iClip - transcriptome à l'échelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir une carte à l'échelle du transcriptome des sites de fixation d'une protéine liant l'ARN, avec une résolution au niveau du nucléotide individuel. Cela est réalisé par une irradiation aux UV de cellules vivantes afin de réticuler de façon covalente les protéines et l'ARN in vivo, puis, dans une deuxième étape, la protéine liant l'ARN est purifiée par immunoprécipitation dans des conditions strictes afin de récupérer les fragments d'ARN réticulés.

La transcription inverse suivante génère des ADNc qui se tronquent souvent au niveau du peptide fixé, préservant ainsi l'information sur la position du pontage croisé au sein de l'ARN. Les résultats obtenus montrent tous les sites de fixation présents dans le transcriptome, grâce au séquençage à haut débit de la bibliothèque d'ADNc. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie de l'ARN, comme la manière dont l'interaction entre différentes protéines liant l'ARN régule le traitement de l'ARN. Le principal avantage de cette technique est que nous améliorons à la fois les performances et la résolution de nos cartes à l'échelle du transcriptome des interactions protéine-ARN. Pour commencer la procédure de pontage croisé par UV sur des cellules en culture tissulaire.

Retirer le milieu d'une plaque de 10 centimètres de cellules hépatiques. Ajouter six millilitres de PBS glacé et placer les plaques sur de la glace. Une plaque suffit pour trois expériences.

Retirez le couvercle et irradiez les cellules, une fois à 254 nanomètres avec 150 millijoules par centimètre carré. Récoltez les cellules en les grattant depuis les plaques à l’aide d’un grattoir, puis transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans chacun de trois tubes microcentrifugés afin de former un culot cellulaire. Faites-les centrifuger à vitesse maximale pendant 10 secondes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, retirez le surnageant, congélez les culots cellulaires sur de la glace sèche et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Ajoutez 100 microlitres de protéine, une perle magnétique par expérience, dans un nouveau tube microcentrifuge. Si vous travaillez avec des anticorps de souris ou de chèvre, utilisez des perles magnétiques liées à la protéine G.

Lavez les billes deux fois avec le tampon de lyse, disponible dans le protocole écrit accompagnant. Resuspendez les billes dans 100 microlitres de tampon de lyse contenant deux à 10 microgrammes d'anticorps. Incubez le tube en rotation à température ambiante pendant 30 à 60 minutes.

Ensuite, lavez les billes trois fois avec 900 microlitres de tampon de lyse et laissez-les dans le dernier lavage jusqu'à ce que vous soyez prêt à poursuivre. Pour l'immunoprécipitation, placez la cellule Thor sur de la glace. Resuspendez dans un millilitre de tampon de lyse et transférez dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.

Préparez une dilution de 1 à 500 des ARN un. Ajoutez ensuite 10 microlitres, ainsi que deux microlitres de Turbo ADN, au lysat cellulaire. Incubez les échantillons exactement trois minutes à 37 degrés Celsius, sous agitation à 1 100 tours par minute, puis transférez immédiatement sur de la glace.

Ensuite, centrifuger les échantillons à quatre degrés Celsius et à 22 000 ×g pendant 20 minutes pour clarifier le lysat ; collecter soigneusement le surnageant, en laissant environ 50 microlitres de lysat avec le culot afin de précipiter les billes par immunoprécipitation. Éliminer le tampon de lavage, puis ajouter les lysats cellulaires préparés. Agiter doucement les échantillons pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

Jetez l'agent SUP et lavez les billes deux fois avec 900 microlitres de tampon à haute force ionique, disponible dans le protocole écrit accompagnant. Enfin, lavez les billes deux fois avec 900 microlitres de tampon de lavage. Procédez ensuite à la déphosphorylation et ajoutez un linker aux extrémités trois primes de l'ARN.

Pour marquer les extrémités 5' de l'ARN, travaillez derrière un écran en plexiglas. Éliminez le surnageant du dernier lavage de la réaction de ligation du linker et remettez en suspension les billes dans huit microlitres de mélange chaud de PNK. Incubez cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Retirer le mélange chaud de PNK et réutiliser. Suspendre les billes dans 20 microlitres de tampon de charge new page à une fois. Incuber ensuite l'échantillon dans un mélangeur thermique à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Placez immédiatement l'échantillon sur un aimant pour précipiter les billes vides. Chargez les échantillons sur un gel Biss de type « four to 12 % new page » conformément aux instructions du fabricant.

Aussi, charger cinq microlitres d'un marqueur de taille protéique pré-étiqueté. Faire migrer le gel pendant 50 minutes à 180 volts. Transférer les complexes protéine-ARN du gel vers une membrane de nitrocellulose à l'aide de l'appareil de transfert humide NOVA, conformément aux instructions du fabricant.

Après le transfert, rincez la membrane dans du tampon PBS. Ensuite, enveloppez-la dans du film plastique et exposez-la à un film à moins 80 degrés Celsius. Effectuez des expositions de 30 minutes, une heure et toute la nuit.

Ensuite, isolez la région de la membrane contenant les complexes protéine-ARN à partir des faibles concentrations d'ARN. Réalisez l'expérience en utilisant l'autoradiographie comme masque. Récupérez l'ARN de la membrane par digestion à la protéinase K et extraction au phénol-chloroforme.

Transcrire en sens inverse l'ARN en utilisant un des amorces AYP afin de purifier l'ADNc sur gel. Mélanger six microlitres d'échantillon d'ADNc avec six microlitres de tampon de charge urée TBE deux fois concentré. Juste avant de charger les échantillons sur un gel.

Chauffez les échantillons à 80 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, chargez les échantillons sur un gel d'urée TBE 6 % préfabriqué, accompagné d'un marqueur de faible poids moléculaire. Faites migrer le gel pendant 40 minutes à 180 volts, comme décrit par le fabricant, en utilisant le colorant supérieur et les repères sur le support plastique du gel pour guider l'excision.

Découpez trois bandes situées entre 120 et 200 nucléotides, entre 85 et 120 nucléotides, et entre 70 et 85 nucléotides. Notez que l'amorce arc lip et la séquence L trois représentent ensemble 52 nucléotides de la séquence clip. Ajoutez 400 microlitres de tampon TE et broyez le morceau de gel en petits fragments.

À l’aide du piston d’une seringue d’un millilitre, incuber les morceaux de gel sous agitation à 1 100 tours par minute pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Placer deux préfiltres en verre d’un centimètre dans une colonne CoStar SpinX. Transférer la partie liquide de l’échantillon dans la colonne et faire tourner pendant une minute à 13 000 tours par minute dans un tube de 1,5 millilitre.

Ajouter 0,5 microlitres de glyco blue et 40 microlitres d'acétate de sodium à pH 5,5. Mélanger ensuite l'échantillon. Ajouter un millilitre d'éthanol à 100 %.

Mélangez à nouveau et précipitez l'échantillon pendant toute la nuit à moins 20 degrés Celsius. Enfin, circulairez les molécules d'ADNc afin d'attacher la région d'adaptateur à l'extrémité cinq prime. Ensuite, recirculairez et amplifiez par PCR selon le protocole écrit joint avant le séquençage de la bibliothèque d'yeux, la réussite de l'expérience pouvant être surveillée en deux étapes.

L'autoradiographie du complexe protéine-ARN après transfert sur membrane et l'image du gel des produits de PCR sur l'autoradiographie des échantillons à faible teneur en ARN montrent que la radioactivité diffuse doit être observée au-dessus du poids moléculaire de la protéine pour les échantillons riches en ARN. Cette radioactivité est concentrée plus près du poids moléculaire de la protéine. En l'absence d'anticorps lors de l'immunoprécipitation, aucun signal ne devrait être détecté.

Des contrôles supplémentaires importants pour évaluer la spécificité de l'immunoprécipitation consistent soit à émettre un rayonnement UVE, soit à utiliser des cellules qui n'expriment pas la protéine d'intérêt. L'image du gel des produits de PCR doit montrer une gamme de tailles correspondant à la fraction d'ADNc. Notez que les amorces de PCR, P trois Celexa et P cinq Celexa, ajoutent 76 nucléotides supplémentaires à la taille de l'ADNc. En l'absence d'anticorps lors de l'immunoprécipitation, aucun produit de PCR correspondant ne devrait être détecté.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que chacune des 64 étapes est cruciale et doit être effectuée avec une précision absolue. Les données ICL peuvent être intégrées par calcul avec des tests fonctionnels à l'échelle du transcriptome. Cela peut, par exemple, permettre d'obtenir des informations sur la régulation dépendante de la position du traitement de l'ARN.

Pour l'analyse informatique des données, nous souhaitons renvoyer à nos publications récentes réalisées en collaboration avec Nicholas KA de l'Institut européen de bioinformatique et Bla Zupan de l'Université de Ljubljana. Et maintenant, il est temps que vous commenciez vos propres expériences. Amusez-vous bien.