Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes
30 août 2010
Nous démontrons injection intrapéritonéale dans le poisson zèbre adulte. Nous utilisons une microseringue 10 ul Nanofil contrôlée par un contrôleur Micro4 et UltraMicroPump III. Cette manifestation comprend l'utilisation de l'eau froide comme anesthésique.
L'objectif général de cette procédure est d'injecter une solution dans la cavité péritonéale du poisson-zèbre adulte. Dans cet exemple, nous injecterons du glucose dans notre laboratoire. Nous utilisons cette procédure pour étudier le blocage du glucose sanguin.
Cela s'accomplit tout d'abord en pesant le poisson afin de déterminer la quantité de solution à injecter par gramme de poids corporel. La deuxième étape de la procédure consiste à anesthésier le poisson à l'aide d'eau froide. La troisième étape consiste à transférer le poisson sur la platine du microscope et à effectuer l'injection.
La dernière étape de la procédure consiste à replacer le poisson dans son aquarium pour sa récupération. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus afin de montrer les modifications de l'homéostasie du glucose par la mesure des taux de glucose sanguin. Bonjour, je suis Mary Kinkle du laboratoire de Victoria Prince au Département de biologie et d'anatomie des organismes de l'Université de Chicago.
Je suis Stephanie Ames, également du laboratoire Prince. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'injection intrapéritonéale chez des zebrafish adultes. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la régulation de l'homéostasie du glucose sanguin.
Commençons. Pour préparer les poissons en vue d'une injection, commencez par transférer les poissons dans un aquarium propre et supprimez la nourriture. Jeûnez les poissons pendant 24 heures pour vider le contenu du bulbe intestinal et pendant 72 heures afin de réduire la glycémie à des niveaux de base.
La densité utilisée dans ce protocole est de 10 à 12 poissons de sexe mixte par aquarium de neuf litres, avec trois couches de billes. Les billes piègent les œufs afin qu'ils ne soient pas mangés. Retirez les œufs et les déchets quotidiennement en aspirant l'aquarium.
Ensuite, préparez la solution saline Cortland en utilisant 124,1 millimolaire de chlorure de sodium, 5,1 millimolaire de chlorure de potassium, 2,9 millimolaire de pyrophosphate de sodium, 1,9 millimolaire de sulfate de magnésium heptahydraté, 1,4 millimolaire de chlorure de calcium dihydraté, 11,9 millimolaire de bicarbonate de sodium, quatre grammes de polyvinylroone et 1000 unités USP d'héparine, le tout porté à un volume final de 100 millilitres avec de l'eau déionisée. Filtrez, stérilisez et conservez à quatre degrés Celsius. Ensuite, dissolvez cinq grammes de glucose dans 10 millilitres de solution saline Cortland afin d'obtenir une solution de glucose à 0,5 milligramme par microlitre. Filtrez, stérilisez et conservez à quatre degrés Celsius.
Ensuite, préparez la table chirurgicale en découpant une éponge souple à une hauteur d'environ 20 millimètres sur la face plane. Effectuez une incision profonde de 10 à 15 millimètres afin de maintenir le poisson pendant l'injection. Placez l'éponge dans une boîte de Pétri de 60 millimètres et positionnez cette boîte de Pétri avec l'éponge sur le couvercle d'un récipient destiné aux embouts de pipette P 200.
Ensuite, préparez le microscope en recouvrant la base du microscope de film plastique et de serviettes en papier pour la protéger. En cas de déversement, placez la table chirurgicale sur les serviettes en papier. Réglez préalablement la mise au point en observant la table chirurgicale et en mettant la éponge au point.
Placez votre doigt sur le dessus de l'éponge et concentrez-vous dessus afin de minimiser tout ajustement focal supplémentaire lorsque le poisson sera sur la table chirurgicale. Ensuite, pesez le poisson en remplissant un bécher de 500 millilitres environ au tiers avec de l'eau provenant de l'élevage des poissons et une déchirure. Sur une balance, transférez délicatement le poisson avec le moins d'eau excédentaire possible dans le bécher, enregistrez le poids, puis transférez chaque poisson pesé dans un aquarium transparent et étiqueté.
Calculer le volume d'injection en fonction du poids. Dans cet exemple, nous allons injecter une solution de 0,5 milligramme par gramme de poids corporel de glucose dissous dans une solution saline Cortland. Étant donné que notre solution contient 0,5 milligramme par microlitre, le calcul est le suivant : un multiplié par le poids du poisson en grammes donne le volume à injecter en microlitres. Préparer la seringue et le matériel d'injection associé.
Ce protocole utilise une aiguille en acier biseautée de 30 5G, une pompe ultra-micro et un microprocesseur quadruple, ainsi qu'une microsyringe nano fill de 10 microlitres pour l'injection de glucose. Remplissez la seringue avec du glucose à 0,5 milligramme par microlitre dissous dans une solution saline Cortland. Il est important d'éliminer toutes les bulles d'air de la seringue, de monter celle-ci sur la pompe ultra-micro et de programmer le volume d'injection pour le premier poisson en entrant le volume en nanolitres à l'aide du pavé numérique du microprocesseur quadruple. Enfin, préparez l'anesthésique à base de glace en broyant suffisamment de glaçons fabriqués à partir d'eau provenant de l'élevage de poissons.
Pour remplir un seau à glace, placez la table chirurgicale dans un récipient plus grand, tel qu'un contenant en caoutchouc pour aliments d'une capacité de 2,4 litres. Versez de l'eau tiède de l'établissement dans le récipient extérieur et sur la table chirurgicale. Gardez un réservoir de secours d'eau tiède de l'établissement à proximité.
Fixez un thermomètre au récipient extérieur. Placez le récipient extérieur contenant l'anesthésique ainsi que la table chirurgicale à proximité du microscope. Tenez le seau de glaçons à portée de main.
Commencez à ajouter des glaçons jusqu'à ce que la température de l'eau atteigne 17 degrés Celsius. Ne descendez pas en dessous de 17 degrés Celsius lors de cette étape. Utilisez un filet pour transférer les poissons vers le récipient extérieur.
À 17 degrés ou légèrement en dessous, les poissons étendent généralement leurs nageoires pectorales horizontalement, halètent et présentent des mouvements auriculaires rapides. Ajoutez lentement des morceaux de glace dans le récipient afin d'abaisser la température jusqu'à 12 degrés Celsius sur plusieurs minutes. Lorsque la température diminue, le poisson nage de plus en plus lentement et finit par cesser de nager.
Éventuellement, les mouvements de suffocation cesseront et les mouvements auriculaires ralentiront. Le poisson est prêt pour l'injection lorsqu'il ne réagit plus à la manipulation. Lorsque la température requise est atteinte, appuyez sur l'éponge pour l'imbiber complètement.
Gardez vos doigts dans l’eau froide suffisamment longtemps pour qu’ils ne réchauffent pas le poisson et ne le sortent pas de l’anesthésie. Pendant la manipulation avec des doigts froids, transférez délicatement le poisson dans la rainure de l’éponge. Placez le poisson avec l’abdomen vers le haut et les branchies dans la rainure.
Transférez rapidement la table chirurgicale sur la platine du microscope. En travaillant rapidement, positionnez soigneusement l'aiguille de manière à ce que la pointe soit orientée vers l'avant et plus proche du ceinturon pelvien que de l'anus. Insérez l'aiguille dans la ligne médiane entre les nageoires pelviennes.
Vous devriez pouvoir sentir quand l'aiguille est profonde par rapport à la paroi corporelle. En insérant l'aiguille, vous sentez la paroi céder. Lorsque l'aiguille pénètre dans la cavité abdominale, injectez le volume approprié à l'aide du microprocesseur.
Utilisez la pédale pour injecter un microlitre par gramme de poids corporel du poisson ; après l'injection, retirez l'aiguille et transférez immédiatement le poisson dans son réservoir d'eau chaude pour la récupération. En relâchant le poisson depuis l'éponge au-dessus de l'eau du réservoir, vérifiez l'aiguille au microscope. Parfois, une écaille peut être attachée et doit être retirée avant l'injection suivante.
Après une période de temps appropriée, procédez à votre test en aval. Nous avons constaté qu'un jeûne de 72 heures est nécessaire pour réduire la glycémie à un niveau de base avant l'injection. Sur cette figure, les données du témoin non injecté, indiquées en vert, montrent des valeurs de glycémie non significativement différentes de celles des témoins injectés avec le véhicule, indiqués ici en rouge.
Cependant, la ligne bleue affiche les valeurs de glucose sanguin pour les poissons ayant reçu une injection de glucose, montrant l'augmentation et la diminution du glucose circulant. Au fil du temps, les animaux ayant reçu une injection de glucose ou de véhicule étaient sous anesthésie chirurgicale pendant la procédure d'injection, tandis que les témoins non injectés n'étaient pas sous anesthésie chirurgicale. Nous venons de vous montrer comment réaliser une injection intrapéritonéale chez des zebrafish adultes.
Dans notre laboratoire, nous étudions les variations de la concentration de glucose sanguin à différents moments suivant une injection intrapéritonéale d'une solution de glucose. Toutefois, cette technique que nous venons de vous montrer peut être utilisée pour injecter votre solution d'intérêt. Lorsque vous effectuez cette procédure, n'oubliez pas d'anesthésier lentement le poisson et de le manipuler délicatement.
Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
Aperçu
Cet article démontre la procédure d'injection intrapéritonéale chez le poisson-zèbre adulte, en utilisant une micropipette NanoFil et une anesthésie à l'eau froide. La méthode vise à étudier l'homéostasie du glucose sanguin par des injections précises.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Physiologie
Contexte
- Les injections intrapéritonéales sont essentielles pour administrer des substances directement dans la cavité péritonéale.
- Le poisson zèbre est un organisme modèle précieux pour l'étude des processus métaboliques.
- Comprendre la régulation du glucose sanguin est crucial pour obtenir des informations sur les troubles métaboliques.
- L'utilisation d'anesthésie est nécessaire pour minimiser le stress pendant le protocole.
Objectif de l'étude
- Démontrer une méthode fiable pour l'injection intrapéritonéale chez le poisson zèbre.
- Faciliter la recherche sur l'homéostasie du glucose et son régulation.
- Fournir un protocole pouvant être reproduit dans d'autres laboratoires.
Méthodes utilisées
- Préparation des poissons par jeûne et pesée afin de déterminer le volume d'injection.
- Anesthésie des poissons à l'aide d'eau froide pour garantir un mouvement minimal pendant l'injection.
- Injection d'une solution de glucose dans la cavité péritonéale à l'aide d'une microsyringe précise.
- Surveillance de la récupération des poissons après l'injection pour évaluer l'impact de la procédure.
Résultats principaux
- La procédure permet avec succès l'injection de substances chez des zebrafish adultes.
- Les taux de glucose sanguin peuvent être mesurés après l'injection afin d'étudier les modifications métaboliques.
- Les poissons se remettent bien de l'intervention, ce qui indique l'efficacité de l'anesthésie utilisée.
- Les résultats contribuent à une meilleure compréhension de l'homéostasie du glucose chez le zebrafish.
Conclusions
- Cette méthode fournit un outil précieux aux chercheurs qui étudient les processus métaboliques chez le poisson zèbre.
- L'injection intrapéritonéale est une technique réalisable et efficace pour administrer des solutions.
- De futures études pourront s'appuyer sur ce protocole afin d'explorer diverses conditions métaboliques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Une administration précise de composés chez le poisson zèbre permet de réduire les risques mécanistiques liés aux cibles métaboliques en établissant des relations dose-réponse dans un système vertébré. Cette approche soutient la validation des cibles grâce à une perturbation contrôlée de l'homéostasie du glucose, réduisant ainsi l'ambiguïté dans l'analyse des voies métaboliques. La méthode améliore la fiabilité prédictive en phase précoce de découverte en fournissant des lectures phénotypiques quantitatives et reproductibles, pertinentes pour la modélisation des maladies métaboliques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en administrant des doses définies pour évaluer l'engagement ciblé dans les voies de régulation du glucose.
- Valeur opérationnelle : Assure une administration reproductible des composés afin de minimiser la variabilité lors de l'évaluation du phénotype métabolique.
- Valeur scientifique : Soutient la détection biologique des risques grâce à la mesure directe des variations de la glycémie, utilisée comme indicateur fonctionnel de la modulation de cibles métaboliques.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Génère des mesures quantitatives de variables dépendantes (niveaux de glucose sanguin) permettant une analyse dose-réponse pour l'identification de composés candidats.
- Valeur opérationnelle : Standardise le volume d'injection en fonction du poids des poissons, améliorant ainsi la reproductibilité du test entre les différentes séries expérimentales.
- Valeur scientifique : Facilite la préparation de systèmes biologiques validés pour des protocoles de criblage métabolique en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur des systèmes pertinents pour la maladie en modélisant une perturbation de l'homéostasie du glucose associée à la physiopathologie du diabète.
- Valeur opérationnelle : Garantit une cohérence procédurale grâce à des protocoles standardisés de jeûne, d'anesthésie et d'injection, favorisant la reproductibilité entre laboratoires.
- Valeur scientifique : Permet une détection mécanistique des risques en isolant l'effet des composés injectés des augmentations de glucose induites par le stress, grâce à des témoins véhicules.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la validation de la cible à l'optimisation du composé, en offrant une voie fiable pour l'administration de composés dans des tests métaboliques chez le poisson zèbre.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies impliquées dans la régulation du glucose en permettant une administration précise de composés à des zebrafish adultes.
- Écrans : Assure la préparation des tests grâce à des volumes d'injection standardisés, basés sur le poids, garantissant une exposition constante aux composés.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de la glycémie permettant de comparer les réponses métaboliques entre différents groupes traités.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en utilisant un modèle de vertébré doté de mécanismes conservés de l'homéostasie glucidique.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité réutilisable de criblage de phénotypes métaboliques pour diverses séries de composés et classes de cibles.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans l'analyse des voies métaboliques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à des volumes d'injection définis et à des procédures d'anesthésie contrôlées.
- Valeur stratégique : Permet de mieux décider de poursuivre ou non un projet en fournissant des données claires sur la relation dose-réponse dans la modulation de l'homéostasie du glucose.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des composés ajustée au risque, fondée sur des effets métaboliques validés dans un système organisme entier.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des zebrafish, l'anesthésie et les techniques d'injection par microsyringe.
- Dépend de l'accès à des pompes ultra-micro, des microsyringes NanoFil et des dispositifs d'anesthésie à température contrôlée.
- Exige une standardisation inter-équipes concernant la durée du jeûne, la mesure du poids et le calcul du volume d'injection.
- Implique des adaptations selon les solubilités des différents composés et les volumes d'injection dans le véhicule constitué de solution saline Cortland.
- Est limité par le niveau de compétence technique requis pour maintenir l'aération des branchies et éviter les traumatismes au site d'injection pendant l'exécution de la procédure.
