Mesure de l'induction spontanée des phages dans des bactéries lysogènes au cours du temps

Prélevez une culture de bactérie lysogène effectuée pendant la nuit, dans laquelle la majorité des cellules contiennent de l'ADN phagique dormant intégré à leur génome.

Il l'incuber dans un milieu frais.

Certaines bactéries subissent une induction spontanée, entrant ainsi dans le cycle lytique, au cours duquel l'ADN phagique est excisé, répliqué et des protéines virales sont produites.

Les phages infectieux nouvellement assemblés sont libérés par lyse cellulaire.

Prélevez des échantillons de culture à des intervalles définis.

Pour dénombrer les lysogènes non induits viables, déposez des dilutions sériées de chaque échantillon sur une boîte de gélose et incubez.

Compter les colonies pour calculer les unités formant des colonies (UFC).

Pour dénombrer les phages infectieux, déposez les mêmes dilutions sur une boîte de gélose contenant un antibiotique préensemencée avec des cellules hôtes indicatrices résistantes à l'antibiotique. Étant donné que les lysogènes sont sensibles à l'antibiotique, seules les cellules hôtes résistantes peuvent croître.

Les phages infectent et lysent les cellules, formant des plaques claires.

Comptez les plaques pour calculer les unités formant des plaques (UFP). Un nombre d'UFP plus faible indique moins d'événements d'induction spontanée.

Tracer les UFC et les UPF en fonction du temps. Pendant la phase exponentielle précoce de la croissance bactérienne, les UPF sont minimales par rapport aux UFC, indiquant une induction spontanée des phages minimale.

Pour commencer, préparez des cultures fraîches de lysogène et d'hôte indicateur en inoculant les cultures prélevées de la nuit précédente dans 100 millilitres de LB selon un rapport de un pour 100. Incubez à 37 degrés Celsius avec agitation à 180 tr/min.

Pour surveiller la croissance du lysogène, prélève un échantillon d'un millilitre chaque heure à partir du moment de l'inoculation pendant huit heures. Dilue ensuite la culture en série en ajoutant 100 microlitres dans 900 microlitres de milieu LB. Vortexe à vitesse maximale, et poursuis la série de dilutions de 10 à la puissance moins un à 10 à la puissance moins neuf.

Déposez 10 microlitres de la dilution requise sur une boîte de gélose LB. Laissez sécher puis incubez à 30 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures. Après l'incubation, comptez le nombre de colonies et calculez le nombre de cellules bactériennes viables à l'aide de la formule fournie.

Ensuite, afin de dénombrer les particules de phage infectieuses dans l'échantillon temporel, ajoutez 100 microlitres de cellules hôtes indicatrices en phase logarithmique et résistantes à la rifampicine à l'agar supérieur fondu, en présence de rifampicine. Déposez 10 microlitres de la culture du lysogène diluée au fur et à mesure sur la couche d'agar supérieur inoculée. Laissez sécher, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures.

Après l'incubation, compter le nombre de plaques et calculer le nombre de particules phagiques infectieuses à l'aide de la formule fournie.