Name: Fabrication dun dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Découvrez la lithographie souple avec PDMS pour fabriquer un dispositif microfluidique compartimentant les corps cellulaires neuronaux et les axones. Cette méthode avancée facilite l'étude du comportement neuronal et de la régénération axonale.

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Partie 1: Préparation de l&#39;appareil neurone microfluidique <ol><li> A 3 &quot;wafer de silicium avec un motif faite de SU-8 par photolithographie est utilisée pour lancer le polydiméthylsiloxane (PDMS) moule microfluidique. Nous nous référons à l&#39;SU-8 plaquette de silicium à motifs comme moules maître, ou« maîtres ». </li><li> PDMS est mélangé avec l&#39;agent de durcissement à p / p ratio de 10:1, qui est, pour 10 grammes de PDMS, 1 gramme de durcisseur est ajouté. </li><li> Le PDMS est ensuite bien mélangé et versé sur la plaquette de silicium. La plaquette de silicium est contenu dans un 10 cm de polystyrène boîte de Petri. Il faut environ 12 g à 15 g de PDMS afin de couvrir le maître d&#39;une épaisseur de 4 mm environ. </li><li> Le maître avec le PDMS est ensuite placé dans un dessiccateur à vide avec le couvercle de la boîte de Petri, et le vide est appliqué. Ceci est fait pour aider à éliminer les bulles d&#39;air du PDMS qui ont été introduites au cours de l&#39;agitation dans de l&#39;agent de durcissement. Il faut environ 15 minutes pour les bulles d&#39;air d&#39;être enlevé. </li><li> Le maître avec PDMS est retiré de la dessiccateur. Un pistolet à air avec un filtre de 0,45 um est utilisé pour enlever les bulles restantes. </li><li> Le maître est alors placé sur une plaque de 80 ° C pendant 1 heure chaude de guérir. </li></ol> Remarque: Si un dessicateur sous vide n&#39;est pas disponible, le maître peut être laissé à température ambiante pendant plusieurs heures. Les bulles d&#39;air éventuellement dissiper par leurs propres moyens. Si une plaque chauffante n&#39;est pas disponible, le PDMS se durcir à température ambiante après 24 heures. Remarque: Il est également important de s&#39;assurer que le maître est de niveau pendant le processus de durcissement. Partie 2: Découpage du périphérique neurone microfluidique <ol><li> Une fois que le PDMS est guéri sur le maître, il est pris d&#39;une hotte propre. </li><li> En utilisant une lame chirurgicale, un cercle est coupé autour du périmètre de ces dispositifs. Quand on insère la lame dans le PDMS, il est important de prendre contact avec la plaquette de silicium, mais de ne pas mettre trop de pression sur la plaquette, sinon le maître va se fissurer. </li><li> Avec un cercle coupé tout autour des appareils (il ya 4 appareils par chacun 3 &quot;Maître de silicium), le PDMS est soigneusement décollé le maître. Cela peut être démarré en tordant avec précaution la lame chirurgicale car il est inséré dans la coupe avant . </li><li> Ensuite, les réservoirs sont perforées dans l&#39;appareil en utilisant un 8 mm biopsie punch. </li><li> Les appareils sont ensuite écartelé et l&#39;excès de PDMS parés de suite afin que le dispositif s&#39;adapte parfaitement sur Corning Couvercle en verre (n ° 1) 24 mm x 40 mm. L&#39;azote de l&#39;air est utilisé pour souffler les débris excès. Les débris tenaces peuvent aussi être retirés à l&#39;aide de 3M Scotch 471 ruban vinyle. </li></ol> Partie 3: Plasma collage des dispositifs à lamelles de verre. <ol><li> Nettoyant plasma est utilisé pour coller une Harrick les appareils neurone à l&#39;lamelles. Brièvement, les appareils sont placés dans le nettoyeur plasma et une pompe à vide est utilisée pour évacuer l&#39;air de la chambre. </li><li> Après la dépression a atteint 300 milliTorr, est sous tension à la bobine électrique et un réglage élevé. </li><li> La bobine électrique crée le plasma &quot;, un gaz partiellement ionisé composé d&#39;électrons, des ions et des atomes ou molécules neutres» - <a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a> , sur les molécules d&#39;air restant dans la chambre de gauche. Le plasma crée des espèces réactives à la surface du verre et du dispositif qui, lorsque mis ensemble forment une liaison permanente. Le plasma se transforme aussi les surfaces hydrophiles, ce qui facilite l&#39;ajout de liquides. De plus, le nettoyeur de plasma stérilise les dispositifs. La surface de l&#39;appareil PDMS qui contient le dispositif microfluidique est placée face visible dans le nettoyeur de plasma avec les lames de verre. Les surfaces traitées plasmatique du verre et du dispositif microfluidique sont assemblés en contact les uns avec les autres sur un banc propre, puis placé dans stériles boîtes de 60 mm. Les surfaces traitées former un lien étroit irréversible. </li><li> Dans les 10 minutes de plasma liant les périphériques au verre, poly-L-Lysine (PLL) est ajouté à l&#39;appareil. Après 10 minutes, l&#39;hydrophilie de l&#39;appareil diminue ce qui rend difficile pour le PLL pour entrer dans le dispositif. Note: Il est important de vérifier les bulles d&#39;air dans l&#39;appareil après l&#39;ajout de la PLL. Les bulles d&#39;air dans le canal principal sont indésirables, comme ils le feraient oxydent les cellules. Une méthode facile pour enlever les bulles d&#39;air existante est d&#39;utiliser une pipette remplie P200 avec 150 ul de liquide (dans ce cas PLL), placez la pointe directement à l&#39;ouverture du canal principal, et appuyer sur le P200 avec force. Ce peut être nécessaire de répéter plusieurs fois, mais finalement la force de la pipette conduira les bulles. </li><li> Les appareils contenant PLL sont autorisés à incuber pendant la nuit dans une norme incubateur de culture tissulaire à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Le lendemain, le devices sont rincées deux fois rapidement avec autoclave dH2O. Pendant ce processus, le liquide n&#39;est jamais entièrement retiré des canaux principaux, seulement à partir des réservoirs. En enlevant le liquide des canaux principaux apparition de bulles. Après deux rinçages rapides, les périphériques sont remplis avec autoclave dH2O et replacée dans l&#39;incubateur pour un minimum de 3 heures ou toute la nuit. </li><li> Le lendemain, les appareils sont à nouveau rincées 2 fois rapidement avec autoclave dH2O. Ensuite, les médias neurones basale, contenant les suppléments nécessaires B27 et glutamax pour les neurones primaires de rat en culture, est ajoutée aux périphériques. Les appareils sont replacés dans l&#39;incubateur pour une utilisation future. Les appareils sont maintenant prêts pour l&#39;ensemencement des neurones. </li></ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous avons démontré comment faire et préparer un dispositif microfluidique en PDMS que nous utilisons pour la culture des neurones po L&#39;appareil nous permet d&#39;obtenir une fraction pure axonale séparés par microsillons du compartiment contenant un mélange de corps cellulaires, des dendrites et des axones . Ces dispositifs permettent au chercheur d&#39;étudier les effets des différents traitements ainsi que de fournir une plate-forme pour mener à bien des blessures physiques sur les axones et observer les effets de ces traitements ont sur les neurones. L&#39;appareil offre également un niveau d&#39;ordre pour les neurones en culture qui contribue à faciliter les études de transport. En outre, les microsillons, qui séparent le compartiment de culture cellulaire à partir du compartiment axonal, permet d&#39;isoler fluidique entre les deux compartiments permettant de traiter d&#39;un côté de l&#39;appareil sans affecter l&#39;autre côté de l&#39;appareil directement avec le traitement. Cette propriété permet au chercheur d&#39;étudier les effets tels que la transduction du signal et de transport qui résultent du traitement.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Réactif</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 avec agent de réticulation. Veuillez consulter Dow Corning pour trouver un fournisseur près de chez vous</td></tr><tr><td>Nettoyeur à plasma</td><td>Outil</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>http://www.harrickplasma.com/</td></tr><tr><td>Milieu basal neuronal</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Le milieu basal neuronal est fourni par Invitrogen dans sa gamme de réactifs Gibco pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Le supplément B27 est un complément propriétaire disponible chez Invitrogen dans sa gamme de réactifs Gibco pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Le Glutamax est disponible chez Invitrogen dans sa gamme de réactifs Gibco pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Verre de couverture Corning n°1</td><td>verre de couverture</td><td>Corning</td><td>Corning n° X2935 244</td><td>Disponible chez Fisher Scientific, numéro de catalogue Fisher 12-531D</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri de 60 mm</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>Des boîtes de Pétri stériles en polystyrène de 60 mm sont utilisées pour contenir le dispositif fixé sur verre.</td></tr><tr><td>Tube BD Falcon de 50 ml</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon n° 352098</td><td>Disponible chez Fisher Scientific, numéro de catalogue 14-959-49A</td></tr><tr><td>Tube BD Falcon de 15 ml</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon n° 352097</td><td>Disponible chez Fisher Scientific, numéro de catalogue 14-959-70C</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Nouvel article</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication d&#39;un dispositif microfluidique pour la compartimentation du neuron soma et des axones

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de lithographie douce polydiméthylsiloxane (PDMS) que nous utilisons pour fabriquer un dispositif microfluidique pour les neurones en culture. Auparavant, une tranche de silicium a été modelé à la conception pour le neurone dispositif microfluidique en utilisant SU-8 et la photolithographie à créer un moule maître, ou tout simplement ce que nous appelons un &quot;maître&quot;. Ensuite, nous versons le silicium polymère PDMS sur le dessus du maître, qui est ensuite durci par chauffage de l&#39;PDMS à 80 ° C pendant 1 heure. Le PDMS forme un moule négatif de l&#39;appareil. Le PDMS est ensuite soigneusement coupés et levé loin du maître. Des trous sont perforés où les réservoirs seront et l&#39;excès de PDMS parés loin de l&#39;appareil. L&#39;azote est utilisé pour souffler les débris excès de l&#39;appareil. A ce point les appareils sont maintenant prêts à utiliser et peut soit lié à Corning n ° 1 couvercle en verre avec un plasma stérilisateur / nettoyant ou peut être liée de façon réversible à l&#39;couvercle en verre en plaçant simplement l&#39;appareil sur le dessus du couvercle en verre. Le collage réversible de l&#39;appareil est recouvert de verre dans une vidéo séparée et exige d&#39;abord que le dispositif soit stérilisés soit à l&#39;éthanol 70% ou par autoclavage. Plasma traitement stérilise les périphériques ainsi aucun autre traitement n&#39;est nécessaire. Il est cependant important, quand plasma traitant les dispositifs, d&#39;ajouter du liquide à l&#39;appareil dans les 10 minutes de traitement par plasma alors que les surfaces sont encore hydrophile. Attendre plus longtemps que 10 minutes pour ajouter du liquide à l&#39;appareil, il est difficile pour le liquide d&#39;entrer dans le dispositif. Les dispositifs de neurones sont généralement plasma lié à couvercle en verre et 0,5 mg / ml de poly-L-lysine (PLL) dans un tampon borate pH 8,5 est immédiatement ajouté à l&#39;appareil. Après un minimum de 3 heures d&#39;incubation avec PLL, les appareils sont lavés à l&#39;eau dH2O un minimum de 3 fois avec au moins 15 minutes entre chaque lavage. Ensuite, l&#39;eau est éliminée et les médias frais est ajouté à l&#39;appareil. A ce point l&#39;appareil est prêt à l&#39;emploi. Il est important de se rappeler à ce stade de ne jamais supprimer tous les médias de l&#39;appareil. Toujours laisser les médias dans le chenal principal.

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de lithographie douce polydiméthylsiloxane (PDMS) que nous utilisons pour farbricate un dispositif microfluidique pour les neurones en culture.

Fabrication d&#39;un dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de lithographie douce avec du polydiméthylsiloxane (PDMS), que nous utilisons pour fabriquer un dispositif microfluidique pour...

Bienvenue dans le laboratoire du Dr Newly John. Le laboratoire John se spécialise dans la conception de plates-formes microfluidiques pour des applications biologiques. Dans cette vidéo, nous démontrerons la fabrication et l'utilisation d'un dispositif microfluidique conçu pour compartimenter et cultiver des neurones primaires.Le dispositif neuronal a été publié pour la première fois dans Nature Methods en août 2005. Depuis son introduction, le dispositif neuronal est largement utilisé par des collaborateurs du monde entier. Le dispositif neuronal est constitué d'un morceau de PDMS moulé sur une tranche de silicium contenant un motif SUA du dispositif, créé précédemment par photolithographie.L'appareil possède trois caractéristiques principales, quatre réservoirs de huit millimètres de diamètre, deux canaux principaux de 1,5 millimètre de large chacun, sept millimètres de long et cent microns de hauteur, ainsi que des micro-gorges de 10 micromètres de largeur et de trois micromètres de hauteur, qui relient les deux canaux principaux. La longueur des micro-gorges peut varier de 150 microns à 900 microns, bien que la longueur standard choisie soit de 450 microns. En observant l'appareil de manière à ce que les canaux principaux et les micro-gorges soient verticaux, on constate que les réservoirs situés à gauche des gorges sont reliés par les canaux principaux, tout comme les réservoirs situés à droite.Cette caractéristique permet à un liquide de circuler à travers le canal principal, une fonction importante qui rend possible le chargement des cellules et le changement de milieu. Le dispositif neuronal présente trois avantages majeurs par rapport aux plates-formes traditionnelles de culture tissulaire. Premièrement, il permet la compartimentation séparée des corps cellulaires, ou somas, et des axones. Grâce au dispositif neuronal, il est possible d'obtenir des fractions axonales pures.La taille et la longueur des microsillons permettent aux axones de traverser l'autre canal principal tout en empêchant les corps cellulaires de passer de l'autre côté. Deuxièmement, grâce à la conception du dispositif et à l'exploitation de la pression hydrostatique, il est possible de soumettre séparément soit le côté cellulaire, soit le côté axonal du dispositif à des traitements distincts, simplement en maintenant un volume plus élevé dans les réservoirs d'un côté du dispositif par rapport à l'autre. Et troisièmement, la fraction pure d'axones du dispositif peut être prélevée par aspiration sous vide, permettant au chercheur d'étudier et d'observer la régénération axonale.La chercheuse Hina Lee va maintenant démontrer la préparation du dispositif microfluidique pour neurones. Un wafer de silicium de trois pouces comportant un motif en SU-8, réalisé par photolithographie, est utilisé pour mouler le moule microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS). Nous désignons le wafer de silicium avec motif en SU-8 par les termes « moules maîtres » ou simplement « maîtres ».Le PDMS est mélangé avec l'agent de réticulation selon un rapport massique de 10 à 1. Autrement dit, par exemple, 15 grammes de PDMS pour 1,5 gramme d'agent de réticulation. Le PDMS est ensuite bien mélangé et versé sur la tranche de silicium.La plaquette de silicium est placée dans une boîte de Pétri en polystyrène de 10 centimètres de diamètre. Il faut environ 12 à 15 grammes de PDMS pour recouvrir les MA d'une épaisseur d'environ quatre millimètres. Le moule avec le PDMS est ensuite placé dans un dessiccateur sous vide, le couvercle de la boîte de Pétri étant retiré, puis le vide est appliqué.Cela permet d'éliminer les bulles d'air du PDMS qui ont été introduites lors du mélange de l'agent de réticulation. Environ 15 minutes sont nécessaires pour éliminer les bulles d'air. Le moule avec le PDMS est retiré du dessiccateur après 15 minutes passées dans le dessiccateur sous vide.Il reste encore quelques bulles sur le moule en PDMS. Un pistolet à air équipé d'un filtre de 0,45 micron est utilisé pour éliminer les bulles résiduelles. Le moule est ensuite placé sur une plaque chauffante à 80 degrés pendant une heure pour permettre la polymérisation.Si un dessiccateur sous vide n'est pas disponible, le mélange peut être laissé à température ambiante pendant plusieurs heures. Les bulles d'air disparaîtront finalement d'elles-mêmes. En l'absence de plaque chauffante, le PDMS durcira à température ambiante après 24 heures.Il est important de s'assurer que le modèle est à niveau pendant le processus de durcissement. Une fois que le PDMS est durci sur le modèle, il est transféré dans une hotte propre à l'aide d'une lame chirurgicale. Un cercle est découpé autour du périmètre des dispositifs.Il est important, lorsqu'on insère la lame dans le PDMS pour établir le contact avec la plaquette de silicium, de ne pas exercer une pression excessive sur la plaquette, sans quoi le moule se fissurera avec une découpe circulaire entourant complètement les dispositifs. Il y a quatre dispositifs par moule en silicium de trois pouces. Le PDMS est délicatement soulevé du moule.Cela peut être amorcé en tournant délicatement la lame chirurgicale lors de son insertion dans l'incision précédente. C'est très fin avec les dispositifs en PDMS sur le moule. Des réservoirs orientés vers le haut sont perforés dans le dispositif à l'aide d'un poinçon de biopsie tissulaire de huit millimètres.Les débris restants dans le poinçon sont expulsés à l'aide d'une tige. Les dispositifs sont ensuite divisés en quatre et l'excès de PDMS est retiré afin que le dispositif s'ajuste parfaitement sur une couverture Corning. Un verre numéro un de 24 millimètres par 40 millimètres est utilisé avec de l'air azoté pour éliminer tout débris excédentaire.Les débris tenaces peuvent également être éliminés à l'aide du ruban adhésif vinyle 3M Scotch Brand 4 7 1. Les dispositifs propres sont désormais prêts pour le collage au plasma. Un nettoyeur à plasma Herrick est utilisé pour lier brièvement les dispositifs à neurones aux lamelles de couverture.Les dispositifs et les lamelles sont placés sur un plateau, puis le plateau est inséré dans le nettoyeur à plasma et une pompe à vide est utilisée pour évacuer l'air de la chambre. Il est important de noter que les dispositifs en PDMS sont placés face vers le haut, c'est-à-dire avec le côté du motif orienté vers le haut, afin qu'ils soient exposés au gaz de plasma.Une fois que la pression sous vide a atteint 300 millitorr, l'alimentation du bobinage électrique est activée et réglée au maximum. On entrouvre légèrement la porte pour laisser entrer un peu d'air dans la chambre, ce qui aidera à générer le plasma. Les dispositifs et le verre de couverture sont traités au plasma pendant deux minutes.Observez la couleur violette dans la chambre. C'est le plasma réel. La bobine électrique crée un plasma, qui est un gaz partiellement ionisé composé d'électrons, d'ions et d'atomes ou de molécules neutres.Le plasma crée des espèces réactives à la surface du verre et du dispositif, qui, lorsqu'ils sont mis en contact, formeront une liaison permanente. Le plasma rend également la surface hydrophile, ce qui facilite l'ajout de liquides. Le nettoyeur à plasma stérilise également les dispositifs.Après un traitement au plasma pendant deux minutes, l'alimentation sous vide est coupée et de l'air est introduit dans la chambre. Les surfaces traitées au plasma du verre et du dispositif microfluidique sont assemblées en contact l'une avec l'autre sur un banc propre. Les dispositifs sont ensuite placés dans des boîtes stériles de 60 millimètres.Les surfaces traitées au plasma du verre et du dispositif forment une liaison étanche et irréversible. Dans les 10 minutes suivant la liaison au plasma, le dispositif reçoit du polyol lysine. Après 10 minutes, l'hydrophilie du dispositif diminue.Il est difficile de faire entrer le PLL dans le dispositif. Il est important de vérifier la présence de bulles d'air dans le dispositif après l'ajout de PLL. Une méthode simple pour éliminer les bulles d'air présentes consiste à utiliser une pipette P 200 remplie de 100 microlitres de liquide.Dans ce cas, le PLL place la pointe directement à l'ouverture du canal principal, puis appuie fermement sur le P 200. Cette manipulation peut devoir être répétée plusieurs fois, mais finalement la force du pipetage expulsera les bulles. Les dispositifs contenant le PLL sont laissés en incubation toute la nuit dans un incubateur standard pour culture tissulaire à 37 degrés avec 5 % de CO2.Après 24 heures d'incubation avec le PLL, les dispositifs sont rincés deux fois rapidement avec de l'eau désionisée stérilisée au autoclave. Pendant ce processus, le liquide n'est jamais entièrement éliminé des canaux principaux, seulement des réservoirs. L'élimination du liquide des canaux principaux introduirait des bulles.Après deux rinçages rapides, les dispositifs sont à nouveau remplis d'eau déionisée stérilisée au moyen de l'autoclave et replacés dans l'incubateur pendant au moins trois heures ou toute la nuit. Le lendemain, après avoir incubé les dispositifs dans l'eau pendant toute la nuit ou au minimum trois heures, ceux-ci sont de nouveau transférés dans la hotte de sécurité biologique et rincés deux fois avec de l'eau déionisée. Ensuite, le milieu basal neural contenant les suppléments nécessaires, B 27 et du glutamate, destiné à la culture de neurones primaires de rat, est ajouté aux dispositifs.Les dispositifs sont ensuite replacés dans l'incubateur en vue d'une utilisation ultérieure. Les dispositifs sont désormais prêts à recevoir les neurones. Dans cette vidéo, nous avons démontré la technique de lithographie douce, que nous utilisons pour fabriquer nos dispositifs neuronaux.Ces dispositifs peuvent être utilisés pour cultiver des neurones et d'autres types cellulaires d'intérêt. Le principal avantage de ces dispositifs réside dans la possibilité de séparer et de compartimenter la culture des corps cellulaires neuronaux d'une part, et d'une fraction pure d'axones d'autre part. Dans la prochaine vidéo, nous vous montrerons comment nous préparons des neurones corticaux fœtaux de rat à E 18 et comment nous chargeons les cellules dans le dispositif.Voilà tout pour aujourd'hui depuis le laboratoire de John. Merci d'avoir regardé.

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