iClip - transcriptome à l'échelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir une carte à l’échelle du transcriptome des sites de liaison d’une protéine de liaison à l’ARN à la résolution d’un nucléotide individuel. Ceci est réalisé par l’irradiation UV des cellules vivantes pour réticuler de manière covalente les protéines et l’ARN in vivo dans un deuxième temps. La protéine de liaison à l’ARN est immunopurifiée dans des conditions strictes afin de récupérer les fragments d’ARN réticulés.

Ensuite, la transcription inverse génère des CDNA qui se tronquent souvent au peptide attaché, ce qui préserve l’information sur la position de réticulation dans l’ARN Les résultats obtenus montrent tous les sites de liaison dans le transcriptome sur la base du séquençage à haut débit de la banque d’ADNc. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie de l’ARN, telles que la façon dont l’interaction de différentes protéines oniques de l’ARN régule le traitement de l’ARN. Le principal avantage de cette technique est que nous augmentons à la fois les performances et la résolution de nos cartes à l’échelle du transcriptome des interactions entre les protéines et l’ARN pour commencer la procédure de réticulation UV des cellules de culture tissulaire.

Retirez le milieu d’une plaque de 10 centimètres de cellules guérisseuses. Ajoutez six millilitres de PBS glacé et placez les assiettes sur de la glace. Une planche suffit pour trois expériences.

Retirez le couvercle et irradiez les cellules. Une fois à 254 nanomètres avec 150 millijoules par centimètre carré, récoltez les cellules en les grattant des plaques avec un élévateur de cellules, transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans chacun des trois microtubes pour granuler les cellules. Faites-les tourner à vitesse maximale pendant 10 secondes à quatre degrés Celsius.

Retirez ensuite le bouton-pression de supinate, congelez les granulés de cellules sur de la glace sèche et stockez-les jusqu’à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Ajoutez 100 microlitres de protéines, une perle de dyna par expérience dans un microtube frais. Si vous travaillez avec des anticorps de souris ou de chèvre, utilisez des billes de protéine G dyna.

Lavez les billes deux fois avec un tampon de lyse, qui se trouve dans le protocole écrit ci-joint. Remettre les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon de lyse avec deux à 10 microgrammes d’anticorps. Faites pivoter le tube à température ambiante pendant 30 à 60 minutes.

Ensuite, lavez les billes trois fois avec 900 microlitres de tampon de lyse et laissez-les dans le dernier lavage jusqu’à ce que vous soyez prêt à continuer. À l’immunoprécipitation Thor cellule palais sur glace. Resus en suspension dans un millilitre de tampon de lyse et transférez-le dans un microtube de 1,5 millilitre.

Préparez une dilution de un à 500 ARN un. Ajoutez ensuite 10 microlitres avec deux microlitres d’ADN turbo dans la cellule. Lysat. Incuber les échantillons pendant exactement trois minutes à 37 degrés Celsius, en les secouant à 1 100 rotations par minute, puis les transférer immédiatement dans la glace.

Ensuite, faites tourner les échantillons à quatre degrés Celsius et 22 000 fois la gravité pendant 20 minutes pour éliminer le lysat, collectez soigneusement le SUP natant, en laissant environ 50 microlitres de lysat avec la pastille pour immunoprécipiter les billes. Retirez le tampon de lavage, puis ajoutez les lysats cellulaires préparés. Faites pivoter les échantillons pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

Jetez l’agent SUP et lavez les billes deux fois avec 900 microlitres de tampon à haute teneur en sel, qui se trouve dans le protocole écrit d’accompagnement. Enfin, lavez les perles deux fois avec 900 microlitres de tampon de lavage. Ensuite, procédez à la déphosphorylation et ajoutez un agent de liaison aux trois extrémités premières de l’ARN.

Pour marquer l’ARN, cinq extrémités premières travaillent derrière un bouclier en plexiglas. Retirez le supinate du dernier lavage de la réaction de ligature de liaison et suspendez à nouveau les billes dans huit microlitres de mélange PNK chaud. Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Retirez le mélange PNK chaud et réusez-le. Suspendez les billes dans 20 microlitres d’un tampon de chargement de page neuf fois. Ensuite, incubez l’échantillon sur un mélangeur thermique à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Placez immédiatement l’échantillon sur un aimant pour précipiter les billes vides. Chargez les échantillons sur une nouvelle page de quatre à 12 %. Biss gel selon les instructions du fabricant.

Chargez également cinq microlitres d’un marqueur de taille de protéine pré-colorée. Faites fonctionner le gel pendant 50 minutes à 180 volts. Transférez les complexes protéiques ARN du gel à une membrane de nitrocellulose à l’aide de l’appareil de transfert humide NOVA selon les instructions du fabricant.

Après le transfert, rincez la membrane dans un tampon PBS. Ensuite, enveloppez-le dans du film Saran et exposez-le à un film à moins 80 degrés Celsius. Effectuez des expositions pendant 30 minutes, une heure et toute la nuit.

Ensuite, isolez la région membranaire en fonction des complexes d’ARN protéiques à partir des ARN faibles. Expérimentez en utilisant l’autoradiographie comme masque. Récupérer l’ARN de la membrane par digestion à la protéinase K et l’extraction au phénol chloroforme.

Transcrire l’ARN à l’aide de l’une des amorces AYP pour purifier l’ADNC. Mélangez six microlitres d’échantillon d’ADNC avec six microlitres de tampon de charge d’urée TBE deux fois. Juste avant de charger les échantillons sur un gel.

Chauffez les échantillons à 80 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, chargez les échantillons sur un gel d’urée préfabriqué à 6 % TBE accompagné d’un marqueur de faible poids moléculaire. Laissez le gel couler pendant 40 minutes à 180 volts comme décrit par le fabricant en utilisant le colorant supérieur et les marques sur le support en gel plastique pour guider l’excision.

Coupez trois bandes de 120 à 200 nucléotides, 85 à 120 nucléotides et 70 à 85 nucléotides. Notez que l’amorce de lèvre en arc et la séquence L trois représentent ensemble 52 nucléotides de la séquence de clip. Ajoutez 400 microlitres de te et écrasez la tranche de gel en petits morceaux.

À l’aide d’un piston de seringue d’un millilitre, incubez les morceaux de gel en les secouant à 1 100 rotations par minute pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Placez deux préfiltres en verre d’un centimètre dans une colonne CoStar spinx. Transférez la partie liquide de l’échantillon dans la colonne de rotation pendant une minute à 13 000 rotations par minute dans un tube de 1,5 millilitre.

Ajoutez 0,5 microlitre de glyco bleu et 40 microlitres d’acétate de sodium pH 5,5. Mélangez ensuite l’échantillon. Ajouter un millilitre d’éthanol à 100 %.

Mélangez à nouveau et précipitez l’échantillon pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius. Enfin, circularisez les molécules CD NA pour attacher la région de l’adaptateur à l’extrémité principale cinq. Ensuite, relinéariser et amplifier la PCR selon le protocole écrit d’accompagnement avant le séquençage de la bibliothèque de clips oculaires, le succès de l’expérience peut être suivi en deux étapes.

L’autoradiographie du complexe d’ARN protéique après transfert membranaire et l’image gel des produits PCR dans l’autoradiographie des échantillons à faible ARN, la radioactivité diffuse doit être observée au-dessus du poids moléculaire de la protéine pour les échantillons à ARN élevé. Cette radioactivité est focalisée plus près du poids moléculaire de la protéine. Lorsqu’aucun anticorps n’est utilisé dans l’immunoprécipitation, aucun signal ne doit être détecté.

D’autres contrôles importants pour la spécificité de l’immunoprécipitation émettent une irradiation UVE ou utilisent des cellules qui n’expriment pas la protéine d’intérêt. L’image en gel des produits de PCR doit montrer une gamme de tailles qui correspond à la fraction NA de CD. Notez que les amorces PCR, P trois Celexa et P cinq Celexa, introduisent 76 nucléotides supplémentaires à la taille du CD NA. Si aucun anticorps n’est utilisé pendant l’immunoprécipitation, aucun produit PCR correspondant ne doit être détecté.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que chacune des 64 étapes est critique et doit être effectuée avec une précision de cent pour cent. Les données ICL peuvent être intégrées informatiquement avec des tests fonctionnels à l’échelle du transcriptum. Cela peut, par exemple, obtenir des informations sur la régulation dépendante de la position du traitement de l’ARN.

Pour l’analyse des données informatiques, nous aimerions nous référer à nos récentes publications en collaboration avec l’Institut européen de bioinformatique Nicholas KA et bla zupan à l’Université de Liana. Et maintenant, il est temps que vous commenciez vos propres expériences. Amusez-vous.