Name: iClip - transcriptome à léchelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Apprenez la méthode iCLIP pour cartographier les sites de liaison des protéines ARN à résolution nucléotidique. Cette technique permet d'étudier la régulation post-transcriptionnelle à l'échelle du transcriptome.

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Les auteurs remercient tous les membres des laboratoires de Ule, Luscombe et Zupan de discussion et d&#39;assistance expérimentale. Nous remercions James Hadfield et Nik Matthews pour séquençage à haut débit. Nous tenons à souligner que la méthode décrite ici iClip part plusieurs étapes avec le protocole clip original, développé par Kirk Jensen et JU dans le laboratoire de Robert Darnell. Ce travail a été soutenu par la subvention européenne du Conseil de recherches 206726-CLIP à JU et une longue durée bourse Human Frontiers Science Program à JK

1. UV réticulation des cellules de culture tissulaire <ol><li> Retirez le papier et ajouter 6 ml PBS glacé aux cellules cultivées dans une plaque de 10 cm (pour trois expériences). </li><li> Retirer le couvercle et placer sur la glace. Irradier une fois avec 150 mJ / cm 2 à 254 nm. </li><li> Récolter les cellules en grattant avec un lifter cellule. </li><li> Transfert 2 ml de suspension cellulaire à chacun des trois microtubes. Spin à toute vitesse pendant 10 secondes à 4 ° C pour sédimenter les cellules, puis retirer le surnageant. </li><li> Snap-geler les culots cellulaires sur la glace sèche et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. </li></ol> 2. La préparation de billes <ol><li> Ajouter 100 ul de la protéine A Dynabeads (Dynal, 100,02) par expérience pour un microtube frais (Utilisez la protéine G Dynabeads pour une souris ou d'anticorps de chèvre). </li><li> Lavez perles 2x avec un tampon de lyse (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; désoxycholate de sodium à 0,5%; 1 / 100 inhibiteur de protéase cocktail III, Calbiochem). </li><li> Remettre les billes dans 100 ul de tampon de lyse avec 2-10 anticorps ug. </li><li> Rotation des tubes à température ambiante pendant 30-60 min. </li><li> Laver 3x avec 900 ul de tampon de lyse et laisser dans le dernier lavage avant d'être prêt à passer à l'étape 4.1. </li></ol> 3. Lyse cellulaire et digestion partielle ARN <ol><li> Reprendre le culot cellulaire dans du tampon de lyse 1 ml et transférer à microtubes de 1,5 ml. </li><li> Préparer une dilution 1 / 500 de la RNase I (Ambion, AM2295). Ajouter 10 ul RNase I dilution ainsi que 2 pl Turbo DNase au lysat cellulaire (1 / 500 RNase dilutions I [faible RNase] sont utilisées pour la préparation de la bibliothèque; 1 / 50 dilutions [haute RNase] sont nécessaires pour contrôler la spécificité des anticorps) . </li><li> Incuber les échantillons pendant exactement 3 minutes à 37 ° C, en agitant à 1100 rpm. Immédiatement transfert à glace. </li><li> Centrifuger à 4 ° C et 22 000 g pendant 20 min pour effacer le lysat. Recueillir soigneusement le surnageant (laisser environ 50 ul de lysat avec le culot). </li></ol> 4. Immunoprécipitation <ol><li> Retirez le tampon de lavage des billes (de l'étape 2.5), puis ajouter le lysat cellulaire (de l'étape 3.4). </li><li> Tournez les échantillons pendant 2 h à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant et laver les billes de 2x avec 900 pi de haut-sel tampon (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% de désoxycholate). </li><li> Laver 2x avec 900 ul de tampon de lavage (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% de Tween-20). </li></ol> 5. La déphosphorylation des extrémités 3 'ARN <ol><li> Jeter le surnageant et remettre les billes en 20 PNK mélangez ul (15 ul d'eau; 4 pl pH 6,5 5x PNK buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul enzyme PNK; 0,5 ul RNasine [Promega]). </li><li> Incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon de lavage et laver 1x avec forte teneur en sel tampon. </li><li> Laver 2x avec un tampon de lavage. </li></ol> 6. Ligature Linker à l'ARN extrémités 3 ' <ol><li> Retirez délicatement le surnageant et remettre les billes en 20 mélange de ligature ul (9 ul d'eau, 4 pi de tampon ligature 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL 2; 40 mM de dithiothréitol]; 1 pl ARN ligase [ONE]; 0,5 RNasine ul [Promega]; 1,5 ul pré-adenylated linker L3 [20 uM]; 4 pl PEG400 [81170, Sigma]). </li><li> Incuber une nuit à 16 ° C. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon de lavage, puis lavez 2x avec 1 ml de haute sel tampon. </li><li> Laver 2x avec 1 ml de tampon de lavage et laisser dans 1 ml de la deuxième lavage. </li></ol> 7. Étiquetage fin ARN 5 ' <ol><li> Retirer le surnageant et remettre les billes en 8 ul du PNK mélange à chaud (0,4 pi PNK [ONE]; 0,8 ul 32 P-γ-ATP, 0,8 ul de tampon 10x PNK [ONE]; eau 6 pi). </li><li> Incuber pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Retirer le mélange PNK chaud et remettre en suspension les perles dans 20 tampon 1x chargement ul NuPAGE (Invitrogen). </li><li> Incuber sur un thermomixer à 70 ° C pendant 10 min. </li><li> Immédiatement placer sur un aimant pour précipiter les perles vide et charger le surnageant sur le gel (voir étape 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE et transfert sur membrane <ol><li> Charger les échantillons sur un NuPAGE 4-12% de Bis-Tris gel (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Utiliser 0,5 L de 1x MOPS courir tampon (Invitrogen). Également charger 5 pi d'un marqueur pré-teint protéine de taille (par exemple la règle PAGE plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Exécutez le gel pendant 50 min à 180 V. </li><li> Retirer le gel de l'avant et jeter les déchets solides (contient gratuitement ATP radioactif). </li><li> Transfert des complexes protéines-ARN à partir du gel d'une membrane de nitrocellulose en utilisant l'appareil de transfert Novex humide selon les instructions du fabricant (Invitrogen, transférer 1 h à 30 V). </li><li> Après le transfert, rincer la membrane dans du tampon PBS, puis l'envelopper dans du Saran Wrap et de l'exposer à un film Fuji à -80 ° C (placer un autocollant fluorescent à côté de la membrane pour l'aligner tqu'il film et la membrane; effectuer des expositions pendant 30 min, 1h et plus la nuit). </li></ol> 9. Isolement de l'ARN <ol><li> Isoler les complexes protéines-ARN à partir de l'expérience à faible RNase en utilisant l'autoradiographie de l'étape 8.5 comme un masque. Couper ce morceau de membrane en plusieurs petites tranches et les placer dans un microtube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM d'EDTA) et 10 pl protéinase K (Roche, 03115828001) pour les morceaux de membrane. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 200 pl de tampon PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM EDTA, 7 M d'urée) et incuber pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Recueillir la solution et l'ajouter avec 400 pi de phénol / chloroforme (Ambion, 9722) à une phase 2 ml de gel de verrouillage du tube lourd (713 à 2536, VWR) ARN. </li><li> Incuber pendant 5 min à 30 ° C, en agitant à 1100 rpm. Séparer les phases en faisant tourner pendant 5 min à 13000 rpm à température ambiante. </li><li> Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube (attention à ne pas toucher le gel avec la pipette). Ajouter 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) et 40 pi 3 M pH acétate de sodium 5,5 et mélanger. Puis ajoutez 1 ml d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. </li></ol> 10. La transcription inverse <ol><li> Spin pendant 20 min à 15000 rpm et 4 ° C. Enlever le surnageant et laver le culot avec 0,5 ml d'éthanol à 80%. </li><li> Reprendre le culot dans 7,25 ARN ul / mélange d'amorces (6,25 pi d'eau, 0,5 apprêt Rclip ul [0.5pmol/μl]; 0,5 ul de dNTP mix [10 mm]). Pour chaque expérience ou de reproduire, utiliser un apprêt Rclip différents contenant des séquences de codes à barres individuel (voir 14). </li><li> Incuber pendant 5 min à 70 ° C avant de refroidir à 25 ° C. </li><li> Ajouter 2,75 ul RT mélange (2 ul de tampon 5x RT; 0,5 ul DTT 0,1 M; 0,25 ul Exposant III de la transcriptase inverse [Invitrogen]). </li><li> Incuber 5 min à 25 ° C, 20 min à 42 ° C, 40 min à 50 ° C et 5 min à 80 ° C avant de refroidir à 4 ° C. </li><li> Ajouter 90 ul de tampon TE, 0,5 glycoblue ul et 10 ul d'acétate de sodium pH 5,5 et mélanger. Puis ajouter 250 ul d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. </li></ol> 11. Purification sur gel d'ADNc <ol><li> Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans 6 pl d'eau. </li><li> Ajouter 6 ul de tampon de chargement 2x TBE-urée (Invitrogen). Échantillons de chaleur à 80 ° C pendant 3 min avant de le charger directement. </li><li> Charger les échantillons sur un préfabriqué 6% TBE-urée gel (Invitrogen) et courir pendant 40 min à 180 V comme décrit par le fabricant. Également charger un marqueur de faible poids moléculaire pour le découpage ultérieur (voir ci-dessous). </li><li> Couper trois bandes à 120-200 NT (élevé), de 85 à 120 nt (moyen) et 70 à 85 nt (basse). Utilisez theupper colorant et les marques sur le support de gel de plastique afin de guider l'excision (voir Figure 3). Notez que l'amorce et la séquence Rclip L3 représentent ensemble 52 nt de la séquence de CLIP. </li><li> Ajouter 400 ul de TE et écraser la tranche de gel en petits morceaux à l'aide d'un piston de seringue 1 ml. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 2 h à 37 ° C. </li><li> Placer deux de 1 cm de verre pré-filtres (Whatman, 1.823.010) dans une colonne Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Transfert de la partie liquide de l'échantillon à la colonne. Spin pendant 1 min à 13000 rpm dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 0,5 glycoblue ul et 40 ul d'acétate de sodium pH 5,5, puis mélanger l'échantillon. Ajouter 1 ml d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. </li></ol> 12. Ligature d'apprêt à l'extrémité 5 'de l'ADNc <ol><li> Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans huit mélange de ligature ul (6,5 ul d'eau, 0,8 ul de tampon 10x CircLigase II; 0,4 pi 50 mM MnCl2; 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) et incuber pendant 1 h à 60 ° C. </li><li> Ajouter 30 ul mélange d'oligo recuit (26 ul d'eau, 3 tampons FastDigest ul [Fermentas]; 1 pl cut_oligo [10 pM]). Incuber 1 min à 95 ° C. Puis baisser la température toutes les 20 sec de 1 ° C jusqu'à 25 ° C sont atteints. </li><li> Ajouter 2 ul BamHI (Fast Fermentas) et incuber pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 50 ul de TE et 0,5 glycoblue ul et mélanger. Ajouter 10 ul d'acétate de sodium pH 5,5 et mélanger, puis ajouter 250 ul d'éthanol à 100%. Mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. </li></ol> 13. L'amplification par PCR <ol><li> Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remise en suspension le culot dans 19 ul d'eau. </li><li> Préparer le mélange de PCR (19 ul d'ADNc; 1 pl apprêt mélangez P5/P3 Solexa, 10 uM de chacun; 20 Accuprime ul Supermix une enzyme [Invitrogen]). </li><li> Exécutez le programme PCR suivant: 94 ° C pendant 2 min, [94 ° C pendant 15 sec, 65 ° C pendant 30 sec, 68 ° C pendant 30 sec] 25-35 cycles, 68 ° C pendant 3 min, 4 ° C pour toujours. </li><li> Mélanger 8 produit ul PCR avec 2 pi de tampon TBE chargement 5x et charge sur un gel de TBE préfabriqué 6% (InvitRogen). Tache le gel avec SybrGreen I (Invitrogen) et d'analyser avec un imageur de gel. </li><li> Le code-barres dans les amorces Rclip permettent à des échantillons de différents multiplex avant de soumettre pour le séquençage à haut débit. Soumettez 15 ul de la bibliothèque pour le séquençage et de stocker le reste. </li></ol> 14. Des séquences de liaison et de l'amorce ADN lieur Pré-adenylated 3 ': [Nous commandons l'adaptateur d'ADN de IDT et ensuite faire des aliquotes de 20μM.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="ADN" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="ADN"> 15. Les résultats représentatifs: Avant de séquençage de la bibliothèque iClip, le succès de l'expérience peuvent être surveillés à deux étapes: l'autoradiographie du complexe protéine-ARN, après transfert sur membrane (étape 8.5) et l'image du gel des produits de PCR (étape 13.4). Dans l'autoradiographie des échantillons à faible RNase, la radioactivité diffuse doit être considéré au-dessus du poids moléculaire de la protéine (figure 2, l'échantillon 4). Pour haute RNase échantillons, cette radioactivité est concentrée près de la masse moléculaire de la protéine (figure 2, l'échantillon 3). Si aucun anticorps n'est utilisé dans l'immunoprécipitation, aucun signal doit être détecté (figure 2, les échantillons 1 et 2). D'autres commandes importantes pour la spécificité de l'immunoprécipitation omettez d'irradiation UV ou les cellules utilisent qui n'expriment pas la protéine d'intérêt 14. L'image du gel des produits de PCR (étape 13.4) devrait montrer une gamme de taille qui correspond à la fraction d'ADNc (haute, moyenne ou faible) purifié à l'étape 11.4 (Figure 4, voies 4-6). Notez que les amorces PCR P3Solexa et P5Solexa introduire un supplémentaire 76 nt à la taille de l'ADNc. Si aucun anticorps n'est utilisé pendant l'immunoprécipitation, aucun produit correspondant PCR devrait être détectés (figure 4, pistes 1-3). Produit dimère Primer peut apparaître à environ 140 nt. Pour obtenir des résultats représentatifs de séquençage à haut débit et des analyses ultérieures bioinformatiques voir 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Représentation schématique du protocole de iClip. Protéines-ARN sont des complexes de liaisons croisées covalentes in vivo en utilisant l'irradiation UV (étape 1). La protéine d'intérêt est purifié avec l'ARN lié (étapes 2-5). Afin de permettre une séquence-spécifique d'amorçage de la transcription inverse, un adaptateur ARN est ligaturé à l'extrémité 3 'de l'ARN, tandis que l'extrémité 5' est marquée radioactivement (étapes 6 et 7). Réticulé complexes protéine-ARN sont purifiés à partir d'ARN gratuitement en utilisant SDS-PAGE et transfert sur membrane (étape 8). L'ARN est récupéré à partir de la membrane en digérant les protéines à la protéinase K laissant un polypeptide restant à la réticulation de nucléotides (étape 9). La transcription inverse (RT) tronque le polypeptide restant et introduit deux régions adaptateur clivables et des séquences de codes à barres (étape 10). Sélection taille supprime sans apprêt RT avant circularisation. La linéarisation suivante génère des modèles appropriés pour l'amplification par PCR (étapes 11-15). Enfin, séquençage à haut débit génère lit dans lequel les séquences de codes à barres sont immédiatement suivis par le dernier nucléotide de l'ADNc (étape 16). Depuis ce nucléotide localise une position en amont du nucléotide réticulé, le site de liaison peut être déduite à haute résolution. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Autoradiographie d'réticulé hnRNP C-ARN complexes en utilisant l'électrophorèse sur gel dénaturant et transfert sur ​​membrane. hnRNP C-ARN étaient complexes immuno-purifié à partir d'extraits cellulaires utilisant un anticorps contre hnRNP C (α hnRNP C, les échantillons 3 et 4). L'ARN a été partiellement digéré avec faible (+) ou haute (+ +) concentration de RNase. Complexes déplacer vers le haut de la taille de la protéine (40 kDa) peuvent être observés (échantillon 4). Le décalage est moins prononcée lorsque de fortes concentrations de RNase ont été utilisés (échantillon 3). Le signal radioactif disparaît lorsque aucun anticorps a été utilisé dans l'immunoprécipitation (échantillons 1 et 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Schéma 6% TBE-urée gel (Invitrogen) pour guider l'excision des produits iClip ADNc. Le gel est géré pendant 40 min à 180 V conduisant à un modèle de migration reproductible des ADNc et des colorants (la lumière et bleu foncé) dans le gel. Utilisez une lame de rasoir pour couper (ligne rouge) du haut (H), moyenne (M), et faible (L) des fractions d'ADNc. Commencez par couper au milieu du colorant bleu clair et immédiatement au-dessus de la marque sur la cassette de gel en plastique. Diviser les fractions moyennes et basses et les garnitures de la fraction haute d'environ 1 cm au-dessus du colorant bleu clair. Utilisez des coupes verticales guidé par les poches et le colorant de séparer les différentes voies (dans cet exemple 1-4). La voie de marqueur (m) peut être teinté et imagé pour contrôlertailles après la coupe. Fragment tailles sont indiquées sur la droite. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Analyse des bibliothèques iClip amplifiée par PCR d'ADNc en utilisant l'électrophorèse sur gel. L'ARN récupéré de la membrane (figure 1) était une transcription inverse et la taille purifié par électrophorèse sur gel dénaturant (figure 2). Trois fractions granulométriques de l'ADNc (haute [H]: 120-200 NT, moyenne [M]: 85-120 nt et basse [L]: 70-85 nt) ont été récupérés, circularisé, re-linéarisé et amplifiée par PCR. Les produits de PCR de la distribution de tailles différentes peuvent être observées en raison des différentes tailles des fractions d'entrée. Depuis l'amorce de PCR introduit 76 nt à l'ADNc, tailles devrait se situer entre 196 à 276 nt pour élevée, de 161 à 196 nt pour les moyennes et 146-161 nt pour des fractions de faible taille. Les produits de PCR sont absents lorsque aucun anticorps a été utilisé pour l'immunoprécipitation (pistes 1-3).

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Depuis le protocole de iClip contient un large éventail de réactions enzymatiques et des étapes de purification, il n&#39;est pas toujours facile d&#39;identifier un problème quand une expérience échoue. Afin de contrôler la spécificité de l&#39;ARN identifiés réticuler des sites, un ou plusieurs contrôles négatifs doivent être maintenues tout au long de l&#39;expérience complète et des analyses ultérieures de calcul. Ces contrôles peuvent être l&#39;échantillon ne-anticorps, les cellules non-réticulés, ou immunoprécipitation à partir de cellules ou de tissus KO. Idéalement, ces expériences de contrôle ne doit pas purifier tout complexes protéines-ARN, et ne devrait donc pas émettre de signal sur le gel SDS-PAGE, et aucun produit détectable après amplification par PCR. Séquençage à haut débit de ces bibliothèques de contrôle devrait revenir très peu de séquences uniques. Knockdown cellules ne sont pas recommandés comme un contrôle séquençage, puisque les séquences résultantes correspondent toujours à liaison croisée des sites de la même protéine, qui est purifiée à partir de cellules knockdown en plus petites quantités. Des précautions doivent également être prises pour éviter toute contamination avec les produits de PCR à partir d&#39;expériences antérieures. La meilleure façon de minimiser ce problème est de séparer spatialement les étapes pré-et post-PCR. Idéalement, l&#39;analyse des produits de PCR et de toutes les mesures ultérieures doivent être effectuées dans une pièce séparée. Par ailleurs, chaque membre du laboratoire devrait utiliser son propre ensemble de tampons et d&#39;autres réactifs. De cette façon, les sources de contamination peuvent être facilement identifiés.

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Pour électrophorèse sur gel et transfert sur membrane, nous recommandons l&#39;utilisation de t-il XCell SureLock ® Mini-Cell et XCell II ™ Blot Module Kit Marque CE (Invitrogen, EI0002), qui est compatible avec l&#39;utilisation de la minigels préfabriqué différents qui sont spécifiés dans le protocole de . Le nombre de marques et de l&#39;ordre de tous les matériaux utilisés est mentionné au cours du protocole. La liste des enzymes utilisées dans le protocole est indiqué dans le tableau ci-dessous. <table border="1"><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Protéine A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> l&#39;utilisation de protéine G pour les anticorps de souris ou de chèvre </td></tr><tr><td> RNase I </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> l&#39;activité peut changer d&#39;un lot à </td></tr><tr><td> T4 ARN ligase I </td><td> ONE </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> ONE </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> protéinase K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Exposant III de la transcriptase inverse </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentre </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ SuperMix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> ce mélange de PCR donne les meilleurs résultats dans nos mains </td></tr></table>

iclip - transcriptome à l&#39;échelle de cartographie des protéines-arn interactions avec résolution nucléotides individuels

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

La composition unique et la disposition spatiale des protéines liant l&#39;ARN (pratiques commerciales restrictives) sur une transcription guider les divers aspects de la régulation post-transcriptionnelle 1. Par conséquent, une étape essentielle vers la compréhension règlement transcription au niveau moléculaire est d&#39;obtenir des informations de position sur les sites de liaison des pratiques commerciales restrictives 2. Interactions protéines-ARN peut être étudiée par des méthodes biochimiques, mais ces approches ne tiennent pas compte liaison à l&#39;ARN dans son contexte cellulaire native. Les premières tentatives pour étudier des protéines-ARN complexes dans leur environnement cellulaire employée purification par affinité ou immunoprécipitation combinée avec l&#39;affichage différentiel ou de l&#39;analyse des microréseaux (RIP-CHIP) 3-5. Ces approches ont été enclins à identifier les interactions indirectes ou non physiologiques 6. Afin d&#39;accroître la spécificité et la résolution de position, une stratégie appelée CLIP (UV réticulation et immunoprécipitation) a été introduit 7,8. CLIP combine réticulation UV des protéines et des molécules d&#39;ARN avec des schémas de purification rigoureux, y compris l&#39;électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant. En combinaison avec les technologies de séquençage à haut débit, CLIP a prouvé qu&#39;il était un outil puissant pour étudier les interactions protéines-ARN à l&#39;échelle du génome entier (dénommé HITS-CLIP ou CLIP-seq) 9,10. Récemment, PAR-CLIP a été introduit qui utilise des analogues ribonucléoside photoréactif pour la réticulation 11,12. Malgré la grande spécificité des données obtenues, des expériences CLIP génèrent souvent des banques d&#39;ADNc de la complexité de séquence limitée. Ceci est partiellement dû à la quantité limitée de co-ARN purifié et les deux inefficaces réactions de ligature ARN nécessaires à la préparation de la bibliothèque. En outre, les analyses d&#39;extension d&#39;amorces ont indiqué que de nombreux ADNc tronquent prématurément à l&#39;réticulé 13 nucléotides. Ces ADNc tronqués sont perdus pendant le protocole de préparation CLIP bibliothèque standard. Nous avons récemment développé iClip (CLIP résolution individuelle de nucléotides), qui capte l&#39;ADNc tronqués en remplaçant l&#39;une des étapes intermoléculaires inefficaces ligature d&#39;ARN avec une circularisation plus efficace ADNc intramoléculaire (figure 1) 14. Surtout, le séquençage des ADNc tronqués fournit un aperçu de la position du site de liaison croisée avec une résolution de nucléotides. Nous appliquée avec succès pour étudier l&#39;organisation iClip hnRNP particules C sur une échelle du génome entier et d&#39;évaluer son rôle dans la régulation 14 d&#39;épissage.

L&#39;arrangement spatial des protéines liant l&#39;ARN sur une transcription est un déterminant clé de la régulation post-transcriptionnelle. Par conséquent, nous avons développé différents nucléotides réticulation UV résolution et immunoprécipitation (iClip) qui permet précisément l&#39;échelle du génome de cartographie des sites de liaison d&#39;une protéine liant l&#39;ARN.

iClip - transcriptome à l&#39;échelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels

La composition unique et l'agencement spatial des protéines de liaison à l'ARN (RBP) sur un transcrit guident les divers aspects du contrôle post-transcriptionnel...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir une carte à l'échelle du transcriptome des sites de fixation d'une protéine liant l'ARN, avec une résolution au niveau du nucléotide individuel. Cela est réalisé par une irradiation aux UV de cellules vivantes afin de réticuler de façon covalente les protéines et l'ARN in vivo, lors d'une deuxième étape. La protéine liant l'ARN est purifiée par immunoprécipitation dans des conditions rigoureuses afin de récupérer les fragments d'ARN réticulés.La transcription inverse suivante génère des ADNc qui se tronquent souvent au niveau du peptide fixé, préservant ainsi l'information sur la position du pontage croisé au sein de l'ARN. Les résultats obtenus montrent tous les sites de fixation présents dans le transcriptome, grâce au séquençage à haut débit de la bibliothèque d'ADNc. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie de l'ARN, comme la manière dont l'interaction entre différentes protéines liant l'ARN régule le traitement de l'ARN. Le principal avantage de cette technique est que nous améliorons à la fois les performances et la résolution de nos cartes à l'échelle du transcriptome des interactions protéine-ARN. Pour commencer la procédure de pontage croisé par UV sur des cellules en culture tissulaire.Retirer le milieu d'une plaque de 10 centimètres contenant des cellules healer. Ajouter six millilitres de PBS glacé et placer les plaques sur de la glace. Une plaque suffit pour trois expériences.Retirez le couvercle et irradiez les cellules, une fois à 254 nanomètres avec 150 millijoules par centimètre carré. Récoltez les cellules en les grattant depuis les plaques à l’aide d’un grattoir, puis transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans chacun de trois tubes microcentrifugés afin de former un culot cellulaire. Faites-les centrifuger à vitesse maximale pendant 10 secondes à quatre degrés Celsius.Ensuite, retirez le surnageant, congélez les culots cellulaires sur de la glace sèche et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Ajoutez 100 microlitres de protéine, une dynamique de billes par expérience, dans un nouveau tube microcentrifuge. Si vous travaillez avec des anticorps de souris ou de chèvre, utilisez des billes dynamiques de protéine G.Lavez les billes deux fois avec le tampon de lyse, disponible dans le protocole écrit accompagnant. Resuspendez les billes dans 100 microlitres de tampon de lyse contenant deux à 10 microgrammes d'anticorps. Incubez le tube en rotation à température ambiante pendant 30 à 60 minutes.Ensuite, lavez les billes trois fois avec 900 microlitres de tampon de lyse et laissez-les dans le dernier lavage jusqu'à ce que vous soyez prêt à poursuivre. Pour l'immunoprécipitation, placez la cellule Thor sur de la glace. Resuspendez dans un millilitre de tampon de lyse et transférez dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Préparez une dilution de un à 500 de l'ARN un. Ajoutez ensuite 10 microlitres, ainsi que deux microlitres de Turbo ADN, au lysat cellulaire. Incubez les échantillons exactement trois minutes à 37 degrés Celsius, sous agitation à 1 100 tours par minute, puis transférez immédiatement sur de la glace.Ensuite, centrifuger les échantillons à quatre degrés Celsius et à 22 000 ×g pendant 20 minutes pour clarifier le lysat ; collecter soigneusement le surnageant, en laissant environ 50 microlitres de lysat avec le culot afin de précipiter les billes par immunoprécipitation. Éliminer le tampon de lavage, puis ajouter les lysats cellulaires préparés. Agiter les échantillons par rotation pendant deux heures à quatre degrés Celsius.Jetez l'agent SUP et lavez les billes deux fois avec 900 microlitres de tampon à haute force ionique, disponible dans le protocole écrit joint. Enfin, lavez les billes deux fois avec 900 microlitres de tampon de lavage. Procédez ensuite à la déphosphorylation et ajoutez un linker aux extrémités trois primes de l'ARN.Pour marquer les extrémités 5' de l'ARN, travailler derrière un écran en plexiglas. Éliminer le surnageant du dernier lavage de la réaction de ligation du linker et resuspendre les billes dans huit microlitres de mélange chaud de PNK. Incuber cinq minutes à 37 degrés Celsius.Retirer le mélange chaud de PNK et réutiliser. Suspendre les billes dans 20 microlitres de tampon de charge new page à une fois. Incuber ensuite l'échantillon dans un mélangeur thermique à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes.Placer immédiatement l'échantillon sur un aimant pour précipiter les billes vides. Charger les échantillons sur un gel Biss de 4 à 12 % new page, conformément aux instructions du fabricant.Également, charger cinq microlitres d'un marqueur de taille protéique précoloré. Faire migrer le gel pendant 50 minutes à 180 volts. Transférer les complexes protéine-ARN du gel vers une membrane de nitrocellulose à l'aide de l'appareil de transfert humide NOVA, conformément aux instructions du fabricant.Après le transfert, rincez la membrane dans du tampon PBS. Ensuite, enveloppez-la dans du film plastique et exposez-la à un film à moins 80 degrés Celsius. Effectuez des expositions de 30 minutes, une heure et toute la nuit.Ensuite, isolez la région de la membrane contenant les complexes protéine-ARN à partir des faibles concentrations d'ARN. Réalisez l'expérience en utilisant l'autoradiographie comme masque. Récupérez l'ARN de la membrane par digestion à la protéinase K et extraction au phénol-chloroforme.Transcrire en sens inverse l'ARN en utilisant un des amorces AYP afin de purifier l'ADNc sur gel. Mélanger six microlitres d'échantillon d'ADNc avec six microlitres de tampon de charge urée TBE deux fois concentré. Juste avant de charger les échantillons sur un gel.Chauffez les échantillons à 80 degrés Celsius pendant trois minutes. Ensuite, chargez les échantillons sur un gel d'urée TBE 6 % préfabriqué, accompagné d'un marqueur de poids moléculaire faible. Faites migrer le gel pendant 40 minutes à 180 volts, comme décrit par le fabricant, en utilisant le colorant supérieur et les repères sur le support plastique du gel pour guider l'excision.Découpez trois bandes situées entre 120 et 200 nucléotides, entre 85 et 120 nucléotides, et entre 70 et 85 nucléotides. Notez que l'amorce arc lip et la séquence L trois représentent ensemble 52 nucléotides de la séquence clip. Ajoutez 400 microlitres de tampon TE et broyez le morceau de gel en petits fragments.À l’aide du piston d’une seringue d’un millilitre, incuber les morceaux de gel sous agitation à 1 100 tours par minute pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Placer deux préfiltres en verre d’un centimètre dans une colonne CoStar SpinX. Transférer la partie liquide de l’échantillon dans la colonne et faire tourner pendant une minute à 13 000 tours par minute dans un tube de 1,5 millilitre.Ajouter 0,5 microlitres de glyco blue et 40 microlitres d'acétate de sodium à pH 5,5. Ensuite, mélanger l'échantillon. Ajouter un millilitre d'éthanol à 100 %.Mélangez à nouveau et précipitez l'échantillon pendant toute la nuit à moins 20 degrés Celsius. Enfin, circulairez les molécules d'ADNc afin d'attacher la région adaptateur à l'extrémité cinq prime. Ensuite, recircularisez et amplifiez par PCR selon le protocole écrit joint avant le séquençage de la bibliothèque de fragments oculaires ; la réussite de l'expérience peut être surveillée en deux étapes.L'autoradiographie du complexe protéine-ARN après transfert sur membrane et l'image du gel des produits de PCR sur l'autoradiographie des échantillons à faible teneur en ARN, une radioactivité diffuse doit être observée au-dessus de la masse moléculaire de la protéine pour les échantillons riches en ARN. Cette radioactivité est concentrée plus près de la masse moléculaire de la protéine. En l'absence d'anticorps lors de l'immunoprécipitation, aucun signal ne doit être détecté.Des contrôles supplémentaires importants pour évaluer la spécificité de l'immunoprécipitation consistent soit à émettre un rayonnement UVE, soit à utiliser des cellules qui n'expriment pas la protéine d'intérêt. L'image du gel des produits de PCR doit montrer une gamme de tailles correspondant à la fraction d'ADNc. Notez que les amorces de PCR, P trois Celexa et P cinq Celexa, ajoutent 76 nucléotides supplémentaires à la taille de l'ADNc. En l'absence d'anticorps lors de l'immunoprécipitation, aucun produit de PCR correspondant ne devrait être détecté.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que chacune des 64 étapes est cruciale et doit être effectuée avec une précision absolue. Les données ICL peuvent être intégrées par calcul avec des tests fonctionnels à l'échelle du transcriptome. Cela peut, par exemple, permettre d'obtenir des informations sur la régulation dépendante de la position du traitement de l'ARN.Pour l'analyse informatique des données, nous souhaitons renvoyer à nos publications récentes réalisées en collaboration avec Nicholas KA de l'Institut européen de bioinformatique et bla zupan de l'Université de Liana. Et maintenant, il est temps que vous commenciez vos propres expériences. Amusez-vous bien.

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Apprenez la méthode iCLIP pour cartographier les sites de liaison des protéines ARN à résolution nucléotidique. Cette technique permet d'étudier la régulation post-transcriptionnelle à l'échelle du transcriptome.

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