Analyse du génome entier en utilisant ChIP d'identifier les gènes cibles spécifiques Isoform

L’objectif global de l’expérience suivante est d’identifier les cibles génomiques de KDM cinq, une Jared une, une RBB deux histones déméthylase. Ceci est réalisé par la préparation de la chromatine réticulée qui est sonicée pour produire des fragments d’ADN de la taille appropriée dans un deuxième temps. Les fragments d’ADN liés à RBB deux sont immunoprécipités avec les anticorps RBB deux.

Ensuite, l’ADN génomique récupéré est amplifié par PCR pour le séquençage. Enfin, les lectures courtes séquencées par Illumina sont alignées de manière unique sur le génome humain, et les pics significatifs sont identifiés et annotés aux gènes les plus proches. Afin d’identifier rbbb, deux gènes cibles ont été obtenus, des résultats montrant les fonctions moléculaires associées à Rrb B, deux gènes cibles basés sur l’identification à l’échelle du génome de Rbbb deux régions enrichies.

Bonjour, je m’appelle Mike. Elle travaille dans le laboratoire du Dr Elizabeth Bencia au Département de biochimie et de génétique moléculaire de l’Université de l’Illinois à Chicago. Et je suis originaire du laboratoire de génomique biomédicale dirigé par le Dr.NGA au BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea.

Et je m’appelle Danielle Dal. Et je m’appelle William Richter. Nous sommes tous les deux également dans le Laboratoire de Compétences de Bienveillance.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour la chromatine, l’immunoprécipitation et le séquençage. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le site de liaison de son dermatologue. Alors commençons.

Pour commencer cette procédure, cultivez environ 10 à la huitième cellule. Pour chaque immunoprécipitation ou ip. Ici, lymphome ostéolytique diffus.

U 9 37 cellules sont utilisées et induites pour la différenciation monocytaire avec TPA pendant 96 heures après la croissance cellulaire dans une solution de formaldéhyde directement dans le milieu jusqu’à une concentration finale de 1 %. Ensuite, agitez brièvement le ballon et laissez-le reposer à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez le média et rincez les cellules avec 15 millilitres de PBS glacé. Répétez ce lavage une fois.

Ensuite, ajoutez six millilitres de tampon de lyse, un dans chacun des flacons sur de la glace. Ensuite, balancez les flacons pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Enfin, récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférez-les dans des tubes coniques de 15 millilitres.

À ce stade, les cellules peuvent être stockées à moins 80 degrés Celsius. Si les cellules ont été congelées, retirez-les. Une fois décongelées, faites tourner les cellules vers le bas et jetez le morceau.

Ensuite, remettez les cellules en suspension dans six millilitres de tampon de lyse deux, secouez doucement les tubes à température ambiante pendant 10 minutes. Répétez la centrifugation et remettez les cellules en suspension dans 2,5 millilitres de tampon de lyse trois. Ensuite, préparez la suspension pour la sonication en la plaçant dans un bécher d’eau glacée avec la micro-pointe d’un sonier Branson 450 réglée entre 50 et 60 % d’amplitude.

Sonicer la solution pour une 32e rafale constante et refroidir sur glace. Pendant une minute, répétez ces impulsions 10 à 15 fois, puis pipetez le contenu du tube de haut en bas et transférez-le dans un nouveau tube. Continuez à pulser et à refroidir la solution.

Cinq fois de plus après la sonication, ajoutez 10 % de Triton X 100 à un dixième du volume de la solution. Transférez ensuite les lysats dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre et essorez les débris dans une micro-centrifugeuse avant la chromatine, l’immunoprécipitation ou la puce. Conservez 50 microlitres de lysat cellulaire comme échantillon d’entrée.

Ensuite, j’ai combiné le lysat cellulaire éliminé avec des billes de dyne liées à l’anticorps qui avait été préalablement préparé comme décrit dans le protocole écrit. Secouez le mélange en plus de l’échantillon d’entrée de 50 microlitres à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Lavez les perles avec un millilitre de tampon de lavage.

Ensuite, utilisez un support magnétique pour collecter les billes et retirer le surnageant. Répétez ce lavage six à huit fois. Effectuez un dernier lavage avec un millilitre de TE plus 50 millimolaires de chlorure de sodium.

Faites tourner les billes dans une micro-centrifugeuse après la centrifugation, aspirez tout tampon TE résiduel. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon elu aux échantillons. Immédiatement après.

Incuber les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes. Grattez les tubes contre un tube de 1,5 millilitre toutes les deux minutes pour maintenir les billes en suspension. Recueillir les billes à l’aide de la centrifugation et du support magnétique et transférer le SNAT dans un tube PCR.

Récupérez ensuite l’échantillon d’entrée précédemment enregistré et ajoutez trois volumes du tampon d’élution. Enfin, placez l’IP et les échantillons d’entrée dans le thermocycleur pendant la nuit à 65 degrés Celsius. Pour inverser les réticulations le lendemain, ajoutez un volume de tampon TE aux échantillons.

Ajoutez ensuite les ARN A à une concentration finale de 0,2 microgramme par microlitre. Incuber les échantillons dans le thermocycleur pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajoutez la protéinase K à une concentration finale de 0,2 microgramme par microlitre.

Ensuite, incubez des échantillons dans le thermocycleur à 55 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, extrayez les échantillons une fois avec un volume de phénol. Extraire les échantillons une deuxième fois avec un volume d’alcool isoamylique phényl chloroforme.

Enfin, extrayez à nouveau les échantillons avec un volume d’alcool isoamylique chloroforme. Ajoutez ensuite 30 microgrammes de glycogène à chaque échantillon. Ajoutez également du chlorure de sodium à une concentration finale de 0,2 molaire et deux volumes d’éthanol aux échantillons.

Incuberez-les pendant 30 minutes à moins 80 degrés Celsius. Après l’incubation, essorez les échantillons et décantez le nat. Lavez les granulés avec 500 microlitres d’éthanol à 75 %, puis séchez les granulés et mettez-les en suspension dans 40 microlitres d’eau.

Pour vérifier la taille des fragments d’ADN produits par la procédure SONICATION, chargez cinq microgrammes de l’échantillon d’entrée purifié dans un gel agricole à 1,8 % et analysez le gel. La procédure de sonication doit produire des fragments de l’ordre de 150 à 350 paires de bases. Cependant, si les fragments ne tombent pas dans cette gamme, la procédure de sonication doit être ajustée en faisant varier le nombre de rafales et l’amplitude avant l’amplification de l’ADN génomique.

Vérifiez la taille, la concentration et l’enrichissement des échantillons tels que décrits dans le protocole écrit. Pour commencer l’amplification de l’ADN génomique, obtenez 34 microlitres de l’échantillon IP et 200 nanogrammes de l’échantillon d’entrée. Effectuer et réparer l’ajout et la ligature d’adaptateurs à des fragments d’ADN à l’aide d’un kit de préparation d’échantillons d’ADN génomique Illumina comme décrit dans le protocole écrit.

Purifiez l’ADN à l’aide d’un kit de purification PCR mini lut, puis éluez-le dans un tampon EB qui a été préchauffé à 50 degrés Celsius. Utilisez respectivement 23 microlitres et 46 microlitres pour l’IP et les échantillons d’ADN d’entrée. Effectuez la réaction PCR en utilisant 23 microlitres d’ADN avec des adaptateurs de 25 microlitres de fusion, ADN polymérase du kit.

Un microlitre de 20 micromolaires de PCR et un microlitre de 20 micromolaires. Ainsi, la PCR deux exécute la réaction PCR comme décrit dans le protocole écrit après l’amplification de la PCR. Purifiez l’ADN avec le kit de purification PCR à mini-boucle Qiagen.

Préchauffez 15 microlitres de tampon EB à 50 degrés Celsius et diluez l’ADN, diluez 0,5 microlitre de l’échantillon, un à quatre et effectuez une lecture NanoDrop pour purifier les produits amplifiés. Préparez un gel AGROS à 1,8 % de 50 millilitres en utilisant de l’eau de qualité HPLC, ajoutez du TAE et du bromure après la fusion de l’agros. Versez ensuite le gel, chargez le gel.

Après avoir ajouté quatre microlitres de tampon de chargement aux échantillons d’entrée et IP, faites fonctionner le gel à 120 volts pendant 45 minutes. Analysez le gel après l’avoir exécuté. Le devrait révéler que des fragments dans la gamme comprise entre 150 et 350 paires de bases sont produits.

Ils représentent des fragments d’ADN génomique d’une longueur de 50 à 250 paires de bases. Et un adaptateur excise la région du gel contenant le matériau dans la plage de 150 à 350 paires de bases avec un scalpel. Veillez à ne pas exciser la bande de l’adaptateur de l’adaptateur, qui fonctionne à environ 120 paires de bases.

Récupérez l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction rapide de gel en kayak selon les instructions du fabricant. Séchez l’échantillon à une vitesse précise de 11 microlitres sans chaleur. Prélever un microlitre de l’échantillon et mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop.

Enfin, identifiez les produits géniques enrichis à l’aide de l’analyseur de génome Illumina et analysez les sites de liaison et les gènes cibles comme décrit dans le protocole écrit. Les coordonnées génomiques de la protéine de liaison RB enrichie deux ou des régions de liaison RBP deux identifiées sont présentées dans un format chromosomique. L’occupation des gènes d’ensemble dans les chromosomes peut être visualisée sous forme de VAR noirs.

Ici, les occupations du chromosome 10 sont montrées rbp deux régions de liaison sont montrées sous forme de lignes verticales. Le panneau du milieu montre toutes les régions de liaison des isoformes de rbp deux sur le chromosome 10, et le panneau du bas montre les deux grandes régions de liaison des isoformes de rbp. Cette information donne un aperçu du chevauchement et de l’occupation spécifique des deux isoformes de RBP sur le chromosome 10.

Ici, une carte thermique est montrée avec le taux de fausses découvertes ou corrigé FDR significativement enrichi l’ontologie des gènes ou les catégories de fonction moléculaire go parmi les gènes liés par rbp. Deux couleurs vers le rouge indiquent une signification statistique élevée. Le jaune indique une faible signification statistique, et le gris indique l’absence de signification statistique.

L’analyse d’enrichissement montre le chevauchement et la spécificité des fonctions moléculaires spécifiques aux isoformes de R BP, deux gènes cibles. Nous venons de vous montrer comment identifier les sites de liaison des facteurs de transcription au cours de cette procédure. Il est important de produire des fragments d’ADN de la taille et du rendement appropriés.

Cela peut être réalisé en suivant nos directives lors de l’étape de SONICATION. Donc c’est tout. Bonne chance dans vos expériences et merci d’avoir regardé.