Encyclopédie des expériences JoVE
Microbiologie
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Prends C. Vers élégans cultivés sur des plaques d’agar riches en nutriments contenant de l’E. coli pour la condition témoin et Pseudomonas aeruginosa pour la condition pathogène.
Pendant l’incubation, les vers se nourrissent de bactéries qui colonisent la lumière intestinale.
Dans le témoin, l’épithélium intestinal reste intact, tandis que les toxines libérées par le pathogène causent des dommages épithéliaux.
Lavez les vers avec un tampon, puis transférez-les sur des plaques complétées par des traceurs fluorescents et des bactéries inactivées par la chaleur comme source de nourriture.
Dans le témoin, les traceurs fluorescents ingérés restent dans l’intestin, tandis que chez les vers infectés par l’agent pathogène, ils traversent l’épithélium endommagé et pénètrent dans la cavité corporelle.
Lavez à nouveau les vers et placez-les sur des assiettes fraîches. Ensuite, transférez-les sur une plaque multi-puits contenant un fixateur pour préserver la structure cellulaire.
Enlève le fixateur. Ensuite, ajoutez un support de montage pour l’imagerie.
Observez à l’aide d’un système d’imagerie à fluorescence.
Augmentation de la fluorescence dans la cavité corporelle de P. Les vers exposés à Aeruginosa indiquent une perméabilité intestinale induite par le pathogène.
Lavez les larves L4 synchronisées avec l’âge avec un tampon S, puis transférez environ 500 vers sur les plaques NGM contenant différentes bactéries et produits chimiques. Ensuite, couver les plaques à 20 degrés Celsius pendant 48 heures.
Préparez les plaques complétées en FITC-dextran en mélangeant 2 millilitres d’E inactivé à la chaleur. coli avec quatre milligrammes de FITC-dextran. Ajoutez 100 microlitres du mélange à chacune des 20 plaques d’agar NGM fraîches, puis laissez sécher les plaques pendant 1 heure sur un établi de laboratoire propre. Après 48 heures de traitement, lavez les vers avec du tampon S, transférez-les sur des plaques complétées en FITC-dextran et sur des plaques NGM sans FITC-dextran, puis incubez les plaques toute la nuit.
Le lendemain, lavez les vers avec du tampon en S et laissez-les glisser dans la plaque d’agar NGM fraîche pendant 1 heure. Ajoutez 50 microlitres de formaldéhyde à 4 % à chaque puits d’une plaque noire à fond plat à 96 puits et transférez environ 50 vers dans chaque puits. Après 1 à 2 minutes, retirez tout le formaldéhyde et ajoutez 100 microlitres de substrat de montage dans chaque puits.