Fabrication d'un dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones

Bienvenue dans le laboratoire du Dr.Newly John. Le John Lab se spécialise dans l’ingénierie de plateformes microfluidiques pour des applications biologiques. Dans cette vidéo, nous allons démontrer la production et l’utilisation d’un dispositif microfluidique conçu pour le compartimentage et la culture des neurones primaires.

Le dispositif neuronal a été publié pour la première fois dans Nature Methods en août 2005. Depuis son introduction, le dispositif neuronal a été largement utilisé par des collaborateurs du monde entier. Le dispositif neuronal se compose d’un morceau de PDMS qui a été coulé sur une plaquette de silicium contenant un motif SUA du dispositif, qui a été précédemment créé par photolithographie.

L’appareil a trois caractéristiques principales, quatre réservoirs de huit millimètres de diamètre, deux canaux principaux de 1,5 millimètre de large chacun, sept millimètres de long et cent microns de haut et des micro-rainures, de 10 micromètres de large et trois micromètres de hauteur qui relient les deux canaux principaux. La longueur des micro-rainures peut varier de 150 microns à 900 microns, bien que la longueur standard du choix soit de 450 microns. En observant l’appareil de manière à ce que les canaux principaux et les micro-rainures soient verticaux, nous pouvons voir que les réservoirs à gauche des rainures sont reliés par les canaux principaux, tout comme les réservoirs à droite.

Cette caractéristique permet au liquide de s’écouler à travers le canal principal, ce qui est une caractéristique importante, permettant de charger les cellules et de changer de média. Le dispositif neuronal présente trois avantages majeurs par rapport aux plateformes de culture tissulaire traditionnelles. Premièrement, il permet la compartimentation des corps cellulaires ou soma et des axones. Avec le dispositif neuronal, il est possible d’obtenir des fractions axonales pures.

La taille et la longueur des micro-rainures permettent aux axones de passer à travers l’autre canal principal tout en empêchant les corps de scie de se croiser. Deuxièmement, en raison de la conception de l’appareil et en tirant parti de la pression hydrostatique, il est possible de soumettre soit le côté cellulaire et/ou le côté axone de l’appareil, à des traitements séparés simplement en maintenant le volume et les réservoirs plus élevés d’un côté de l’appareil par rapport à l’autre. Et troisièmement, la fraction axonale pure du dispositif peut être coupée par aspiration sous vide, ce qui permet au chercheur d’étudier et d’observer la régénération axonale.

La chercheuse Hina Lee va maintenant faire une démonstration de la préparation du dispositif de neurones microfluidiques. Une plaquette de silicium à trois Ang avec un motif réalisé en SU huit par photolithographie est utilisée pour couler le moule microfluidique poly diméthyl Sloane PDMS. Nous appelons la plaquette de silicium de modèle SUA des moules maîtres ou simplement des maîtres.

Le PDMS est mélangé avec un agent de durcissement à un rapport poids/poids de 10 pour un. C’est-à-dire, par exemple, 15 grammes de PDMS pour 1,5 gramme d’agent de durcissement. Le PDMS est ensuite bien mélangé et versé sur la plaquette de silicium.

La plaquette de silicium est contenue dans une boîte de Pétri en polystyrène de 10 centimètres. Il faut environ 12 à 15 grammes de PDMS pour couvrir les MA d’une épaisseur d’environ quatre millimètres. Le maître avec le PDMS est ensuite placé dans un dessiccation sous vide avec le couvercle retiré de la boîte de Pétri et le vide est appliqué.

Ceci est fait pour aider à éliminer les bulles d’air du PDMS qui ont été introduites lors de l’agitation de l’agent de durcissement. Il faut environ 15 minutes pour que les bulles d’air soient éliminées. Le maître avec PDMS est retiré de la dessiccation après 15 minutes dans la dessiccation sous vide.

Il reste encore quelques bulles sur le master PDMS. Un pistolet à air comprimé avec un filtre de 0,45 micron est utilisé pour éliminer les bulles restantes. Le maître est ensuite placé sur une plaque chauffante à 80 degrés pendant une heure pour durcir.

Si un dessiccation sous vide n’est pas disponible, le maître peut être laissé à température ambiante pendant plusieurs heures. Les bulles d’air finiront par se dissiper d’elles-mêmes. Si aucune plaque chauffante n’est disponible, le PDMS durcira à température ambiante après 24 heures.

Il est important de s’assurer que le maître est de niveau pendant le processus de durcissement. Une fois que le PDMS est durci sur le maître, il est amené dans une hotte propre à l’aide d’une lame chirurgicale. Un cercle coupé autour du périmètre des appareils est fait.

Il est important que lorsque l’on insère la lame dans le PDMS, il entre en contact avec la plaquette de silicium, mais qu’il ne mette pas trop de pression sur la plaquette, sinon le maître se fissurera avec un cercle coupé tout autour des appareils. Il y a quatre appareils pour chaque maître en silicium de trois pouces. Le PDMS est soigneusement retiré du maître.

Cela peut être commencé en tournant doucement la lame chirurgicale lorsqu’elle est insérée dans la coupe précédente. C’est vraiment mince avec les appareils PDMS sur le moule. Les réservoirs face vers le haut sont perforés dans l’appareil à l’aide d’un poinçon de biopsie tissulaire de huit millimètres.

Les débris laissés dans le poinçonneur sont poussés vers l’extérieur à l’aide d’une tige. Les appareils sont ensuite coupés en quartiers et l’excès de PDMS est coupé afin que l’appareil s’adapte parfaitement à un couvercle Corning. Le verre numéro un de taille 24 millimètres par 40 millimètres d’air azoté est utilisé pour souffler tout débris en excès.

Les débris tenaces peuvent également être enlevés à l’aide de ruban vinyle 3M Scotch Brand 4 7 1. Les appareils propres sont maintenant prêts pour le collage plasma. Un nettoyeur de plasma herrick est utilisé pour lier brièvement les dispositifs neuronaux aux lamelles de couverture.

Les appareils et les lamelles sont placés sur un plateau, puis le plateau sera placé dans le nettoyeur de plasma et une pompe à vide utilisée pour évacuer l’air de la chambre. Il est important de noter que les appareils PDMS sont placés face vers le haut. C’est-à-dire avec la conception face vers le haut afin qu’ils soient exposés au gaz plasma.

Une fois que la pression de vide a atteint 300, la puissance millitorr est mise sur bobine électrique et réglée sur élevée. Tout est fissuré sur la porte pour laisser entrer un peu d’air dans la chambre, ce qui aidera à générer le plasma. Les appareils et la vitre de protection sont traités au plasma pendant deux minutes.

Remarquez la couleur violette dans la chambre. C’est le plasma réel. La bobine électrique crée du plasma, qui est un gaz partiellement ionisé composé d’électrons, d’ions et d’atos ou de molécules neutres.

Le plasma crée des espèces réactives à la surface du verre et de l’appareil, qui, lorsqu’elles sont placées ensemble, forment une liaison permanente. Le plasma rend également la surface hydrophile, ce qui facilite l’ajout de liquides. Le nettoyeur de plasma stérilise également les appareils.

Après un traitement au plasma pendant deux minutes, l’alimentation dans le vide est coupée et l’air est conduit dans la chambre. Les services traités au plasma du verre et du dispositif microfluidique sont assemblés au contact l’un de l’autre dans un banc propre. Les appareils sont ensuite placés dans des boîtes stériles de 60 millimètres.

Les surfaces traitées au plasma du verre et de l’appareil forment une liaison étroite et irréversible. Dans les 10 minutes suivant la liaison plasma, l’appareil est au verre polyol lysine est ajouté à l’appareil. Après 10 minutes, l’hydrophilie de l’appareil diminuera.

Ce qui rend difficile l’entrée de la PLL dans l’appareil. Il est important de vérifier la présence de bulles d’air dans l’appareil après l’ajout de PLL. Une méthode simple pour éliminer les bulles d’air présentes consiste à utiliser une pipette P 200 remplie de 100 microlitres de liquide.

Dans ce cas, placez l’embout directement à l’ouverture du canal principal, puis appuyez avec force sur le P 200. Il peut être nécessaire de répéter cette opération plusieurs fois, mais la force de la pipette finira par chasser les bulles. Les appareils contenant des PLL sont autorisés à incuber pendant la nuit et un incubateur standard de culture tissulaire à 37 degrés avec 5 % de CO2.

Après 24 heures d’incubation avec PLL, les appareils sont rincés deux fois rapidement avec de l’eau désionisée en autoclave. Au cours de ce processus, le liquide n’est jamais entièrement éliminé des canaux principaux, mais uniquement des réservoirs. L’élimination du liquide des canaux principaux introduira des bulles.

Après deux rinçages rapides, les appareils sont à nouveau remplis d’eau déminéralisée de l’autoclave et remis dans l’incubateur pendant au moins trois heures ou toute la nuit. Le lendemain, après que les dispositifs aient été incubés avec de l’eau pendant la nuit ou pendant au moins trois heures, ils sont à nouveau introduits dans l’enceinte de biosécurité et rincés deux fois à l’eau déminéralisée. Ensuite, un milieu basal neural contenant les suppléments nécessaires, du B 27 et du glutamate pour la culture des neurones primaires du rat est ajouté aux dispositifs.

Les appareils sont ensuite remis dans l’incubateur pour une utilisation future. Les appareils sont maintenant prêts à accueillir des neurones. Dans cette vidéo, nous avons démontré la technique de la lithographie douce, que nous utilisons pour fabriquer nos dispositifs neuronaux.

Ces dispositifs peuvent être utilisés pour cultiver des neurones et d’autres types de cellules d’intérêt. Le principal avantage de ces dispositifs est la possibilité de séparer et de compartimenter la culture des corps cellulaires neuronaux d’un côté du dispositif d’une fraction axonale pure de l’autre côté du dispositif. Dans la vidéo suivante, nous vous montrerons comment nous préparons les neurones corticaux du rack fœtal E 18 et comment nous chargeons les cellules dans l’appareil.

C’est donc tout du John Lab. Merci d’avoir regardé.