Détection de Neu1 activité sialidase dans la régulation activation du récepteur Toll-like

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer l'induction de l'activité cellulaire de la nouvelle sase en réponse à la liaison d'un ligand à son récepteur spécifique. Cette évaluation est réalisée en premier lieu en cultivant des cellules sur des lamelles circulaires en verre de 12 millimètres dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits pendant 24 heures. Dans un deuxième temps, les cellules vivantes adhérentes à la lamelle en verre sont placées directement en contact avec un mélange préalablement préparé de substrat de sase et de ligand du récepteur, avec ou sans inhibiteurs spécifiques, sur une lame de microscope.

La lame de microscope est immédiatement placée sous un microscope à fluorescence afin de visualiser et de capturer numériquement les images fluorescentes. Des résultats au fil du temps sont obtenus, montrant des changements dans l'activité de la nouvelle sase à la surface cellulaire associée aux cellules vivantes traitées par le ligand, en fonction de l'intensité de la fluorescence bleue entourant les cellules en microscopie à fluorescence épiscopique.

Le principal avantage de l'utilisation de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'analyse spectrophotométrique, réside dans la réduction de la quantité de réactifs utilisés. Vous pouvez également observer et capturer des images de l'activité sase dans des cellules vivantes. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'immunologie, telles que l'étude de nouvelles interactions potentielles entre ligands et récepteurs, ainsi que l'analyse des effets d'inhibiteurs spécifiques d'enzymes ou de protéines sur l'activation des récepteurs.

Le Dr Ray Amit et le Dr PT Gath, anciens étudiants au doctorat de mon laboratoire qui utilisent cet essai dans leurs études de recherche, démontreront la procédure. Avant de redémarrer les cellules de macrophages congelées, préparez le milieu de culture en utilisant le milieu Eagle modifié Delcos, filtré stérilement et complété avec 10 % de sérum de veau fœtal et cinq microgrammes par millilitre de l'antibiotique plasmin. Ajoutez ensuite quatre millilitres de ce milieu de culture dans un flacon de culture cellulaire de 25 centimètres carrés pour chaque ampoule de cellules congelées, retirez l'ampoule de cellules congelées du congélateur à moins 80 degrés Celsius et décongelez-la rapidement en la réchauffant à la main sous la hotte de confinement stérile pour risques biologiques.

Cela prendra environ deux à trois minutes. Dès que les cellules sont décongelées, utilisez une pipette stérile d'un millilitre pour les transférer rapidement dans le flacon de culture cellulaire contenant le milieu conditionné. Placez le flacon contenant les cellules dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone en utilisant un microscope inversé.

Vérifiez quotidiennement la croissance et l’attachement des cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 75 % à 90 %, quelques jours avant la mise en place des cellules pour le test SASE. Préparez les lames circulaires en verre de 12 millimètres sur lesquelles les cellules seront ensemencées. Dans l’enceinte de sécurité biologique.

Placer les lames dans une grande boîte de Petri en verre et les stériliser en les immergeant dans de l'éthanol à 100 % pendant une heure. Retirer l'alcool et laisser les lames de verre humides exposées au flux d'air stérile filtré dans l'enceinte sous rayonnement UV pendant 24 heures ou jusqu'à ce qu'elles soient sèches avant la mise en culture. Pour commencer, stériliser complètement une pince courbe en acier inoxydable de quatre pouces à dents en la passant à la flamme.

Ensuite, utilisez la pince pour placer soigneusement une lame circulaire en verre stérile dans chaque puits d'une plaque en polystyrène traitée pour culture tissulaire, à fond plat et comportant 24 puits. À l'aide d'une pipette stérile de cinq millilitres, retirez le milieu conditionné DMEM du flacon contenant les cellules de macrophages adhérentes. Lavez les cellules une fois avec un volume de solution tamponnée au tris stérile 1 x, pH 7,4, afin d'éliminer tout milieu contenant du sérum.

Ensuite, ajoutez un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate, exempte de phosphate, contenant du calcium, à un pH de 7,4. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ 10 minutes ou jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher du flacon. Une fois que les cellules se sont détachées, ajoutez trois millilitres de milieu conditionné DMEM aux cellules en suspension.

Ensuite, transférez 0,5 millilitre de la suspension contenant environ 0,5 million de cellules vers chaque lame circulaire en verre de 12 millimètres dans la plaque de 24 puits, puis incubez la plaque de culture tissulaire contenant les cellules de macrophages à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures afin de permettre aux cellules de s’adhérer aux lames circulaires en verre. Le dosage de l’activité de la sase sera effectué selon trois conditions différentes sur trois lames de microscope distinctes. Sur la première lame, qui sert de témoin négatif.

Les cellules témoins sont exposées à un milieu de montage. Le substrat de la neuraminidase pour ANA et le tampon salin au tris, mais pas le ligand du récepteur de type Toll LPS. Sur la deuxième lame, les cellules sont exposées au milieu de montage, au ligand du récepteur de type Toll LPS et au tampon salin au tris.

Sur la troisième lame, les cellules sont exposées à un milieu de montage contenant ANA, LPS Tris, une solution saline tamponnée et l'inhibiteur de la neuraminidase Tamiflu. Nous démontrerons la procédure pour le deuxième test uniquement, car les trois tests ne diffèrent que par le mélange de composés déposés sur la lame de microscope. Placez la lame de microscope sur le plan de travail et ajoutez les composés suivants dans l'ordre séquentiel indiqué.

Un microlitre de milieu de montage, suivi d'un microlitre de forme deux microlitres de LPS, puis, enfin, trois microlitres de solution saline tamponnée au tris, pH 7,4. Ensuite, retirez le milieu d'un puits de la plaque 24 puits contenant les cellules. L'étape suivante constitue l'aspect le plus délicat de cette procédure, car vous devez retirer le couvre-objet circulaire en verre du puits de la plaque de culture tissulaire à l'aide de pinces, sans le casser, avec des pinces de quatre pouces.

Soulevez délicatement la lame circulaire en verre vers le coin du puits, puis retirez-la soigneusement et placez-la, avec les cellules orientées vers le bas, dans le mélange de solution. Sur la lame de microscope, transportez immédiatement la lame vers un microscope à fluorescence épiscopique réglé pour le filtre UV et équipé d'une caméra numérique pour capturer les images fluorescentes. Mettez au point le microscope en contraste de phase jusqu'à ce que vous puissiez voir les cellules, puis passez en mode fluorescence.

Acquérir des images des cellules en mode fluorescent à une minute, deux minutes et trois minutes. En outre, acquérir une image unique des cellules en représentation contraste de phase. Les résultats d'une expérience de test sase sont présentés ici.

Primo, comme témoin négatif, des cellules vivantes adhérées à une lame de verre ont été mises en contact direct avec un mélange de milieu de montage et de substrat, afin de détecter une éventuelle activité IP sase. Si cette activité était présente, le substrat serait hydrolysé pour produire de l'éthyl lum béone libre, dont l'émission fluorescente se situe à 450 nanomètres après excitation à 365 nanomètres, mesurée deux minutes après l'ajout du substrat.

Cette image fluorescente ne montre aucune activité SASE autour des cellules. Cette image suivante présente les résultats d'un test positif de dosage SASE, dans lequel des cellules vivantes adhérant à une lame de verre ont été mises en contact direct avec un mélange composé d'un milieu de montage, d'un substrat quatre et d'un ligand LPS du TLR quatre. Le substrat a été hydrolysé par l'enzyme SASE pour produire de la lumibéone éthylée libre, et l'image fluorescente prise deux minutes après l'ajout du substrat et du LPS indique des niveaux élevés d'activité SASE autour des cellules.

Cependant, lorsque des cellules vivantes ont été mises en contact direct avec un mélange composé d'un milieu de montage formant un nano-substrat, d'un ligand TLR4 comme le LPS, ainsi que d'un inhibiteur de la neuraminidase, l'activité sase a été fortement réduite, voire plus détectable, selon la concentration de l'inhibiteur. Enfin, ce graphique montre la concentration inhibitrice 50 % (CI50) de Tamiflu et de l'oseltamivir carboxylate, déterminée en traçant la diminution de l'activité sase en fonction du logarithme de la concentration de l'agent ; la fluorescence moyenne entourant les cellules de chaque groupe a été mesurée. À l'aide du logiciel Image J, lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de cultiver les cellules sur des lamelles circulaires en verre dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits, 24 heures avant de commencer le test Sade.

En outre, tous les réactifs utilisés dans ce dosage doivent être préparés avant de commencer le dosage.