Name: Léviscération des corps vitré et la rétine de la souris pour les analyses protéomiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Découvrez une technique d'éviscération pour isoler le vitré, la rétine et le cristallin de l'œil de souris. Cette méthode combine dissection précise, centrifugation et analyses protéomiques pour l'étude des tissus oculaires.

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Le financement a été fourni par Fight for Sight et de la recherche pour prévenir la cécité.

1. Une dissection du segment antérieur. <ol><li> Tissus scléral en arrière du limbe est saisi avec une pince de 0,22 et le globe (globe oculaire) est stabilisé. </li><li> Une lame de microchirurgie est utilisé pour faire une incision linéaire dans la cornée de limbe à limbe. </li><li> A 0,12 Colibri pince est ensuite utilisé pour saisir la cornée à l'incision. </li><li> Le fluide de la chambre antérieure est alors absorbée par une lance Weck-Cel chirurgicale. </li></ol> 2. L'éviscération Lens. <ol><li> Une pince 0,12 Colibri saisissant la cornée est utilisé pour stabiliser le monde. </li><li> Un porte-aiguille fine courbe (ou courbes pinces à pansement) est inséré derrière la lentille vers la face postérieure de la planète. Le porte-aiguille est partiellement fermée, et tiré vers l'avant. La pression est appliquée à l'aide de la pince sur la surface externe de la sclérotique, qui pousse la lentille vers l'avant dans l'incision cornéenne, tout en laissant le mur oeil intact. Le vitré apparaît comme un gel translucide et est partiellement adhérente à la lentille. </li><li> Le tissu lentille vitreuse est ensuite placé dans un tube de centrifugation filtrée contenant 20 microlitres de cocktail inhibiteur de protéase (Roche) dissous dans du PBS. </li></ol> 3. L'éviscération rétine. <ol><li> Continuer à stabiliser le globe avec une pince Colibri 0,12 saisir l'incision cornéenne. </li><li> Un porte-aiguille fine courbe (ou courbes pinces à pansement) est placé aussi loin postérieure à la planète que possible, à proximité du nerf optique. Le porte-aiguille est partiellement fermée, et tiré vers l'avant. La pression est appliquée à l'aide de la pince sur la surface externe de la sclérotique, qui pousse vers l'avant de la rétine à travers l'incision cornéenne. Le vitré apparaît comme un gel translucide adhérente à la rétine. La rétine est visualisé comme une jaune, tissu vascularisé. Tout bandes de tissu pigmentées peuvent être décollées avec une pince. </li><li> Le tissu rétine vitreuse est ensuite placé dans le tube à centrifuger filtrée contenant le tissu lentille vitreuse. </li></ol> 4. Filtrée par centrifugation. <ol><li> Le tube de centrifugeuse filtré est placé dans une centrifugeuse de paillasse. Centrifuger à 14000 g pendant 12 minutes. </li><li> Aspirer l'éluant de la chambre inférieure, qui est le corps vitré. La rétine reste dans la chambre supérieure. Ces échantillons peuvent être utilisées pour les études des protéines. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Échantillons vitrifiée été analysées par SDS-PAGE (figure 2). Des échantillons ont également été utilisés pour un test d'activité enzymatique (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Diagramme de l'œil de la souris. Transversale schématique de l'œil humain et de la souris indique le volume vitré relativement petite dans l'oeil de la souris en raison de sa grande lentille. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Unidimensionnelle SDS-PAGE de la souris vitrée et la rétine. Profils protéiques du corps vitré de la souris, 13,6 mg / ml (voie 1), et de la rétine, 11,35 mg / mL (piste 2). L'électrophorèse sur gel a été réalisée à 150 kV pendant 45 minutes, colorées avec du gel Flamingo tache fluorescente et visualisées à l'aide d'un système d'imagerie VersaDoc (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Enzyme superoxyde dismutase activité (SOD) chez la souris et du vitré humain. Mesure de l'activité SOD totale (SOD activité colorimétrique aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) a été réalisée sur vitré et la rétine recueillies par l'éviscération des souris DBA et albinos. Ceci a été comparé à l'activité de la SOD dans le noyau du vitré humain et rétine humaine recueillies post-mortem yeux donneur humain pour déterminer l'activité relative. Non dilué des échantillons de carottes ont été manuellement vitreuse aspiration avec une aiguille de calibre 23, 11 et de la rétine ont été recueillies par la floraison, les yeux et couper le tissu loin du complexe RPE / choroïde. Bien que l'essai ne fait pas de distinction entre les isoformes de SOD, l'activité SOD vitré est susceptible de refléter SOD3, puisque c'est la seule isoforme extracellulaire 12 L'activité de la SOD rétine est susceptible de refléter toutes les isoformes de SOD trois:. Intracellulaires SOD1, mitochondriale SOD2 et extracellulaire SOD3. 12 Pour très sensible dosages enzymatiques, y compris ce test SOD, la possibilité de contamination croisée des protéines est possible et nécessite une étude plus approfondie. Les barres d'erreur représentent SEM.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &amp, Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Ophthalmol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+RS+%22Systematic+evaluation+of+the+mouse+eye%3A+Anatomy%2C+pathology%2C+and+biomethods%22">Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods</a>. , CRC Press. 161-195 (2002).</li>
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<li>Kaarniranta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+Stickler%27s+syndrome%3A+ocular+phenotype+of+mice+carrying+a+targeted+heterozygous+inactivation+of+type+II+%28pro%29collagen+gene+%28Col2a1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1.</a> Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).</li>
<li>Marneros, A. G. &amp, Olsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+iris+abnormalities+in+collagen+XVIII%2Fendostatin+deficient+mice+with+similarities+to+human+pigment+dispersion+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).</li>
<li>Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+persistent+hyperplastic+primary+vitreous+in+mice+lacking+the+arf+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).</li>
<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).</li>
<li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Human+Vitreous+Body+Elements+for+Proteomic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec l&#39;Association pour la Recherche et de la Vision dans la déclaration d&#39;ophtalmologie pour l&#39;utilisation d&#39;animaux à la recherche ophtalmique et Vision.

Les souris transgéniques sont un modèle important pour étudier les maladies de la rétine et vitréo-rétinienne. 6-10 Le corps vitré de la souris, cependant, comporte une proportion significativement plus faible de l&#39;œil en comparaison avec le corps vitré humaine en raison de la grande lentille dans l&#39;oeil de la souris. Cela fait 5 il est difficile d&#39;isoler et de purifier le corps vitré de la souris. Comprendre les changements associés à la protéine du vitré au cours des maladies telles que la rétinopathie diabétique proliférative, la dégénérescence maculaire liée à l&#39;âge, l&#39;uvéite et décollement de la rétine va donner un aperçu des mécanismes par lesquels ils progressent. Ce protocole expérimental visualisés fournit un moyen d&#39;obtenir et de purifier le corps vitré de la souris, tout en maximisant le rendement de protéines pour les analyses enzymatiques et protéomiques.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom </th><th> Société </th><th> Nombre de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver microchirurgie lame </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Beaux-Castroviejo forceps Suture </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri pince </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon centrifuge Filtre Ultracel YM-100 ou YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> Activité SOD Assay Kit colorimétrique </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgicale lances </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Cocktails d&#39;inhibiteurs de protéase </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo fluorescentes gel de coloration </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;éviscération des corps vitré et la rétine de la souris pour les analyses protéomiques

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Alors que la rétine de souris a émergé comme un modèle important génétique pour la maladie rétinienne héréditaire, le vitré de la souris reste à explorer. Le vitré est une matrice extracellulaire fortement aqueux recouvrant la rétine où intraoculaire ainsi que des protéines extra s&#39;accumuler pendant la maladie. 1-3 interactions anormales entre vitré et la rétine sous-tendent plusieurs maladies telles que le décollement de la rétine, rétinopathie diabétique proliférative, l&#39;uvéite et vitréorétinopathie proliférante 1. , 4 Le volume relatif du vitré de la souris est nettement plus petit que le corps vitré de l&#39;homme (figure 1), puisque l&#39;objectif de souris occupe près de 75% de ses yeux. 5 Cela a fait des études biochimiques du corps vitré de souris défi. Dans cet article, vidéo, nous présentons une technique de disséquer et d&#39;isoler le corps vitré de la rétine de souris, ce qui permettra l&#39;utilisation de modèles de souris transgéniques pour définir plus clairement le rôle de cette matrice extracellulaire dans le développement de maladies vitréo-rétinienne.

La technique de dissection illustre l&#39;éviscération du vitré, la rétine et le cristallin de l&#39;oeil de la souris, une séparation par centrifugation, et la caractérisation des dosages de protéines.

L&#39;éviscération des corps vitré et la rétine de la souris pour les analyses protéomiques

Bien que la rétine de souris soit devenue un modèle génétique important pour l'étude des maladies rétiniennes héréditaires, le vitré de souris reste encore à explorer. Le vitré est...

L’œil humain est rempli d’une matrice extracellulaire liquide appelée vitré, tout comme l’œil de la souris. Cet espace est en grande partie occupé par le cristallin. Pour isoler le vitré et la rétine, nous devons d’abord disséquer le segment antérieur, stabiliser l’œil à l’aide de pinces et utiliser une lame extrêmement tranchante pour pratiquer une incision unique à travers la cornée.Une lame émoussée peut déchirer la cornée et nécessiter plusieurs passes. Une éponge en cellules WEX est utilisée pour absorber le liquide dans la chambre antérieure. Les flèches indiquent les endroits où nous comprimerons le cristallin et le vitré avec la pince, fermerons partiellement la pince, puis tirerons vers l'avant.Le cristallin ressemble à une sphère transparente et, juste derrière lui, se trouve le gel vitré. Dans cet exemple, le vitré reste adhérent à l'arrière du cristallin ; pour isoler la rétine, des pinces sont placées plus en arrière, près du nerf optique, puis doucement serrées et tirées vers l'avant. La rétine apparaît comme un matériau jaunâtre et gélatineux.Dans certains cas, la rétine, l'humeur vitrée et le cristallin sortiront sous forme d'un seul tissu. L'étape suivante consiste à isoler et séparer ces trois tissus à l'aide d'un dispositif de filtration par centrifugation. Le morceau de filtre est placé dans la partie supérieure d'un tube einor et nous ajoutons du sérum physiologique tamponné au phosphate.Une fois que chaque tissu est isolé, il est placé dans le puits supérieur contenant le filtre. Les lentilles se trouvent dans le coin supérieur gauche et la rétine avec le corps vitré est située dans le coin inférieur droit. Les tubes sont placés dans une microcentrifugeuse et centrifugés à 14 000 G pendant 12 minutes.Le vitré s'accumulera au fond du tube Eppendorf, tandis que la rétine restera dans la partie supérieure. Nous utiliserons une pince pour séparer le cristallin de la rétine, puis isolerons la rétine de la partie supérieure du puits. Tous ces tissus peuvent être placés dans des tubes Eppendorf, puis traités pour des analyses protéomiques.

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Cette vidéo montre une technique efficace pour différencier et disséquer les différentes structures de semi-transparente du corps humain vitreuse en post mortem yeux.

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Nous avons développé une préparation de tranche horizontale de la rétine adulte de mammifère avec le plan de la coupe parallèle à la surface de la rétine. champs dendritiques des neurones rétiniens orientés nonradially ne sont pas tronquées, permettant l'étude du traitement du signal avec des techniques de patch-clamp et d'imagerie.

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Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. L’histologie, le test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne et l’angiographie par fluorescence sont des techniques précieuses pour comprendre la physiopathologie de la rétine, ce qui pourrait améliorer encore le dépistage efficace des médicaments contre la rétinopathie diabétique.

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