Name: Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Découvrez la préparation de matrices souples pour quantifier la contraction cellulaire par microscopie de force de traction. Cette méthode utilise des gels de polyacrylamide pour étudier les effets de la rigidité de la matrice extracellulaire sur le comportement cellulaire.

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Nous remercions le laboratoire d&#39;Ulrich Schwarz pour un logiciel de suivi informatique utilisée dans la quantification des forces de traction cellulaire (Sabass et al., 2008). Ce travail a été soutenu par une bourse de carrière Burroughs Wellcome et Pioneer Award NIH directeur (DP10D00354) à ML Gardel et Scientifique médical Prix national de services de recherche (5 T32 GM07281) au SP Winter.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

La procédure décrite ici pour l&#39;installation d&#39;un microscope à force de traction (TFM) expérience, avec la mise en œuvre des routines de suivi informatique (Sabass et al., 2008), permet la quantification des forces cellulaire avec l&#39;échelle du micron résolution spatiale. Afin d&#39;optimiser le protocole expérimental, il est essentiel de former un substrat gel pur et uniforme avec un revêtement uniforme de ligand ECM. Nous discutons de pièges potentiels ci-dessous: Surface ...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropyltriméthoxysilane</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide à 40 %</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide à 2 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d'ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles fluorescentes de 40 nm</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d'imagerie confocale (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse pour lamelles</td><td>Conçue en interne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lampe ultraviolette CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>Support en acier inoxydable</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazine hydratée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>Métaperiodate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Collagène</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles (#1.5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>SOPUS Products</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

La régulation de l&#39;adhésion cellulaire à la matrice extracellulaire (MEC) est essentielle pour la migration cellulaire et remodelage de la MEC. Adhésions focales sont des assemblages macromoléculaires qui couplent les contractiles F-cytosquelette d&#39;actine à l&#39;ECM. Cette connexion permet la transmission de forces mécaniques intracellulaire à travers la membrane cellulaire au substrat sous-jacent. Des travaux récents ont montré les propriétés mécaniques de l&#39;ECM et de réguler adhésion focale F-actine la morphologie ainsi que de nombreux processus physiologiques, y compris la différenciation cellulaire, la division, la prolifération et la migration. Ainsi, l&#39;utilisation de substrats de culture cellulaire est devenu une méthode de plus en plus répandue pour contrôler avec précision et de moduler les propriétés mécaniques d&#39;ECM. Afin de quantifier les forces de traction au adhésions focales dans une cellule adhérente, substrats compatibles sont utilisés en conjonction avec l&#39;imagerie haute résolution et des techniques de calcul dans une méthode de traction microscopie à force appelée (TFM). Cette technique repose sur des mesures de l&#39;ampleur et la direction locale des déformations induites par la contraction du substrat cellulaire. En combinaison avec haute résolution de la microscopie par fluorescence des protéines par fluorescence marqués, il est possible de corréler l&#39;organisation du cytosquelette et le remodelage des forces de traction. Nous présentons ici un protocole expérimental détaillé pour la préparation de deux dimensions, les matrices conformes pour le but de créer un substrat de culture cellulaire avec une bien caractérisés, rigidité mécanique accordable, ce qui est convenable pour mesurer la contraction cellulaire. Ces protocoles comprennent la fabrication d&#39;hydrogels de polyacrylamide, le revêtement des protéines de la MEC sur des gels tels, les cellules de placage sur des gels, et à haute résolution microscopie confocale en utilisant une chambre de perfusion. De plus, nous fournissons un échantillon représentatif de données démontrant l&#39;emplacement et l&#39;ampleur des forces cellulaires en utilisant des protocoles cité TFM.

Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques expérimentales utilisées pour fabriquer conforme, la matrice extracellulaire (ECM) substrats recouverts adapté à la culture cellulaire, et qui se prêtent à la microscopie à force de traction et en observant les effets de la rigidité d&#39;ECM sur le comportement cellulaire.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

La régulation de l'adhésion cellulaire à la matrice extracellulaire (MEC) est essentielle pour la migration cellulaire et le remodelage de la MEC. Les adhésions focales sont...

L'objectif général de cette procédure est de créer des matrices compatibles permettant de moduler et de quantifier la contraction cellulaire. Cela est réalisé en activant d'abord une lame afin de permettre l'ancrage de la matrice. La deuxième étape de la procédure consiste à polymériser un gel de polyacrylamide sur la lame activée.La troisième étape de la procédure consiste à ensemencer les cellules sur le gel et à les laisser adhérer. La dernière étape de la procédure est l'acquisition d'images du gel afin de générer des données à analyser selon des protocoles de microscopie de force de traction. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant que les cellules exercent des forces de traction sur leur matrice par microscopie de force de traction.Bonjour, je suis Yvonne Eons du laboratoire de Margaret ELL au Département de physique et à l'Institut de dynamique biophysique de l'Université de Chicago. Je suis Steven Winter, également du laboratoire Guard. Aujourd'hui, nous aimerions vous montrer une procédure permettant de fabriquer des matrices extensibles pour mesurer la contraction cellulaire.Nous utilisons ces procédures dans notre laboratoire pour étudier les réseaux contra

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Nous décrivons la méthode prototype pour la fabrication des lamelles de microscope recouvertes de gélatine fluorescente pour visualiser dégradation de la matrice invadopodes médiation. Techniques de calcul à l'aide du logiciel disponible sont présentées pour quantifier les niveaux résultants de protéolyse de la matrice de cellules individuelles au sein d'une population mixte et des groupes pluricellulaires englobant ensemble des champs microscopiques.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cette vidéo décrit la mesure de la contraction des cellules musculaires lisses aortiques (SMC) à l’aide de la détection d’impédance électrocellulaire-substrat, ou ECIS. ECIS mesure la locomotion des cellules et constitue une méthode fiable pour mesurer les contractions.

Mesure de la contraction de la SMC in vitro : une méthode non invasive pour évaluer la contraction des cellules musculaires lisses à l’aide de la détection d’impédance cellule-substrat électrique

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L'utilisation de Microscale Silicon Cantilevers pour évaluer cellulaire contractile Fonction In Vitro

Ici, nous décrivons le développement et l’application d’un test de contraction de gel pour évaluer la fonction contractile dans les cellules mésenchymateuses qui ont subi une transition épithéliale-mésenchymateuse.

Développement d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Essai pour évaluer contractile Fonction mésenchymateuses Les cellules de transition épithéliale-mésenchymateuse A subi

La différenciation cellulaire est régulée par une foule de facteurs microenvironnement, y compris les propriétés de la composition de la matrice et de matériaux de substrat. Nous décrivons ici une technique utilisant des puces à ADN de cellules en conjonction avec une force de traction au microscope pour évaluer la différenciation des cellules et les interactions cellule-substrat biomécaniques en fonction du contexte microenvironnement.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

Les forces mécaniques sont importantes pour contrôler la migration cellulaire. Ce protocole démontre l'utilisation d'hydrogels élastiques qui peuvent être déformés à l'aide d'une micropipette en verre et d'un micromanipulateur pour stimuler les cellules avec un gradient de rigidité local pour provoquer des changements dans la structure cellulaire et la migration.

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Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

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