Suivi de la dynamique d’infection bactérienne chez une souris à l’aide de la bioluminescence

Commencer par une suspension d’une souche atténuée d’une bactérie pathogène.

La souche atténuée présente une pathogénicité réduite en raison de délétions ciblées dans les gènes de virulence.

Les bactéries sont marquées chromosomiquement avec un opéron bioluminescent qui permet une production autonome de lumière.

Les bactéries expriment l’opéron bioluminescent, produisant une enzyme luciférase et un complexe enzymatique qui synthétise le substrat de la luciférase.

La luciférase oxyde le substrat pour produire de la lumière visible.

Centrifugez la suspension et jetez le surnageant.

Lavez les cellules avec un tampon, centrifugez-les à nouveau et jetez le surnageant pour éliminer les composants non cellulaires résiduels.

Remettez les cellules en suspension dans le tampon pour obtenir une concentration bactérienne optimale et aspirez la suspension dans une seringue.

Injectez la suspension par voie intrapéritonéale dans une souris, puis transférez-la dans une cage.

Visualisez le signal bioluminescent à intervalles réguliers.

La souche atténuée reste localisée et la bioluminescence diminue progressivement, indiquant l’élimination de l’infection.

Le matin des injections, décongelez les cryoflacons de cellules bactériennes à quatre degrés Celsius pendant trois à quatre heures. Gardez les flacons sur de la glace après la décongélation et injectez les souris dans les deux heures. Transférez le contenu de chaque flacon cryogénique dans un nouveau tube de deux millilitres et centrifugez-le à 4 500 fois G pendant 10 minutes.

Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS. Répétez la centrifugation et remettez en suspension les cellules dans le PBS jusqu’à une concentration finale de 2,5 fois 10 à la neuvième colonie formant des unités par millilitre. Prélever trois échantillons de la suspension finale de chaque souche pour valider la concentration, le génotype et le phénotype.

Pour chaque souche, aliquote 1,5 millilitre de suspension cellulaire dans un tube de deux millilitres et préparer le PBS pour les injections de contrôle. Rassemblez les souris et le matériel nécessaire aux injections dans une salle d’opération stérile pour animaux et essuyez toutes les surfaces avec des lingettes désinfectantes avant de commencer. Portez deux paires de gants en latex pour limiter le risque de perforation en cas de morsure, ainsi qu’une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et un masque facial.

Retirez la souris de la cage et pesez-la, en marquant la queue avec un marqueur permanent pour le suivi post-injection. Ouvrez une nouvelle seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 27 et prélevez 200 microlitres de PBS stérile. Saisissez la souris derrière ses oreilles, à l’aide du pouce et de l’index, et pincez pour créer un pli cutané au niveau de la nuque.

Ensuite, fixez la queue dans la paume à l’aide du petit doigt pour maintenir la souris à plat et immobile. Insérez l’aiguille à un angle de 30 degrés dans la cavité péritonéale à gauche ou à droite de la ligne médiane. Soulevez légèrement l’aiguille pour vous assurer qu’elle n’a pas été insérée dans les organes.

Ensuite, injectez lentement le PBS et retirez l’aiguille. Un bolus au site d’injection est typique. Placez l’aiguille dans le récipient d’élimination des objets tranchants désigné et déplacez la souris dans une cage séparée.

Répétez la procédure avec la souris suivante et, après avoir injecté toutes les souris d’une cage, ramenez-les dans leur cage d’origine. Après avoir injecté le groupe témoin, injectez les groupes de test en utilisant la même procédure. Une fois toutes les injections terminées, retournez les souris dans la salle d’hébergement et nettoyez la zone de travail avec des lingettes désinfectantes.

Réglez le débit d’oxygène à 1,5 litre par minute et l’isoflurane à 3,5 % et déplacez la souris dans la chambre d’anesthésie, puis dans la phase de stabilisation de la température, après l’anesthésie. Positionnez la souris sur le dos, les bras tendus, et ajustez un cône nasal pour l’administration d’isoflurane à 2,5 % pendant l’imagerie.

Fermez la porte et prenez des images bioluminescentes et des radiographies de la souris. Une fois l’imagerie terminée, remettez la souris dans sa cage et surveillez-la. Il devrait reprendre conscience dans les trois à cinq minutes.