Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

Les virus à ARN utilisent des ARN polymérases codées par le virus lui-même pour répliquer leurs génomes. Ces polymérases présentent intrinsèquement un taux d'erreurs plus élevé, ce qui permet au virus de s'adapter et d'évoluer rapidement. Cette vidéo présente une méthode optimisée permettant de cribler et d'identifier des virus porteurs de mutations dans leur ARN polymérase qui affectent le taux d'erreurs ou la fidélité lors de la réplication.

Des mutagènes sont d'abord appliqués aux cellules hôtes virales afin de déterminer le niveau maximal de mutagène pouvant être utilisé sans tuer les cellules ou inhiber le virus. Une fois les conditions optimales déterminées, le virus est repiqué sous la pression sélective de mutagènes ARN. La population résistante au mutagène est ensuite séquencée pour identifier la mutation responsable.

Ensuite, le mutant résistant au mutagène est isolé. La cinétique de réplication est surveillée et les résultats montrent des augmentations ou des diminutions de la fidélité de la polymérase. Ces observations coïncident avec une résistance étendue aux mutagènes ARN et des modifications de la fréquence de mutation au sein de la population virale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les acides de fidélité biochimique utilisant des polymérases purifiées, est que les techniques mises en œuvre sont valables pour tout virus à ARN pouvant être cultivé en culture tissulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie, comme le rôle de la polymérase dans l'adaptation et l'évolution virale. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car les pressions de sélection qu'elles utilisent sont soit trop fortes, soit trop faibles, et la taille de l'échantillon de séquences analysé ainsi que le nombre de clones n'ont pas été optimisés pour assurer une puissance statistique adéquate.

Commencez cette expérience par la détermination de la gamme de concentrations de mutagènes pouvant être utilisées dans les expériences suivantes sans entraîner la mort cellulaire. Aspirez le milieu de plaques à six puits contenant des monocouches subconfluentes de cellules hilaires. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu supplémenté en mutagène ici, les mutagènes ribavirine, fluorouracile, azacitidine, chlorure de magnésium et chlorure de manganèse étant utilisés.

Incubez les cellules à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, toutes les 24 heures pendant les deux à sept jours suivants, utilisez une plaque de cellules pour vérifier la viabilité par l’exclusion du bleu de triam. À l’aide d’un hémocytomètre, calculez le pourcentage de cellules viables pour chaque concentration de mutagène, y compris les conditions de contrôle non traitées qui entraînent moins de 50 % de mortalité cellulaire au moment du point final de l’infection.

Lorsque les titres maximaux sont atteints, l'étape suivante de la procédure consiste à déterminer la concentration du mutagène qui exercera une pression sélective optimale sans surmutagéniser la population aux concentrations appropriées. Chaque génome est muté à au moins un ou deux emplacements. Le mutagène générera ainsi la mutation de résistance, qui sera ensuite sélectionnée au cours des passages.

Si trop de mutations sont introduites, les mutants portant la mutation de résistance seront eux-mêmes létaux. Le mutagène entrave leur isolement dans des plaques à six puits ensemencées avec nos cellules, en utilisant deux millilitres de milieu supplémenté en mutagène, dans la même gamme de concentrations qu'auparavant, en excluant les concentrations ayant entraîné une mort cellulaire supérieure à 50 %.

Incuber pendant deux heures pour permettre la pénétration du mutagène après l'incubation. Aspirer le milieu et infecter avec le virus à une faible multiplicité d'infection dans 200 microlitres, puis incuber de 15 à 60 minutes pour permettre au virus d'infecter les cellules, en agitant régulièrement la plaque afin de s'assurer que l'inoculum recouvre uniformément la monocouche cellulaire. Aspirer le virus inoculé et laver deux fois avec deux millilitres de PBS pour éliminer autant que possible l'inoculum.

Ensuite, ajouter le milieu contenant le mutagène dans chaque puits et incuber les cellules pendant l'équivalent de trois à six cycles de réplication, généralement deux à sept jours. Récolter le virus de chaque puits et réaliser un dosage standard par plaques ou une dilution limitante afin de déterminer l'effet antiviral sur le titre viral à partir des titres calculés. Identifier la concentration de mutagène qui réduit les titres viraux par rapport à l'infection témoin non traitée de 0,5 à deux ordres de grandeur, tout en n'étant pas fortement toxique pour les cellules.

Idéalement, moins de 50 % de toxicité pour isoler des variants résistants aux mutagènes : commencez par faire passer le virus dans des cellules héliceuses en présence de la concentration optimale de chaque mutagène. Le virus devra peut-être être repiqué jusqu'à 30 fois ; à chaque passage, dosez le virus puis répétez l'infection et l'incubation en présence du mutagène, comme indiqué ici. Les titres viraux des échantillons traités au mutagène devraient diminuer durant les premiers passages par rapport au titre viral initial et aux titres viraux du témoin non traité. Une fois que les titres viraux d'une série donnée atteignent une amplitude comparable à celle des titres viraux du témoin non traité, cela suggère l'apparition d'une résistance.

Extraire l'ARN viral pour le séquençage à l'aide d'amorces amplifiant les gènes de la polymérase ou de la réplicase du virus d'intérêt. Générer un ADNc du génome viral par RT-PCR, puis séquencer l'ADN. Une fois les informations de séquence obtenues.

Utilisez un logiciel d'alignement pour aligner les séquences obtenues avec le consensus de référence et identifier les nouvelles mutations ponctuelles. En outre, examinez les chromatogrammes à la recherche de pics minoritaires qui auraient pu être omis par le logiciel d'alignement. Un mutant représentant 20 à 30 % de la population totale apparaîtra encore comme un pic, mais trop petit pour être reconnu comme un nucléotide mixte lors d'une analyse de séquence standard. Pour identifier la mutation d'intérêt, recherchez des polymorphismes de nucléotide unique qui apparaissent exclusivement dans la population traitée par mutagène par rapport au témoin non traité provenant du même passage, comme illustré ici. Une fois une mutation identifiée, la variante résistante doit être régénérée à partir de l'ADNc infectieux ou isolée en culture tissulaire, et le phénotype de résistance doit être confirmé.

Ici, nous isolons par dosage des plaques afin de purifier les mutants identifiés. Préparez une dilution sériée de l'échantillon résistant à l'azote et ajoutez-la à des monocouches cellulaires dans des plaques à six puits pour un dosage des plaques, après une incubation d'une heure à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. Ajoutez une couche d'agarose deux à cinq jours après l'infection.

La plaque doit être clairement visible. Idéalement, l'une des plaques produira entre 10 et 50 plaques bien séparées. Marquez l'emplacement des plaques sur la boîte à l'aide d'un point, en utilisant un feutre, en prenant soin de ne pas déplacer ou déranger la position du recouvrement, puis plongez délicatement une pointe filtrante P200 à travers le recouvrement d'agar.

Pour atteindre la plaque, soulevez soigneusement l'embout hors du recouvrement et transférez le bouchon d'aros dans un tube de microcentrifugeuse contenant 250 microlitres de milieu. Une quantité suffisante de virus sera transférée, que le bouchon d'aros soit ou non libéré de l'embout. Vortexez le tube et prélevez jusqu'à TenX par traitement ute. Conservez une partie de l'échantillon pour amplifier ultérieurement le virus vivant.

Ensuite, extraire l'ARN à partir du reste de l'échantillon et effectuer une RT-PCR afin d'identifier l'échantillon de plaque contenant la mutation souhaitée. Séquencer l'ADNc. S'assurer qu'il n'y a pas de mutations supplémentaires.

Ensuite, préparez un stock plus important de ce virus pour toutes les études ultérieures. Puis confirmez la résistance conférée par la mutation identifiée. Répétez le test de mutagénèse en utilisant plusieurs conditions mutagènes.

Si la variante est résistante à plusieurs mutagènes, elle possède probablement une fidélité accrue. Étant donné que les mutations modifiant la fidélité sont cartographiées au niveau de la polymérase, il est important de confirmer que la cinétique de réplication n'est pas significativement altérée. Avant de déterminer les fréquences de mutation, examiner la réplication selon au moins deux approches complémentaires.

Par exemple, une approche examinant la production de virus, telle qu'un dosage par plaque ou un TCID 50, peut être réalisée en complément d'une approche analysant la synthèse d'ARN, comme la R-T-P-C-R quantitative ou le northern blot. Ensuite, afin de confirmer que la modification identifiée du polymérase conférant une résistance à la mutagénèse altère la réplication, les fréquences de mutation en fidélité sont mesurées. Cette analyse peut être réalisée soit sur une population de virus viables, soit sur la population totale de virus.

Pour déterminer les fréquences de mutation de la population virale totale, qui comprend des variants viables et non viables, extraire l'ARN et amplifier par RT-PCR une région de 800 à 1 200 nucléotides provenant d'une séquence codante connue pour présenter des variants génétiques, telle que celle codant pour une protéine structurelle. Ensuite, cloner par topo TA le produit purifié pour chaque population virale à étudier. Sélectionner 96 colonies identifiées comme contenant un insert positif par sélection bleu-blanc sur des plaques recouvertes de xga.

Réaliser une PCR sur colonie unique afin de confirmer la validité du criblage bleu-blanc. En utilisant la taille du fragment et les conditions indiquées ci-dessus, environ 90 % des colonies devraient être positives. Pour chaque colonie blanche positive, utiliser un cure-dent pour transférer chaque colonie dans un millilitre de milieu LB dans un 96.

Eh bien, les plaques de culture bactérienne sont incubées toute la nuit à 37 degrés Celsius avec agitation constante. Le lendemain, isolez l'ADN en préparant des miniprélèvements selon un format à 96 puits, puis séquençez chaque plaque avec suffisamment d'amorces pour obtenir une couverture maximale du segment cloné.

Deux amorces couvrant 600 bases devraient suffire. Effectuez l'analyse de séquence à l'aide d'une séquence de référence ou consensus pour chaque population et d'un logiciel d'alignement approprié capable d'identifier facilement les polymorphismes nucléotidiques simples ici. Recherchez le logiciel man de DNA star laser.

Le gène est utilisé en premier pour éliminer les séquences de mauvaise qualité, comme celles présentant des appels de bases incorrects à de nombreuses extrémités ou celles qui sont trop courtes en longueur. Aligner les séquences restantes. Identifier la plage de nucléotides couverte par toutes les séquences dans l'analyse.

Éliminer les clones qui ne sont pas entièrement couverts sur cette région. Pour des raisons de comparaison, il est essentiel que la même région soit entièrement couverte. Identifier et compter les polymorphismes nucléotidiques simples qui diffèrent de la souche de référence.

Calculez la fréquence des mutations en divisant le nombre total de polymorphismes de nucléotides simples par le nombre total de nucléotides séquencés. Présentez ce nombre comme le nombre moyen de mutations par 10 000 nucléotides séquencés. Si le même polymorphisme de nucléotide simple apparaît sur un grand nombre de clones, présentez deux valeurs incluant ou excluant ces mutations répétées.

Déterminer la distribution des mutations. Établir une liste classée par ordre décroissant du nombre de clones dans chaque population présentant 0, 1, 2, 3, etc. mutations dans la région séquencée, selon l'option choisie.

Utilisez les séquences modifiées pour calculer toutes les comparaisons par paires possibles au sein d'un échantillon afin d'obtenir les valeurs moyennes de la diversité des populations. Plusieurs programmes d'alignement sont disponibles ici. Le programme d'analyse génétique évolutive moléculaire, également appelé mega, est utilisé pour déterminer les conditions optimales permettant de sélectionner la résistance à la mutagénèse de l'ARN guérit.

Nos cellules ont été traitées avec des concentrations croissantes de ribavirine et infectées par le virus Cox AKI B de type sauvage à une multiplicité d'infection de 0,01, 48 heures après l'infection. Le virus progéniteur a été récolté et les titres ont été déterminés par TCID50. Ce graphique indique le pourcentage de cellules survivant au traitement sous l'axe des abscisses, déterminé par la coloration au bleu de trypan 48 heures après l'infection.

Les résultats montrent que des concentrations de 100 et 200 micromolaires réduisent le titre viral d'un à deux logarithmes sans affecter la viabilité cellulaire. Pour sélectionner des populations résistantes aux mutagènes, le virus CHI ganga a été propagé dans des cellules hilariales en présence (barres grises) ou en absence (barres noires) de 50 micromolaires de ribavirine ; après chaque passage, la descendance virale a été quantifiée par un dosage classique de plaques sur cellules BHK, comme on peut le voir ici. L'effet mutagène est évident durant les premiers passages, où le titre viral traité a chuté de deux logarithmes.

Progressivement, Titus est revenu à des niveaux normaux non traités. Aucune différence significative n'est observée dans cinq populations traitées par mutagène par rapport aux populations non traitées, ce qui suggère que des variants résistants ont été sélectionnés. En effet, le séquençage a identifié des mutations uniques dans la population virale soumise au traitement par la ribavirine. Afin de confirmer une résistance étendue aux mutagènes ARN de structures différentes, la variante à haute fidélité A 3 72 V du virus COA B trois, initialement isolée lors du criblage, a été testée pour sa sensibilité réduite à différentes concentrations des mutagènes ARN ribavirine, fluorouracile et azacitidine.

He, nos cellules ont été traitées avec les concentrations indiquées de ribavirine et infectées par le virus Cox AKI de type sauvage B à une multiplicité d'infection de 0,01, 48 heures après l'infection. Le virus progéniture a été récolté et les titres ont été déterminés par la CIDT 50. Les résultats présentés ici correspondent aux titres du virus de type sauvage et d'une variante A372 en fonction de la concentration du mutagène. La variante A372 présente systématiquement des titres plus élevés que le type sauvage.

Dans toutes les conditions testées afin de déterminer la cinétique de croissance en une étape de la production virale, nos cellules ont été infectées à une multiplicité d'infection de 10 avec soit la souche sauvage, soit la variante à haute fidélité A372V, soit la variante déficiente pour la réplication CX64 du virus Coxsackie B3. Aux points temporels indiqués, la descendance virale a été récoltée à partir des cellules et des surnageants par cycles de congélation-décongélation et titrée par TCID50. L'augmentation de fidélité de la variante A372V ne coïncide pas avec un défaut de réplication observable en culture tissulaire. La variante CX64 présente un retard significatif dans la cinétique de réplication et atteint des titres maximaux inférieurs de 1000 fois à ceux du virus de type sauvage.

En utilisant l'approche décrite dans cette vidéo, chaque clone séquencé provient d'un génome unique au sein de la population totale de virus et porte donc des mutations uniques. Cette figure montre un alignement typique après le nettoyage des séquences de mauvaise qualité et la visualisation des polymorphismes de nucléotide unique. Le nombre total de polymorphismes de nucléotide unique au sein d'une population est comptabilisé, et le nombre de polymorphismes de nucléotide unique apparaissant sur chaque clone est noté.

Par exemple, le clone souligné par une barre présente deux mutations uniques, tandis que huit autres clones présentent une seule mutation unique. Ces données sont utilisées pour établir un tableau comme celui illustré ici. Le tableau montre la répartition classée des clones séquencés selon le nombre de mutations.

La comparaison statistique de valeurs classées permet de déterminer si une distribution diffère significativement d'une autre. Pour une interprétation plus aisée, les données numériques obtenues à partir de l'analyse de séquences et de l'analyse statistique peuvent être représentées sous forme de graphique ou d'histogramme. Comme illustré ici, le virus A372V produit moins de mutations que le type sauvage et présente une fréquence de mutation significativement plus faible, avec une valeur P inférieure à 0,01.

La même population virale de ganga du poulet donne des fréquences de mutation similaires, que l'on utilise le stock viral ou une dilution 105 fois inférieure pour l'extraction de l'ARN. Après avoir suivi cette procédure, vous pouvez envisager de réaliser des essais biochimiques in vitro ou des études de cristallisation afin de mieux comprendre les bases mécanistiques et structurales de la fidélité de cette variante de polymérase.

Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie pour explorer la corrélation entre la diversité génétique et la capacité d'adaptation du virus in vivo. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'augmenter vos chances d'isoler des variants de fidélité de virus à ARN et de la façon d'utiliser les fréquences de mutation pour identifier ces différences de fidélité.