Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

L’objectif global de cette procédure est de créer des matrices conformes pour moduler et quantifier la contraction cellulaire. Ceci est accompli en activant d’abord une lamelle de recouvrement pour permettre l’ancrage de la matrice. La deuxième étape de la procédure consiste à polymériser un gel de polyacrylamide sur la lamelle activée.

La troisième étape de la procédure consiste à déposer des cellules sur le gel et à leur permettre d’adhérer. La dernière étape de la procédure consiste à imager le gel pour générer des données à analyser par des protocoles de microscopie à force de traction. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent que les cellules appliquent des forces de traction à leur matrice grâce à la microscopie à force de traction.

Bonjour, je m’appelle Yvonne Eons et je travaille dans le laboratoire de Margaret ELL au Département de physique et à l’Institut de dynamique biophysique de l’Université de Chicago. Je m’appelle Steven Winter, et je travaille également au laboratoire de la Garde. Aujourd’hui, nous aimerions vous montrer une procédure de fabrication de matrices conformes pour mesurer la contraction cellulaire.

Nous utilisons ces procédures dans notre laboratoire pour étudier les réseaux contractiles d’actine mycine. Alors commençons. Avant l’activation de la lamelle, placez plusieurs lamelles de protection de 22 x 40 millimètres numéro 1,5 auparavant.

Rincer à l’éthanol à 70 % dans une grille en acier inoxydable de sorte que les lamelles soient espacées et ne se touchent pas. En travaillant dans une hotte chimique, préparez une solution de trimeth à 2 % ou à profil mineur dans de l’isopropanol à l’intérieur d’un plat en verre carré. À l’aide d’une pipette à pâtes en verre, ajoutez le profil à trois ou minoro.

Trimeth oxy : en raison de sa réactivité avec le plastique, immerger complètement le couvercle se glisse dans cette solution et incuber pendant 10 minutes en remuant sur une plaque d’agitation dans la hotte. Après avoir trempé les lamelles, lavez-les en les plongeant dans de l’eau double distillée. Remplacez l’eau quatre fois après l’échange final.

Prévoyez 10 minutes de trempage en remuant. Ensuite, séchez les lamelles dans un incubateur à environ 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Une fois secs, laissez-les refroidir à température ambiante.

Immergez les lamelles dans une solution de glutaraldéhyde à 1 % dans de l’eau doublement distillée. Dans un plat carré en verre sur une plaque à mélanger pendant 30 minutes. Assurez-vous d’utiliser un plat propre.

Sinon, la solution peut apparaître trouble par la suite. Lavez les lamelles à l’aide de trois alternances d’eau bi-distillée pendant 10 minutes par échange en remuant. Ensuite, couvrez les lamelles avec du papier d’aluminium pour éviter la poussière et séchez-les à température ambiante.

Une fois sec, stockez, la housse se glisse dans un endroit sec à l’abri de la poussière jusqu’à deux mois. Pour préparer le gel de polyacrylamide ou de PAA, préparez d’abord des solutions mères d’acrylamide bis. Mélange d’acrylamide à partir de 40 % d’acrylamide et de 2 % d’acrylamide bis, comme décrit dans le protocole RI.

DGA la solution d’acrylamide dans une chambre à vide pendant 20 minutes. Cela réduit l’oxygène à l’intérieur du gel, ce qui empêche la polymérisation. Pendant ce temps, préparez une solution de sulfate à 10 % d’ammonium ou de PS.

Essuyez ensuite les lames de verre de microscope d’un pouce sur trois pouces avec des lingettes de pluie X pour rendre la surface de la lame de verre hydrophobe. Enlevez toute poussière avec une lingette Kim pour assurer une surface de gel lisse. Couvrir la diapositive de papier d’aluminium et réserver.

Retirez ensuite la solution d’acrylamide de la chambre à vide et ajoutez des billes fluorescentes. Pour initier la polymérisation du gel, ajoutez 0,75 microlitre de TM E et 2,5 microlitres de 10 % de PS. Mélangez brièvement la solution en pipetant de haut en bas. Ensuite, appliquez 10 à 12 microlitres de la solution d’acrylamide sur la lame de microscope hydrophobe préalablement préparée.

Placez une lamelle activée de 22 x 40 millimètres sur la gouttelette. La solution de gel doit recouvrir toute la lamelle. Lissez les bulles qui peuvent apparaître dans la solution.

Laisser la solution de gel polymériser à température ambiante pendant environ 10 minutes. Une fois polymérisé, le gel se détachera du bord de la lamelle. À l’aide de la pointe fine d’une pince à épiler, retirez soigneusement la lamelle de la surface de la lame de microscope avec le gel attaché.

Immergez le gel dans une boîte de Pétri contenant de l’eau distillée deux fois Pour maintenir une surface de gel hydratée afin de relier la matrice extracellulaire ou la protéine ECM au gel. Tout d’abord, préparez des aliquotes de travail de 40 microlitres de soufre san par en dissolvant la poudre SULF san par dans de l’oxyde de diméthylsulf anhydre ou DMSO. Ensuite, retirez l’eau double distillée de la surface du gel en utilisant brièvement notre essoreuse à lamelle.

En prenant soin de ne pas sécher le gel immédiatement avant utilisation. Diluez les aliquotes de soufre sampa DMSO dans de l’eau distillée deux fois et enduisez le centre de la surface du gel d’environ 200 microlitres. Ensuite, exposez la surface du gel à la lumière UV dans un four de réticulation UV.

Après l’exposition aux UV, trempez les lamelles de couverture dans un bécher avec de l’eau fraîche double distillée. Retirez toute solution de la surface du gel à l’aide d’une toupie à lamelle. Ensuite, placez param dans un récipient de boîte de Pétri près d’un animal de compagnie 50 microlitres de fibronectine froide sur le param.

Inversez la lamelle et placez le côté gel sur la fibronectine. Laissez les lamelles agir à température ambiante pendant une à deux heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation dans une hotte ventilée de culture de tissus stériles.

Placez les lamelles dans des boîtes de culture tissulaire de six centimètres contenant du PBS pour enrober les lamelles. Lavez abondamment les lamelles avec plusieurs remplacements de PBS dans des conditions stériles après le lavage. Stérilisez les lamelles par traitement UV pendant 30 minutes.

Ensuite, incubez les lamelles dans un milieu cellulaire pendant 30 à 45 minutes avant de plaquer les cellules. Chargeur suivant, le couvercle de 22 x 30 millimètres se glisse sur le support de couvercle supérieur d’une chambre d’imagerie confocale Warner Instruments à l’aide de graisse sous vide pour maintenir le couvercle en place. Placez un joint en caoutchouc formant une chambre sur le dessus de la lamelle, permettant d’accéder aux tubes en polyéthylène d’entrée et de sortie.

Cela permettra un espacement de 150 à 1000 microns entre la lamelle supérieure et la lamelle de 22 x 40 millimètres enduite de gel selon la taille du joint utilisé. Chargez ensuite les seringues contenant des fluides à cellules chaudes sur le tube d’entrée via le kit de connecteur, et vérifiez que le fluide s’écoule à travers le tube et sur la glissière du couvercle supérieur. Appliquez de la graisse sous vide sur la base de la chambre et chargez un couvercle enduit de gel de 22 x 40 millimètres, côté cellule vers le haut.

Appliquez le média chaud sur les cellules. Placez le support de capot supérieur sur la base de la chambre avec les joints de chambre qui le séparent de la lamelle revêtue de gel. Assurez-vous que les goupilles de positionnement à l’intérieur de la base de la chambre se trouvent dans les trous de positionnement du capot supérieur.

Appliquez la plaque de pression sur la base de la chambre et utilisez la clé à plaque de pression pour visser et fixer la plaque de pression. Vérifiez le débit du fluide à travers le tube et la chambre pour surveiller toute fuite potentielle à l’intérieur de la chambre. Et pour éliminer toutes les zones exemptes de fluide à la surface de la cellule.

Appliquez la chambre d’imagerie confocale sur l’adaptateur de platine situé à l’intérieur d’un support de microscope pour l’imagerie d’image, de protéines marquées par fluorescence et de billes fluorescentes intégrées dans le substrat de gel sur un microscope fluorescent confocal pour obtenir une image de la position non contrainte de la bille dans la perfusion de gel. Des voyages permettent de détacher les adhérences cellulaires du gel et de prendre une image des billes fluorescentes dans le même champ d’imagerie où les caves sont osées. Lorsque le protocole est suivi correctement, la surface du gel sera relativement plate et lisse avec des billes fluorescentes incrustées uniformément partout.

L’ECM peut également être visualisée par immunofluorescence de la fibronectine. Si l’on mesure la contraction du gel à l’emplacement des adhérences focales, l’imagerie du gel et des cellules doit être effectuée au niveau du plan optique confocal des adhérences focales. Ici, les adhérences focales sont visualisées dans une expérience de force d’attraction dans un ostéosarcome humain ou une cellule U2 OS marquée par GFP pxi.

La contraction d’un gel peut être visualisée par le déplacement de billes fluorescentes intégrées Adhérences focales sous-jacentes. La comparaison des billes tendues en vert et des positions des billes non contraintes en rouge permet de quantifier le déplacement du substrat de gel sous contraction : ici, il s’agit d’un résultat représentatif d’une cellule étalée qui se détache de la surface du gel par la trypsine. Voici un résultat représentatif lorsque l’on compare les positions des talons déformés et non contraints.

L’utilisation d’algorithmes de calcul sophistiqués peut produire des contraintes de traction associées au déplacement du talon et au module d’élasticité des gels. Ces contraintes sont visualisées ici à l’aide d’une carte d’échelle thermique et de vecteurs où les couleurs plus chaudes sur la carte thermique et les flèches plus grandes indiquent des forces plus fortes. Nous venons de vous montrer comment créer des matrices conformes pour mesurer la contraction cellulaire lors de cette procédure.

Il est important de planifier à l’avance afin que les étapes urgentes puissent être effectuées rapidement. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.