Quantification de l’alginate bactérien à l’aide d’un dosage immuno-enzymatique à base d’anticorps

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Microbiologie

0 vues • 3:20 min • September 26th, 2025

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Prenez une microplaque avec un échantillon contenant de l’alginate, un exopolysaccharide protecteur produit par la bactérie Pseudomonas aeruginosa.

Préparer une dilution en série d’un étalon dérivé d’un alginate pour quantifier la concentration d’alginate dans l’échantillon.

Ajouter un tampon de revêtement et incuber pour faciliter l’adhérence des molécules à la surface du puits.

Laver pour éliminer les molécules non liées.

Incuber avec un agent bloquant pour masquer les sites de liaison non spécifiques.

Lavage, puis incubation avec des anticorps primaires spécifiques à l’alginate.

Laver à nouveau, puis incuber avec des anticorps secondaires conjugués à des enzymes qui ciblent les anticorps primaires.

Laver puis incuber avec un substrat chromogène, que l’enzyme oxyde pour produire un produit coloré.

Ajoutez une solution acide qui arrête la réaction et améliore la couleur pour permettre la détection colorimétrique.

À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’intensité de la couleur.

Créez une courbe standard à partir des intensités des dilutions standard et tracez l’intensité de l’échantillon pour déterminer la concentration en alginate.

À l’aide d’une micropipette, ajoutez 50 microlitres de l’échantillon prélevé dans une plaque non traitée de 96 puits.

Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon de revêtement ELISA dans les puits. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À l’aide d’une bouteille à eau, lavez les puits de l’assiette deux fois avec du PBS-T en remplissant les puits, puis en les égouttant en retournant l’assiette.

Ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage dans les puits à l’aide d’une micropipette et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez la plaque deux fois avec du PBS-T comme précédemment. Ajoutez ensuite 100 microlitres d’anticorps primaires dilués dans les puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures.

Après l’incubation, laver les puits de la plaque trois fois avec du PBS-T comme précédemment. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans les puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Après avoir lavé à nouveau la plaque trois fois, à l’aide d’une micropipette, ajoutez 100 microlitres de solution ELISA TMB.

Incuber l’assiette à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité en plaçant l’assiette dans un tiroir ou en l’enveloppant dans du papier d’aluminium. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution d’arrêt. Utilisez un lecteur de plaques pour mesurer le diamètre extérieur à 450 nanomètres.

Produire une courbe standard en mesurant la DO450 des dilutions en série de concentrations connues d’acide d-mannuronique. Répétez les mesures deux fois et extrayez une équation linéaire. Calculez la concentration d’alginate dans chaque échantillon à l’aide de la courbe standard et divisez la concentration d’alginate de l’équation linéaire par DO600 pour obtenir la quantité totale d’alginate par DO600.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026