Préparation E18 neurones de rat corticale compartimentation dans un dispositif microfluidique

Bonjour et bienvenue dans le laboratoire du Dr Newly John. Dans une vidéo précédente, nous avons montré comment nous fabriquons le dispositif neuronique, une plateforme qui permet au chercheur de séparer les corps cellulaires des neurones d'une fraction axonale pure. La lithographie douce est la technique utilisée pour réaliser ces dispositifs, qui consiste à couler et polymériser du PDMS sur une tranche de silicium contenant le design du dispositif, fabriqué précédemment par lithographie optique.

Dans cette vidéo, nous allons démontrer la préparation de neurones corticaux de rat spro dolly E 18, ainsi que la manière de charger les neurones dans le dispositif neuronal. Je souhaite vous présenter Kiana Lee. Elle effectuera les démonstrations aujourd'hui.

Avant de commencer, il est important d'avoir tous les milieux et réactifs nécessaires à 37 degrés dans le bain-marie. Vous pouvez voir le milieu neurobasal, la trypsine à 0,25 % et le DMEM contenant 10 % de SBF. Il est essentiel de s'assurer que tout ce qui sera placé dans la hotte pour être utilisé lors de la manipulation des cellules soit stérilisé et essuyé avec de l'éthanol à 70 %.

Tout d'abord, la hotte de culture cellulaire est nettoyée avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, les supports en plastique utilisés pour maintenir les tubes sont pulvérisés avec de l'éthanol. Puis, la bille en caoutchouc utilisée dans le processus de tristriation est nettoyée à l'éthanol.

Il est important de faire cela dès le début afin que cela ait suffisamment de temps pour sécher. Ensuite, les réactifs nécessaires sont essuyés avec de l'éthanol et placés sous la hotte. Deux morceaux de cortex fœtal de rat E18, provenant d'un seul cerveau précédemment disséqué, sont placés dans un tube de 15 ml contenant un ml de solution de dissection glacée, sans calcium ni magnésium. Un ml de trypsine-EDTA à 0,25 % est ajouté au cortex dans la solution de dissection, portant le volume final à deux ml et la concentration finale en trypsine à 0,125 %. Le tube de 15 ml contenant le cortex, auquel la trypsine a été ajoutée, est ensuite placé dans un bain-marie à 37 degrés pendant huit minutes, tandis que le cortex fœtal s'incube à 37 degrés en présence de trypsine.

Trois pipettes en verre sont polies à la flamme. L'extrémité de la pipette en verre est placée en contact léger avec la flamme, près de sa partie bleue, puis tournée lentement jusqu'à ce que l'ouverture devienne juste orangée. Pendant qu'elle devenait orangée.

Il est important de continuer à faire tourner la pipette en verre afin qu'elle ne s'effondre pas. Remarquez que les orifices des pipettes en verre sont successivement plus petits. Il est également essentiel de ne pas rendre les orifices trop petits, car cela pourrait provoquer la lyse des cellules après que le cortex ait été incubé pendant huit minutes à 37 degrés ; à ce moment-là, 10 ml de DMEM contenant 10 % de FBS sont ajoutés au cortex pour aider à arrêter la réaction de la trypsine.

Le tube de 15 ml contenant le cortex et le DMEM avec 10 % de FBS est centrifugé à 2 500 tr/min pendant deux minutes. Dans la hotte de sécurité, une aspiration sous vide reliée à une pipette en verre est utilisée pour éliminer le surnageant du cortex, en prenant soin de ne pas perturber ni déloger le culot.

Un ml de milieu basal neural contenant du B 27 et du glutamate est ajouté au culot de cortex et pipeté doucement plusieurs fois. Il est très important de ne pas créer de bulles d'air lors de la pipetage, car celles-ci peuvent endommager les cellules par oxydation. Ensuite, la pipette postérieure recuite au feu, présentant l'ouverture la plus large, est utilisée pour triturer le cortex en fixant une poire en caoutchouc stérile à l'extrémité de la pipette et en effectuant environ cinq aspirations et dispensations.

Veiller à ne pas introduire de bulles d'air. Le processus se poursuit avec les deux autres pipettes en verre, chacune ayant une ouverture réduite. Comme indiqué précédemment, il est important de s'assurer qu'aucune bulle n'est introduite durant le processus de tirage.

Vous devriez également remarquer que vous ne voyez plus aucun fragment visible. Il est important de continuer le tri jusqu'à ce que vous ne puissiez plus voir aucun des fragments du cortex dans le milieu. Après cette étape, les cellules sont à nouveau centrifugées à 2 500 tr/min pendant deux minutes.

Ceci correspond à la taille approximative du culot que l'on pourrait obtenir à partir de deux fragments de cortex. Après la centrifugation, le surnageant est à nouveau éliminé du culot cellulaire. Une fois le surnageant retiré, on ajoute un millilitre de milieu neurobasal contenant B27 et du glutamate au cortex, puis on utilise ce milieu pour resuspendre le cortex.

Le culot cellulaire est à nouveau pipeté délicatement de haut en bas afin d'éviter d'incorporer des bulles et de garantir une répartition homogène et une bonne dissociation du culot. Un millilitre supplémentaire de milieu neurobasal est ajouté à la suspension cellulaire, portant le volume final à deux millilitres. Ensuite, la suspension cellulaire est filtrée à l’aide d’un filtre cellulaire BD Biosciences de 40 micromètres avant de compter les cellules et d’évaluer leur viabilité.

60 microlitres de milieu basal neural frais sont placés dans un tube microfuge stérile. Ensuite, 20 microlitres de cellules sont ajoutés aux 60 microlitres de milieu basal neuro, puis finalement, 20 microlitres de bleu de tripan sont ajoutés aux cellules dans le milieu basal neuro. Le bleu de tripan colore les cellules qui ne sont plus vivantes après que les cellules aient été colorées avec le bleu de tripan.

Nous pipetons 20 microlitres sur un cytomètre hématologique et les observons au microscope. Les cellules viables apparaissent claires et translucides, tandis que les cellules dont la membrane est perforée se colorent en bleu en raison du bleu de trypan. Typiquement, nous obtenons environ 2,5 millions de cellules et 8 millions de cellules par cortex.

Nous obtenons habituellement deux échantillons du cortex à partir d'un seul cerveau, les cellules étant resuspendues dans un volume final de deux mils. Ainsi, la concentration finale de cellules se situe généralement entre 2,5 millions de cellules par mil et 8 millions de cellules par mil. Normalement, nous chargeons environ 20 microlitres de cellules par dispositif.

Cela nous donne une gamme de cellules par dispositif comprise entre 50 000 cellules et 160 000 cellules. Les densités cellulaires peuvent être ajustées selon l'application. Toutefois, la mise en culture de neurones primaires à une densité trop faible conduit généralement à la mort cellulaire. Les dispositifs, préalablement préparés et contenant le milieu basal neuronal, sont introduits dans la hotte de sécurité biologique afin de maintenir l’asepsie.

Le milieu excédentaire des puits est éliminé par aspiration sous vide. Toutefois, il faut veiller à ne pas retirer tout le milieu. Il doit rester du milieu dans le canal principal ; aspirez uniquement le milieu des réservoirs.

Seulement 20 microlitres de cellules sont appliqués dans le réservoir supérieur gauche du dispositif. Les cellules s'écoulent dans le dispositif et s'attachent à la surface traitée au PLL. Ici, vous pouvez observer les cellules tandis qu'elles descendent à travers le canal principal, et vous commencerez à en voir certaines effectivement fixées sur le verre.

Après le chargement, les dispositifs contenant les cellules sont replacés dans un incubateur pendant environ 10 minutes afin de permettre l'attachement cellulaire. Après 10 minutes d'incubation, les dispositifs sont de nouveau transférés dans la hotte de sécurité, les réservoirs sont remplis de milieu, puis les dispositifs sont à nouveau placés dans l'incubateur. Certains points importants doivent être notés : selon le type d'incubateur et le niveau d'humidité requis, le milieu peut nécessiter un changement tous les deux à trois jours dans les dispositifs.

Il est recommandé de placer du milieu frais dans les puits supérieurs et de laisser un peu de milieu frais circuler à travers le dispositif et dans les canaux principaux avant de remplir tous les réservoirs. Les neurones sont visualisés ici à l'aide du calcium am, un colorant perméant aux cellules qui marque les cellules vivantes. Ici, vous pouvez voir le compartiment dit ou côté cellulaire du dispositif, qui contient les corps cellulaires, les axones et les dendrites.

En parcourant le dispositif, on peut observer les micros sillons à travers lesquels les axones poussent pour atteindre l'autre côté du dispositif, le côté axonal, qui contient une fraction pure d'axones. À des fins de démonstration, ces cellules marquées de manière fluorescente seront utilisées pour illustrer la procédure d'axotomie.

Une des propriétés du dispositif neuronal est qu'elle permet au chercheur d'effectuer une exotomie, c'est-à-dire de couper les axones à partir de la fraction axonale pure du dispositif, afin de mener des recherches telles que l'étude de la régénération axonale. Keano va maintenant démontrer la réalisation d'une exotomie dans le dispositif neuronal ; l'exotomie est réalisée à l'aide d'un vide.

Une pipette en verre stérile est placée à l'ouverture inférieure du puits du côté axonal, et le milieu est aspiré par vide. Tout le milieu est complètement retiré du côté axonal du dispositif, y compris le milieu présent dans le canal principal. Pour répéter le processus après le retrait du milieu, 150 microlitres de milieu sont introduits de force dans le canal principal en plaçant la pointe de la pipette à l'ouverture du canal principal et en appuyant fermement sur la pipette.

Ensuite, on applique un vide à l'ouverture du canal principal et au puits supérieur du côté axonal du dispositif. Le vide est à nouveau utilisé pour éliminer tout le milieu du côté axonal, y compris du canal principal. À nouveau, 150 microlitres de milieu sont introduits de force dans le canal principal en plaçant la pointe de la pipette à l'ouverture du canal principal et en appuyant fermement sur la pipette.

À ce stade, le chercheur peut examiner le dispositif au microscope afin de vérifier l'efficacité de la coupe des axones. Si les axones ne sont pas suffisamment sectionnés, la procédure peut être répétée autant de fois que nécessaire. Dans cette vidéo, nous vous avons montré comment préparer des neurones corticaux fœtaux de rat à J18 et comment les charger dans le dispositif neuronal.

L'avantage principal de ces dispositifs réside dans la possibilité de séparer et de compartimenter la culture des corps cellulaires des neurones d'un côté du dispositif d'une fraction axonale pure de l'autre côté. Nous espérons que cette vidéo vous aura été informative et utile. Voilà donc tout pour cette fois en provenance du laboratoire John.

Merci d'avoir regardé.