Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

L'objectif général de cette procédure est de créer des matrices compatibles permettant de moduler et de quantifier la contraction cellulaire. Cela est réalisé en activant d'abord une lame afin de permettre l'ancrage de la matrice. La deuxième étape de la procédure consiste à polymériser un gel de polyacrylamide sur la lame activée.

La troisième étape de la procédure consiste à ensemencer les cellules sur le gel et à les laisser adhérer. La dernière étape de la procédure est l'acquisition d'images du gel afin de générer des données à analyser selon des protocoles de microscopie de force de traction. En définitive, on peut obtenir des résultats montrant que les cellules exercent des forces de traction sur leur matrice par microscopie de force de traction.

Bonjour, je suis Yvonne Eons du laboratoire de Margaret ELL au Département de physique et à l'Institut de dynamique biophysique de l'Université de Chicago. Je suis Steven Winter, également du laboratoire Guard. Aujourd'hui, nous aimerions vous montrer une procédure permettant de fabriquer des matrices extensibles pour mesurer la contraction cellulaire.

Nous utilisons ces procédures dans notre laboratoire pour étudier les réseaux contractiles d’actine et de myosine. Commençons donc. Avant l’activation des lamelles, placez plusieurs lamelles de 22 par 40 millimètres, numéro 1,5, préalablement.

Rincez avec de l'éthanol à 70 % dans un support en acier inoxydable de manière à ce que les lamelles soient espacées et ne se touchent pas. En travaillant sous une hotte chimique, préparez une solution de triméth à 2 % dans l'isopropanol à l'intérieur d'un récipient carré en verre. Utilisez une pipette en verre type spaghetti pour ajouter le trois ou mineur de profil.

Triméthoxy en raison de sa réactivité avec le plastique, immergez complètement les lamelles dans cette solution et incubez pendant 10 minutes sous agitation sur un agitateur magnétique dans la hotte aspirante. Après l'immersion des lamelles, lavez-les en les plongeant dans de l'eau doublement distillée. Renouvelez l'eau quatre fois après le dernier renouvellement.

Laisser tremper pendant 10 minutes en agitant. Ensuite, sécher les lamelles dans une étuve à environ 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois sèches, les laisser refroidir à température ambiante.

Immerger les lamelles dans une solution de 1 % de glutaraldéhyde dans de l’eau doublement distillée. Placer dans un récipient carré en verre sur une plaque agitatrice pendant 30 minutes. Veiller à utiliser un récipient propre.

Sinon, la solution pourrait devenir trouble par la suite. Laver les lamelles par trois changements d'eau doublement distillée, pendant 10 minutes par changement, sous agitation. Ensuite, recouvrir les lamelles de papier d'aluminium pour éviter la poussière et les faire sécher à température ambiante.

Une fois secs, conserver les lamelles dans un endroit sec et à l’abri de la poussière pendant jusqu’à deux mois. Pour préparer le gel de polyacrylamide ou PAA, préparer d’abord des solutions mères d’acrylamide-bis. Mélanger l’acrylamide à 40 % et le bis-acrylamide à 2 % comme décrit dans le protocole RI.

Dégazer la solution d'acrylamide dans une chambre à vide pendant 20 minutes. Cette étape réduit l'oxygène présent dans le gel, ce qui empêche la polymérisation. Pendant ce temps, préparer une solution de persulfate d'ammonium à 10 % ou une solution de PS.

Ensuite, essuyez des lames de microscope en verre de une par trois pouces avec des lingettes Rain X afin de rendre la surface de la lame hydrophobe. Éliminez toute poussière à l’aide d’un chiffon Kim pour garantir une surface de gel lisse. Recouvrez la lame de papier d’aluminium et mettez-la de côté.

Ensuite, retirez la solution d'acrylamide de la chambre à vide et ajoutez des billes fluorescentes. Pour initier la polymérisation du gel, ajoutez 0,75 microlitre de TM E et 2,5 microlitres de PS à 10 %. Mélangez brièvement la solution en aspirant et en expulsant plusieurs fois à l’aide d’une pipette. Ensuite, appliquez de 10 à 12 microlitres de la solution d'acrylamide sur la lame d'objectif hydrophobe préparée précédemment.

Placer une lame couvre-objet activée de 22 sur 40 millimètres au-dessus de la goutte. La solution de gel doit recouvrir entièrement la lame couvre-objet. Lisser toute bulle pouvant apparaître dans la solution.

Laisser polymériser la solution de gel à température ambiante pendant environ 10 minutes. Une fois la polymérisation terminée, le gel se détachera du bord de la lame de couverture. À l’aide de la pointe fine d’une pince, retirer délicatement la lame de couverture de la surface de la lame porteuse en gardant le gel attaché.

Immergez le gel dans une boîte de Pétri contenant de l'eau doublement distillée afin de maintenir une surface de gel hydratée pour réticuler la protéine de la matrice extracellulaire ou ECM au gel. Préparez tout d'abord des aliquotes de travail de 40 microlitres de sulfur san par en dissolvant la poudre de SULF san par dans du diméthylsulfoxyde anhydre ou DMSO. Ensuite, retirez l'eau doublement distillée de la surface du gel en utilisant brièvement notre centrifugeuse à lamelles.

Veiller à ne pas sécher le gel immédiatement avant utilisation. Diluer les aliquotes de sampa de soufre dans du DMSO avec de l'eau doublement distillée et recouvrir le centre de la surface du gel d'environ 200 microlitres. Ensuite, exposer la surface du gel à la lumière UV dans un four à réticulateur UV.

Après l'exposition aux UV, plongez les lamelles dans un bécher contenant de l'eau doublement distillée fraîche. Éliminez tout excès de solution de la surface du gel à l'aide d'un essoreur à lamelles. Ensuite, placez le param dans une boîte de Pétri et déposez 50 microlitres de fibronectine froide sur le param.

Retournez la lamelle et placez le gel côté vers le haut sur la fibronectine. Laissez les lamelles réagir à température ambiante pendant une à deux heures ou à quatre degrés Celsius toute la nuit. Après incubation dans une hotte stérile pour culture tissulaire ventilée.

Placer les lamelles dans des boîtes de culture tissulaire de six centimètres contenant du PBS afin d'enduire les lamelles. Laver soigneusement les lamelles par plusieurs changements de PBS en conditions stériles après le lavage. Stériliser les lamelles par traitement UV pendant 30 minutes.

Ensuite, incuber les lamelles dans le milieu cellulaire pendant 30 à 45 minutes avant de semer les cellules. Ensuite, placer une lamelle de 22 sur 30 millimètres sur le support supérieur de lamelle d'une chambre d'imagerie confocale Warner Instruments en utilisant de la graisse à vide pour maintenir la lamelle en place. Placer un joint en caoutchouc formant la chambre par-dessus la lamelle, en laissant l'accès libre aux tubulures en polyéthylène d'entrée et de sortie.

Cela permettra un espacement de 150 à 1000 micromètres entre la lame supérieure et la lame de 22 sur 40 millimètres recouverte de gel, selon la taille du joint utilisé. Ensuite, charger des seringues contenant du milieu cellulaire tiède sur les tubulures d'entrée à l’aide du kit de raccordement, puis vérifier que le milieu circule à travers les tubulures et atteint la lame supérieure. Appliquer de la graisse à vide sur la base de la chambre et placer une lame de 22 sur 40 millimètres recouverte de gel, côté cellules vers le haut.

Appliquez le milieu tiède sur les cellules. Placez le support supérieur de lame couvre-objet sur la base de la chambre, en veillant à ce que les joints de la chambre soient interposés entre celle-ci et la lame couvre-objet revêtue de gel. Assurez-vous que les broches de positionnement situées dans la base de la chambre s'insèrent correctement dans les trous de positionnement du support supérieur de lame couvre-objet.

Appliquez la plaque de pression sur la base de la chambre et utilisez la clé de plaque de pression pour visser et fixer fermement la plaque de pression. Vérifiez l'écoulement du milieu à travers le tube et la chambre afin de surveiller d'éventuelles fuites dans la chambre. Et pour éliminer toute zone sans milieu à la surface des cellules.

Appliquer la chambre d'imagerie confocale à l'adaptateur de plateau situé dans un support de microscope pour l'imagerie, sur un microscope confocal à fluorescence, de la protéine marquée par fluorescence et des billes fluorescentes intégrées dans le substrat gel. Cela permet d'obtenir une image de la position des billes non déformées dans le gel perfusé. Détacher les adhésions cellulaires du gel et acquérir une image des billes fluorescentes dans le même champ d'imagerie où les cellules sont présentes. Lorsque le protocole est suivi correctement, la surface du gel sera relativement plane et lisse, avec des billes fluorescentes uniformément réparties dans tout le gel.

La MEC peut également être visualisée par immunofluorescence de la fibronectine. Si l'on mesure la contraction du gel au niveau des adhésions focales, l'imagerie du gel et des cellules doit être réalisée dans le plan optique confocal des adhésions focales. Ici, les adhésions focales sont visualisées lors d'une expérience de force d'attraction dans une cellule d'ostéosarcome humain ou cellule U2 OS marquée par GFP pxi.

La contraction d'un gel peut être visualisée par le déplacement de billes fluorescentes intégrées sous les adhésions focales. La comparaison des billes soumises à une contrainte, en vert, et des positions des billes non soumises à une contrainte, en rouge, permet de quantifier le déplacement du substrat de gel lors de la contraction. Voici un résultat représentatif d'une cellule étalée qui se détache de la surface du gel par la trypsine. Voici un résultat représentatif lors de la comparaison des positions des billes soumises et non soumises à une contrainte.

L'utilisation d'algorithmes de calcul sophistiqués permet d'obtenir les contraintes de traction associées au déplacement des billes ainsi que le module d'élasticité des gels. Ces contraintes sont visualisées ici à l'aide d'une carte en échelle de chaleur et de vecteurs, où les couleurs plus chaudes sur la carte thermique et les flèches plus grandes indiquent des forces plus intenses. Nous venons de vous montrer comment préparer des matrices souples permettant de mesurer la contraction cellulaire lors de cette procédure.

Il est important de planifier à l'avance afin que les étapes sensibles au temps puissent être réalisées rapidement. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.