Pap. </li><li> L&#39;excès de tampon a été averti et 100 pi de lapin polyclonal primaire anti-γH2AX anticorps (dilution 1:500, dans 1% de BSA dans du PBS; Millipore), a été ajouté à chaque section pour une incubation de 2 heures à température ambiante. L&#39;incubation avec l&#39;anticorps primaire peut être effectuée durant la nuit à 4 ° C. Pour preuve supplémentaire, que les foyers représentent γH2AX CDB, un anticorps primaire reconnaissant une protéine de réparation ORD peuvent aussi être utilisés. Par exemple, la co-localisation des γH2AX et phospho-ATM est une combinaison couramment utilisés. </li><li> Les sections ont été lavées deux fois en PBS-TT pour 5 minutes chacun et incubées avec 100 pi d&#39;anticorps secondaire (Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de lapin dilué 1:500, dans 1% de BSA; Invitrogen) pendant 1 heure à température ambiante dans l&#39;obscurité . (Anticorps dilué a été maintenu dans l&#39;obscurité pendant toute la procédure). </li><li> Les sections ont été lavées trois fois avec du PBS-TT pour 5 minutes chacun et incubées avec 0.5mg/mL RNAse A pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Nucléaire contre-coloration et le montage a été réalisé avec support Vectashield contenant l&#39;iodure de propidium. </li><li> Les lames ont été scellés avec du vernis à ongles et stockés une nuit à 4 ° C dans l&#39;obscurité avant l&#39;analyse. </li></ol> Microscopie / Analyse <ol><li> Un microscope confocal Zeiss LSM510 Meta a été utilisé pour acquérir des images à l&#39;aide de la GFP standard (pour γH2AX - Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de lapin) et PI (543 nm) des lasers. </li></ol> Les images ont été acquises dans un modèle de série Z avec un pas de 0,5 um. Pendant l&#39;analyse, des avions individuels ont été déconvolué et empilés pour produire une image maximale projetée pour minimiser le chevauchement des foyers. La méthode de création d&#39;une image projetée maximale avant un comptage des particules ne doit être utilisé dans des circonstances où une section mince (par exemple 5 um) est utilisée et où le bruit de fond est négligeable. Où sections plus épaisses avec un fond important doit être analysé, une analyse plus complexes tels que compteur d&#39;objets 3D tels que décrits par Bolte et Cordelières (2006) doit être utilisé 7. <ol start="2"><li> Metamorph (Molecular Devices, USA) a été utilisé pour créer fusionné (rouge et vert) des images pour quantifier le nombre de foyers. </li></ol> Bien Metamorph peut être utilisé pour quantifier le nombre des foyers, généralement lors de l&#39;utilisation des coupes de tissus foyers sont comptés manuellement (par œil) pour plus de précision. Types de cellules spécifiques d&#39;intérêt peuvent être sélectionnés pour la quantification, par exemple, les cellules pulmonaires épithéliales. Cela peut être fait sur la base d&#39;histologie et en référence à l&#39;hématoxyline-éosine sections colorées en série.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

Aux fins de cette démonstration, nous avons utilisé les tissus pulmonaires de souris Balb traitées à partir / souris c et à partir d&#39;un modèle murin de la maladie chronique des voies respiratoires allergiques. Nous quantifié les différences dans le nombre de foyers par cellule avec des moyennes légèrement plus élevée observée dans les poumons endommagés par rapport aux sections non traitées. Plus précisément, la quantification indiquée par 6,5 foyers / cellule et 9,4 foyers par / cellulaire (comptage manuel des 20 c...

<table><tbody><tr><td>Sérum albumine bovine (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>La BSA (1 %) est utilisée pour bloquer toute liaison non spécifique des anticorps. Les anticorps primaires et secondaires sont dilués dans de la BSA.</td></tr><tr><td>PBS (sans Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; et Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Composé OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Lames Polysine</td><td>Menzel-Glaser</td><td>SF41296SP</td><td>Attire électrostatiquement les sections de tissus congelés et réduit le besoin de revêtements ou d'adhésifs supplémentaires.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Réactif</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (0,5 %), est un détergent permettant de perméabiliser les cellules</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1 %) utilisé pour la perméabilisation des cellules.</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-&amp;#947;H2AX (anticorps polyclonal de lapin)</td><td>Anticorps primaire</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>Dilution de l'anticorps primaire (1:500) dans 1 % de BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-lapin IgG (H+L) de chèvre</td><td>Anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>Dilution de l'anticorps secondaire (1:500) dans 1 % de BSA.</td></tr><tr><td>Éthanol (70 %)</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>ARNase A</td><td>Réactif</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield PI</td><td>Réactif</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>Un milieu de montage à base de glycérine contenant de l'iodure de propidium (un colorant nucléaire rouge). Ce milieu doit être utilisé avec un objectif à immersion huile dont l'indice de réfraction correspond à celui du milieu.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Remarque : colorant d'ADN couramment utilisé : le 4,6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI). Ne peut être utilisé qu'avec des microscopes équipés du laser d'excitation approprié.</td></tr><tr><td>Mini stylo PAP</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (22x50 mm)</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Bocal Coplin, en verre</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Bac de coloration</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td></td><td>Microscope confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM Leica 1950 Cryostat</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Logiciel pour l'analyse d'images</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la quantification de γh2ax foci dans les échantillons de tissus

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

L&#39;ADN des cassures double brin (CDB) sont des lésions particulièrement meurtrières et génotoxiques, qui peuvent survenir soit par des processus endogènes (physiologique ou pathologique) ou par des facteurs exogènes, en particulier le rayonnement ionisant et les composés radiomimétique. La phosphorylation de l&#39;histone H2A variante, H2AX, à la sérine-139 résidus, dans le très conservé C-terminal motif SQEY, formant γH2AX, est une réponse précoce à l&#39;ADN des cassures double brin<sup&gt; 1</sup&gt;. Cet événement de phosphorylation est médiée par la phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) famille de protéines, de l&#39;ataxie télangiectasie muté (ATM), sous-unité kinase ADN-protéines catalytiques et ATM et RAD3 liés (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Globalement, les résultats d&#39;induction ORD dans la formation de foyers discrets nucléaires γH2AX qui peuvent être facilement détectés et quantifiés par immunofluorescence<sup&gt; 2</sup&gt;. Compte tenu de la spécificité et une sensibilité uniques de ce marqueur, l&#39;analyse des γH2AX foyers a conduit à une large gamme d&#39;applications dans la recherche biomédicale, en particulier en radiobiologie et en médecine nucléaire. La quantification de γH2AX foyers a été plus largement étudié dans les systèmes de culture cellulaire dans le contexte de rayonnements ionisants induit CDB. En dehors de la radiosensibilité cellulaire, immunofluorescence tests basés ont également été utilisés pour évaluer l&#39;efficacité des radiations modifier composés. En outre, γH2AX a été utilisé comme un marqueur moléculaire pour examiner l&#39;efficacité des diverses ORD induisant composés et est annoncée comme étant récemment marqueur important du vieillissement et des maladies, en particulier le cancer<sup&gt; 3</sup&gt;. En outre, les méthodes basées sur l&#39;immunofluorescence ont été adaptés à la détection de costume et la quantification des foyers γH2AX<em&gt; Ex vivo</em&gt; Et<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Ici, nous démontrons une méthode typique d&#39;immunofluorescence pour la détection et la quantification des γH2AX foyers dans les tissus de la souris.

La quantification de l&#39;ADN double-brin de brise sur la base de γH2AX foyers est devenu un outil précieux, en particulier dans la radiobiologie, pour l&#39;évaluation de la radiosensibilité des tissus et des effets des rayonnements composés de modification. Ici nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;un test d&#39;immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers dans des échantillons de tissus.

La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus

Les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont des lésions particulièrement létales et génotoxiques, pouvant être provoquées soit par des processus endogènes (physiologiques ou pathologiques)...

Bonjour, je m'appelle Michelle Tang des Laboratoires de médecine épigénomique et d'épigénétique humaine. Dirigés par le Dr. Tom Carianne, professeur associé ASAM Holster à l'Institut Baker IDI des maladies cardiaques et du diabète. Aujourd'hui, je vais démontrer un dosage d'immunofluorescence gamma H2AX in vivo afin de déterminer la quantité de dommages à l'ADN dans les tissus malades.H2AX est une variante d'histone, qui représente environ 2 à 10 % de l'histone H2A totale chez les cellules eucaryotes, et qui s'hyperphosphoryle rapidement sur la sérine 139 des cellules de mammifères. En réponse à un dommage de l'ADN, la forme phosphorylée de H2AX est également connue sous le nom de γH2AX, et il a été établi qu'il existe une corrélation directe entre le nombre de cassures double brin et le niveau de γH2AX. γH2AX est un marqueur moléculaire sensible et s'est révélé être un indicateur précoce de cassures double brin. Par conséquent, il s'agit d'une technique utile pour détecter les dommages de l'ADN.La protéine γH2AX peut être visualisée sous forme de foyers nucléaires aux sites de dommages de l'ADN en microscopie fluorescente. Dans le cadre de cette expérience, j'utiliserai des tissus pulmonaires de souris provenant du Dr Simon Royce de l'Institut de recherche Murdoch pour l'enfance. J'étudierai les dommages de l'ADN dans les tissus pulmonaires d'un modèle murin de maladie chronique des voies respiratoires allergiques, qui présente de nombreuses caractéristiques pathologiques de l'asthme humain, notamment une hyper-réactivité bronchique, un remaniement des voies respiratoires et une inflammation des voies respiratoires.Commençons donc l'expérience. Nous commençons par placer les échantillons à moins 20 degrés Celsius en les introduisant dans le cryostat pendant environ 20 minutes. Pour une température optimale de coupe, des lames de microscope SRO sont utilisées afin que les coupes de tissu ne se détachent pas des lames.Lors de la coloration immunofluorescente, utilisez du OCT pour fixer les échantillons sur le mandrin, puis placez le mandrin sur le bloc de coupe en vous assurant qu'il est solidement fixé. Réglez le cryostat pour découper des sections tissulaires de cinq micromètres ; commencez soigneusement la section en tirant les échantillons vers vous à l’aide d’un pinceau, puis placez la lame de microscope au-dessus des sections afin qu’elles adhèrent à la surface en verre. Laissez les sections sécher à température ambiante pendant une heure afin d’éliminer toute humidité avant de poursuivre.Tout d'abord, nous fixons les coupes de tissu à l’aide de paraformaldéhyde 2 % préparé dans du PBS sans calcium ni magnésium pendant 20 minutes. Nous éliminons l’excès de paraformaldéhyde, puis plaçons les lames dans un bocal de Copeland pour deux lavages de 15 minutes dans le PBS afin de rendre perméables les membranes cellulaires. Après l’étape de perméabilisation, les échantillons sont traités avec de l’éthanol 70 % à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Les échantillons sont ensuite lavés trois fois dans le PBS, pendant 10 minutes chacun.Retirer chaque site individuellement afin d'éviter que les sections de tissu ne s'assèchent. Éliminer l'excès de PBS sur la lame, puis bloquer les sections avec du BSA à 8 % dans du PBS contenant entre 0,5 % et 0,1 % de Triton X-100, également appelé P-B-S-T-T. Ces lames sont incubées pendant une heure à température ambiante, après quoi les échantillons sont lavés avec du P-B-S-T-T pendant cinq minutes.Le PBS TT est utilisé pour faciliter la pénétration des anticorps dans le noyau. Les lames sont ensuite tamponnées et séchées pour éliminer l'excès de P-B-S-T-T. Un cercle est tracé autour des sections avec un stylo à pap pour réduire la quantité de réactifs utilisée.Un anticorps primaire, un anticorps polyclonal rapide anti-phospho gamma H tox, a été utilisé. Une dilution au 1/500 a été préparée dans du PBS-T-T contenant 1 % de BSA. Ces sections ont été placées dans une chambre humide et incubées pendant deux heures à température ambiante.Éliminer l'anticorps primaire en excès avant d'effectuer deux lavages de cinq minutes dans du P-B-S-T-T afin de retirer l'anticorps primaire en surplus. Retirer les lames et absorber l'excès de P-B-S-T-T. L'anticorps secondaire de chèvre anti-Reid IJJ conjugué à la fluorochrome 488 a été utilisé.Une dilution au 1/500 de l'anticorps secondaire préparée dans du P-B-S-T-T contenant 1 % de BSA a été ajoutée aux échantillons. Les sections sont ensuite incubées pendant une heure dans une chambre humide, puis l'anticorps secondaire est éliminé avant de procéder à trois lavages de cinq minutes chacun dans du N-P-B-S-T-T afin de retirer l'excès d'anticorps secondaire.Couvrez le bocal Copeland avec du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière pendant toute la durée de chaque étape de lavage. Retirez les lames et essuyez l’excès de P-B-S-T-T. L’ajout de 0,5 milligramme par millilitre d’ARNases A dans du PBS a été utilisé pour réduire toute coloration cytoplasmique.Les échantillons sont ensuite incubés à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Après l'incubation, l'ARN A est éliminé et les échantillons sont brièvement lavés dans du P-B-S-T-T pour éviter que les sections ne s'assèchent. Conserver les échantillons enveloppés dans du papier d'aluminium avant l'ajout du milieu de montage.Retirer une lame à la fois et éponger l'excès de P-B-S-T-T. Ajouter un milieu de montage vectoriel contenant de l'iodure de propidium, une coloration nucléaire rouge, sur chaque section. Abaisser ensuite délicatement une lamelle en veillant à éviter de piéger des bulles d'air, puis essuyer l'excès de milieu vectoriel sur du papier absorbant.Ensuite, polissez les bords de la lamelle pour sceller et empêcher les échantillons de se dessécher. Enfin, conservez les échantillons dans un endroit sombre à quatre degrés Celsius jusqu'à ce que les lames soient nécessaires pour la microscopie. Un microscope confocal LSM 510 Meta a été utilisé pour acquérir des images numériques à l'aide d'un objectif à immersion à 63 fois, et des lasers argon et hélium-néon ont été utilisés à une longueur d'onde de 488 nanomètres pour Alexa Fluor 488 et de 543 nanomètres pour le colorant iodure de propidium.Chaque champ était composé de huit à quinze coupes optiques en série Z avec un pas de 0,5 micromètre et un zoom unique. Les images sont exportées sous forme de fichiers TIF individuels et analysées à l'aide de MetaMorph. Les images acquises sur le microscope confocal LSM 510 Meta sont ouvertes dans le logiciel MetaMorph pour l'analyse d'image et le comptage initial des yeux. Les images fluorescentes acquises en série Z sont déconvoluées et superposées pour produire une image 2D à l'aide de filtres de projection maximale.Cela a été fait afin de minimiser la perte de foyers moins intenses. Les images projetées maximales sont transformées en une image binaire et des filtres morphologiques tels que le chapeau haut (top hat) sont appliqués pour réduire le fond et améliorer également la sensibilité de la détection des foyers. Les images correspondantes de l'iodure de propidium sont chargées et les régions nucléaires sont identifiées.Ces régions sont mises en évidence en dessinant manuellement des contours autour des noyaux afin de compter le nombre de foyers par champ. Les régions sont transférées sur les images top hat et des filtres de seuil clair sont appliqués. Le seuil a été choisi avec soin par comparaison visuelle, en accord avec les foyers, et afin d'éviter l'inclusion de tout fond dans chaque champ.L'analyse morpho intégrée pour l'IMA a été utilisée pour compter les foyers. Alternativement, des décomptes manuels peuvent être effectués afin de garantir la fiabilité des résultats. Et ceci conclut le protocole de coloration immunofluorescente in vivo permettant de déterminer la quantité de dommages de l'ADN dans les tissus pathologiques.Cette technique convient à la détection des lésions de l'ADN provoquées par différents stimuli. Toutefois, elle sera particulièrement adaptée pour évaluer les réponses aux rayonnements ionisants et à la radiosensibilité. Voilà donc l'essentiel.Merci d'avoir regardé.

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Biologie

La quantification de l'ADN double-brin de stries en utilisant la formation γH2AX comme marqueur moléculaire est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous démontrons l'utilisation d'un test d'immunofluorescence pour la quantification des γH2AX foyers après exposition des cellules aux radiations.

Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes

L'analyse microscopique des γH2AX foyers, qui forment la suite de la phosphorylation de H2AX à Ser-139, en réponse à l'ADN des cassures double brin, est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous avons utilisé un anticorps mono-méthylé histone H3 lysine à 4 comme un marqueur épigénétique de la transcription euchromatine active, afin d'évaluer la distribution spatiale du rayonnement induit par la formation γH2AX au sein du noyau.

Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de microscopie par immunofluorescence pour détecter des protéines spécifiques de réponse aux dommages de l’ADN localisées sur les sites de cassures double brin de l’ADN dans les cellules mononucléées humaines. Les protéines sont reconnues par des anticorps primaires spécifiques, qui à leur tour se lient à des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui deviennent fluorescents lors de la visualisation microscopique, permettant de visualiser les...

Microscopie d’immunofluorescence pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN

Cellulaire sénescence, l'état irréversible de l'arrêt du cycle cellulaire, peut être induite par diverses contraintes cellulaires. Ici, nous décrivons les protocoles pour induire la sénescence cellulaire et des méthodes pour évaluer les marqueurs de sénescence.

Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence

Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

La méthode présentée combine l'analyse quantitative des ruptures à double brin d'ADN (DSB), de la distribution du cycle cellulaire et de l'apoptose pour permettre l'évaluation par cycle cellulaire de l'induction et de la réparation de l'ASD ainsi que les conséquences d'une défaillance de réparation.

Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Ce protocole présente la préparation des lames et la notation automatisée du test des foyers γ-H2AX sur les lymphocytes du sang périphérique. Pour illustrer la méthode et la sensibilité du test, des lymphocytes isolés ont été irradiés in vitro. Cette méthode automatisée de détection de l’ADN DSB est utile pour les applications de dosimétrie biologique rapides et à haut débit.

Une méthode de notation microscopique automatisée pour le test de foyers γ-H2AX dans les lymphocytes du sang périphérique humain

Ce protocole présente une méthode pour évaluer la formation et la réparation des cassures double brin d’ADN par la détection simultanée des foyers γH2AX et 53BP1 dans les noyaux interphasiques des lymphocytes périphériques humains traités à la bléomycine.

Double immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les lymphocytes périphériques humains

Ici, nous présentons un protocole simple et rapide pour la détection de l’interaction protéique aux sites de dommages à l’ADN.

Dosage des ligands de proximité pour localiser les protéines dans les sites de dommages à l’ADN

Découvrez un protocole d'immunofluorescence pour quantifier les foci γH2AX dans les tissus de souris. Cette méthode permet d'évaluer les cassures double-brin de l'ADN et la réponse aux radiations ionisantes.

La quantification de γH2AX Foci dans les échantillons de tissus

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