Production d'extrait d'embryon de poulet pour la culture des neurones murins Cellules souches Crest
27 novembre 2010
Pour cultiver des cellules souches neurales de crête (NCSC) in vitro, un milieu spécial (NCSCM) est nécessaire. Partie essentielle de NCSCM est extrait d'embryon de poulet (PECO). Nous décrivons ici les techniques précises pour produire une quantité maximisée de qualité pure et de haute PECO, y compris des détails comme l'isolement, la macération, la centrifugation et la filtration.
Bonjour, je m'appelle Annaa du laboratoire du professeur Ika Egar, du Département d'oncologie pédiatrique de l'Hôpital universitaire pour enfants d'Esen, en Allemagne. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de préparer des extraits de poussins embryonnaires prénatals âgés de 11 jours. Placez le DMEM sur de la glace pour le refroidir à au moins quatre degrés Celsius.
Nous utilisons du DMEM contenant du glutamate provenant de GIBco, préparé dans des tubes stériles remplis à moitié. Avec le MEM, lavez les œufs à l'éthanol à 70 %, utilisez X qui ont été incubés pendant 11 jours à 100 degrés Fahrenheit dans un incubateur humidifié. Veillez à laisser l'éthanol s'absorber pendant au moins 30 secondes.
Après avoir appliqué soigneusement, séchez les œufs avec des essuie-tout doux. Nettoyez une plaque en plastique ou en verre avec de l'éthanol. Ouvrez les œufs.
Placer délicatement l'embryon dans la plaque. Ne pas endommager l'EC ni les petits vaisseaux. Utiliser des pinces de précision propres et aiguisées pour disséquer les embryons.
Tout d'abord, recherchez le cordon ombilical. Encore une fois, ne détruisez pas le YAC ni les petits vaisseaux lors de la recherche du cordon ombilical. Une fois que vous avez trouvé le cordon ombilical, suivez-le jusqu'à son origine et effectuez-en la dissection.
Après avoir ouvert l'emballage transparent au-dessus de l'embryon, retirer soigneusement l'embryon du CE sans le détériorer. Placer les embryons dans un milieu essentiel minimum stérile sur de la glace. Nous utilisons le DMEM contenant du glutamate provenant de gyp Co. Retirer le piston d'une seringue stérile de 60 millilitres.
Placer environ 10 embryons à la fois dans la seringue. Insérer le piston dans la seringue. Faire maturer les embryons en enfonçant le piston.
Veillez à ne pas appliquer une pression excessive, sinon vous perdrez le matériel maturé. Ramassez les embryons maturnés dans les tubes préparés au ratio d'un embryon maturné pour dix embryons MEM. Cela devrait produire environ 25 millilitres de volume.
Agiter le mélange de rapport d'un-à-un d'embryons avec du milieu EMEM pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer soigneusement le mélange dans des tubes de centrifugation. Ajouter les jours d'hyaluronidase rile.
Nous utilisons les jours R Hay provenant de testicules de Boin de Sigma. Déchirez les tubes de centrifugeuse avec une balance de précision AC spéciale. Il est très important de prendre en compte les trois chiffres après la virgule.
Ils doivent être égaux. Sinon, vous risquez d'avoir des problèmes avec la centrifugeuse en raison de la haute vitesse nécessaire pour centrifuger le mélange. Si nécessaire, corrigez les différences en pipetant la quantité manquante de MEM. Le rotor aurait dû être placé dans un réfrigérateur ou une chambre froide pendant la nuit afin de le refroidir à quatre degrés Celsius.
Les tubes de centrifugation doivent être fermés très hermétiquement. Sinon, vous risquez d'avoir des problèmes pour les sortir du rotor. Après la centrifugation, remplissez le rotor avec les tubes et fermez-le très hermétiquement à l'avance.
Refroidir la centrifugeuse à quatre degrés Celsius. Utiliser le vide dans tous les cas. Attendre que le rotor ait atteint sa vitesse finale.
Si quelque chose d'anormal se produit, arrêtez immédiatement la centrifugeuse. Appuyez sur le bouton de frein pour interrompre la centrifugation. Ceci intervient après qu'un rotor TI I 45 ait tourné pendant six heures à une vitesse de 45 000 tours par minute.
Retirez soigneusement les tubes. Ne les agitez surtout pas, car cela pourrait entraîner une augmentation de la couche liquide supérieure trouble à l'intérieur des tubes. Observez les trois phases.
En haut, on trouve un liquide de densité inférieure contenant des morceaux gras. Au milieu, il y a un liquide clair, et au fond on peut observer le culot. Soyez très prudent pour prélever la phase claire située au milieu du tube.
Ne touchez en aucun cas le culot, car cela entraînerait une contamination de l'extrait ainsi qu'un colmatage du système de filtration. Dans un premier temps, utilisez un filtre de 0,45 micromètre relié à une pompe à vide. Dans une deuxième étape, filtrez le liquide obtenu à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre, également relié à la pompe à vide, puis transférez l’extrait dans des tubes.
Enfin, conserver les tubes à moins 80 degrés Celsius.
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Aperçu
Cet article présente une procédure détaillée pour préparer un extrait d'embryon de poulet (CEE) à partir de poussins embryonnaires prénatals âgés de 11 jours, essentiel à la culture in vitro des cellules souches de la crête neurale (CSCN). Le processus comprend des techniques spécifiques d'isolement, de macération, de centrifugation et de filtration afin d'optimiser le rendement d'un CEE de haute qualité.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie des cellules souches
- Biologie du développement
Contexte
- Les cellules souches de la crête neurale (NCSC) sont cruciales pour divers processus de développement.
- L'extrait d'embryon de poulet (CEE) constitue une composante essentielle du milieu de culture pour les NCSC.
- Un CEE de haute qualité est nécessaire pour des études in vitro réussies.
- Des techniques normalisées pour la préparation du CEE sont essentielles afin d'assurer la reproductibilité.
Objectif de l'étude
- Décrire une méthode fiable pour produire un extrait d'embryon de poulet.
- Garantir que le processus d'extraction donne un EEP pur et de haute qualité.
- Faciliter la culture in vitro de cellules souches de la crête neurale.
Méthodes utilisées
- Préparation du DMEM et refroidissement à 4 degrés Celsius.
- Lavage des œufs avec de l'éthanol à 70 % pour stérilisation.
- Incubation des œufs à 100 degrés Fahrenheit dans un environnement humidifié.
- Isolation, macération, centrifugation et filtration de l'extrait d'embryon.
Résultats principaux
- Extraction réussie d'extrait d'embryon de poulet à partir d'embryons âgés de 11 jours.
- Production maximisée d'extrait d'embryon de poulet de haute qualité, adapté à la culture des CNE.
- Des étapes procédurales détaillées améliorent la reproductibilité dans les laboratoires.
- Mise en place d'un protocole fiable pour les recherches futures.
Conclusions
- Les méthodes décrites fournissent un cadre solide pour la préparation du CEE.
- Un CEE de haute qualité est essentiel pour faire progresser la recherche sur les NCSC.
- Des techniques standardisées peuvent améliorer les résultats expérimentaux en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'extrait d'embryon de poulet (CEE) est un réactif essentiel pour la culture in vitro des cellules souches de la crête neurale (CSN), soutenant la validation précoce des cibles en neurosciences et en biologie du développement. Une production fiable de CEE permet une culture reproductible des CSN, ce qui est crucial pour l'atténuation mécanistique des hypothèses thérapeutiques impliquant des lignées dérivées de la crête neurale. Ce protocole fournit une méthode standardisée pour produire un CEE de haute qualité, renforçant la fiabilité prédictive des modèles précliniques et réduisant la variabilité biologique dans les flux de travail de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation des voies de différenciation des cellules souches de la crête neurale en neurones, cellules gliales, muscle lisse et mélanocytes pour des tests d'hypothèses ciblées.
- Valeur opérationnelle : Fournit un microenvironnement défini et biologiquement pertinent qui permet la validation fonctionnelle de la puissance et de l'engagement lignagique des CSCN.
- Valeur prédictive : Réduit l'ambiguïté mécanistique lors de la validation précoce des cibles en utilisant une source de facteurs de croissance physiologiquement pertinente dérivée de tissu embryonnaire.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit un extrait filtré constant, dépourvu de débris cellulaires et de contaminants, permettant un criblage fiable de composés dans des tests basés sur les NCSC.
- Valeur opérationnelle : Des étapes de centrifugation et de filtration standardisées assurent une reproductibilité d’un lot à l’autre, essentielle à la normalisation des tests au sein des équipes de découverte.
- Extensibilité : Le protocole permet d’obtenir environ 25 mL d’ECE par 10 embryons, ce qui permet une préparation à échelle moyenne destinée à une utilisation expérimentale répétée.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Soutient la modélisation préclinique des pathologies dérivées de la crête neurale en fournissant un système de culture défini permettant la différenciation des cellules souches de la crête neurale en cartilage, en os et en neurones autonomes.
- Avancement ajusté au risque : La CEE de haute qualité réduit les taux d'échec de la culture, renforçant ainsi la fiabilité des données précliniques utilisées pour les décisions d'aller/arrêt.
- Réduction du risque mécanistique : Permet l'étude des mécanismes de maladie médiés par les cellules souches de la crête neurale dans un système reproductible, renforçant la confiance dans la cible avant les études permettant l'AMM.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La production de CEE s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, soutenant la validation des cibles grâce à la culture de NCSC prêts à l'essai et permettant des criblages ultérieurs ainsi que des études mécanistiques dans les domaines thérapeutiques liés à la crête neurale.
- Découverte en biologie : Facilite la vérification d'hypothèses sur la multipotence et la spécification des lignées des CSCN à l'aide d'un supplément de culture défini, dérivé d'embryons.
- Écrantage : Génère un extrait normalisé, sans cellules, adapté à l'écrantage à haut débit de modulateurs affectant la survie, la prolifération ou la différenciation des CSCN.
- Analytique : Permet des mesures quantitatives telles que l'expression de marqueurs (p75, SOX10) et des tests fonctionnels grâce à une variabilité de fond réduite due à l'extrait purifié.
- Recherche translationnelle : Relie les modèles de CSCN en phase de découverte à la validation préclinique en favorisant la différenciation vers des lignées cliniquement pertinentes telles que les muscles lisses et les neurones.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un processus de production de réactifs réutilisables pouvant être intégré aux plateformes de cellules souches pour assurer un approvisionnement constant entre les projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la validation des cibles en réduisant le bruit biologique dans les systèmes de culture de NCSC.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à une isolation standardisée, une macération, une centrifugation à 45 000 tr/min pendant 6 heures et une filtration séquentielle de 0,45 µm puis de 0,22 µm.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en minimisant les échecs de culture et en permettant la génération de données fiables pour les décisions précoces sur le portefeuille.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des programmes ciblant la crête neurale en fournissant une plateforme fiable pour les études mécanistiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation aseptique des embryons et en technique stérile afin de prévenir toute contamination durant l'isolement et la macération.
- Dépend de l'accès à une ultracentrifugeuse réfrigérée capable de 45 000 tr/min et d'un contrôle de température à 4 °C.
- Implique une filtration standardisée assistée par vide, utilisant d'abord un filtre de 0,45 µm, puis un filtre de 0,22 µm, afin d'assurer la clarté et la stérilité de l'extrait.
- Exige un équilibrage volumétrique précis lors de la centrifugation afin de maintenir la stabilité du rotor à haute vitesse.
- Limité par la disponibilité des embryons et la nécessité d'une incubation calibrée à 100 °F pour obtenir des embryons âgés de 11 jours.
