Préparation E18 neurones de rat corticale compartimentation dans un dispositif microfluidique

Bonjour et bienvenue dans le laboratoire du Dr.Newly John. Dans une vidéo précédente, nous avons montré comment nous fabriquons le dispositif neuronal, une plate-forme qui permet au chercheur de séparer les corps cellulaires des neurones d’une fraction axonale pure. La lithographie douce est la technique utilisée pour fabriquer les dispositifs, qui consiste à couler et à durcir le PDMS sur une plaquette de silicium contenant la conception du dispositif qui a été précédemment fabriquée à l’aide de la photolithographie.

Dans cette vidéo, nous allons démontrer la préparation des neurones corticaux de rat spro dolly E 18, et comment charger les neurones dans le dispositif neuronal. J’aimerais vous présenter Kiana Lee. Elle fera les démonstrations aujourd’hui.

Avant de commencer, il est important d’avoir tous les milieux et réactifs nécessaires chauds à 37 degrés dans le bain-marie. Vous pouvez voir des milieux neuro-basaux contenant 0,25 % de trypsine et de DMEM contenant 10 % de FBS. Il est important de s’assurer que tout ce qui est placé dans la hotte pour être utilisé pour réparer les cellules est stérilisé et essuyé avec de l’éthanol à 70 %.

Tout d’abord, la hotte de culture tissulaire est essuyée avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, les supports en plastique utilisés pour maintenir les tubes sont pulvérisés avec de l’éthanol. Ensuite, la balle en caoutchouc utilisée dans le processus de tri striation est nettoyée à l’éthanol.

Il est important de le faire tôt afin qu’il ait suffisamment de temps pour sécher. Ensuite, les réactifs nécessaires sont essuyés avec de l’éthanol et déplacés vers la hotte. Deux morceaux de cortex de rat fœtal E 18 représentant un cerveau précédemment disséqué sont placés dans un tube de 15 ml contenant un ml de tampon de dissection glacé, sans calcium et sans magnésium, un ml de 0,25 % de tripsine EDTA est ajouté au cortex dans le tampon de dissection, portant le volume final à deux moulins et la concentration finale d’essai à 0,125 %. Le tube de 15 ml contenant le cortex avec la trypsine maintenant ajoutée est ensuite placé dans un bain-marie à 37 degrés pendant huit minutes, pendant que le cortex fœtal est en incubation à 37 degrés dans la trypsine.

Trois pipettes à pâte sont polies au feu. La pointe de la pipette en verre est placée juste en contact avec la flamme près de la partie bleue de la flamme, et tourne lentement jusqu’à ce que seule l’ouverture devienne orange. Comme il est devenu orange.

Il est important de continuer à faire tourner la pipette en verre pour qu’elle ne s’effondre pas. Notez que les ouvertures des pipettes en verre sont de plus en plus petites. Il est également important de noter que vous ne voulez pas rendre les ouvertures trop petites, car cela peut provoquer la lyse des cellules après que le cortex ait été incubé pendant huit minutes à 37 degrés avec la trypsine, 10 ml de DMEM contenant 10 % FBS sont ajoutés au cortex pour aider à arrêter la réaction de trypsine.

Le tube de 15 ml contenant le cortex et le DMEM 10 %FBS est centrifugé à 2 500 tr/min pendant deux minutes. Dans l’enceinte de biosécurité, une aspiration sous vide attachée à une pipette en verre est utilisée pour retirer le surnageant du cortex. Veiller à ne pas déranger ou déloger la pastille.

Un ml de milieu basal neural contenant du B 27 et du glutamate est ajouté à la pastille de cortex et doucement pipeté de haut en bas. Il est très important de ne pas créer de bulles d’air lors du pipetage de haut en bas, car les bulles d’air peuvent endommager les cellules par oxydation. Ensuite, la pipette postérieure polie au feu avec l’ouverture la plus large utilisée pour tripoter le cortex en fixant une poire en caoutchouc stérile à l’extrémité de la pipette et en pipetant de haut en bas environ cinq fois.

Veillez à ne pas introduire de bulles d’air. D’accord. Le processus s’est poursuivi avec les deux autres pipettes en verre, chacune avec une taille d’ouverture réduite. Comme indiqué précédemment, il est important de s’assurer qu’aucune bulle n’est introduite pendant le processus de tri striation.

Vous devriez également remarquer que vous ne voyez plus de morceaux visibles. Il est important de maintenir la cote tri jusqu’à ce que vous ne puissiez plus voir aucun des morceaux du cortex dans les médias. Après l’injection, les cellules sont à nouveau fusibées par centrifugation à 2 500 tr/min pendant deux minutes.

C’est à peu près la taille approximative de la pastille que l’on attendrait de deux morceaux de cortex. Après la centrifugation, la supnatine est à nouveau retirée de la pastille cellulaire. Après l’élimination du super natin, un ml de média neurobasal contenant du B 27 et du glutamate est ajouté au cortex et utilisé pour suspendre le cortex.

La pastille cellulaire est à nouveau pipetée de haut en bas avec précaution pour éviter d’ajouter des bulles et s’assurer que la pastille cellulaire est uniformément répartie et brisée. Un mil supplémentaire de milieu neurobasal est ajouté à la suspension cellulaire, portant le volume final à deux mils. Ensuite, la solution de cellules en suspension est filtrée à travers une passoire de cellules de 40 microns de BD biosciences pour compter les cellules et évaluer la viabilité.

60 microlitres de milieu basal neural frais sont placés dans un tube de micro-fuge stérile. 20 microlitres de cellules sont ensuite ajoutés aux 60 microlitres de milieu neurobasal, et enfin, 20 microlitres de bleu trian sont ajoutés aux cellules du milieu neurobasal. Le bleu trian colore les cellules qui ne sont plus vivantes après que les cellules aient été colorées au bleu trian.

Nous pipetons 20 microlitres sur un hémocytomètre et les observons au microscope. Les cellules viables apparaissent claires et translucides tandis que les cellules dont les membranes sont perforées sont bleues en raison du bleu trian. En règle générale, nous obtenons environ 2,5 millions de cellules et 8 millions de cellules par cortex.

Nous obtenons normalement deux morceaux du cortex d’un cerveau avec les cellules remises en suspension dans un volume final de deux mils. Ainsi, la concentration finale de cellules se situe généralement entre 2,5 millions de cellules par mil et 8 millions de cellules par mil. Normalement, nous chargeons environ 20 microlitres de cellules par appareil.

Cela nous donne une plage de cellules par appareil comprise entre 50 000 cellules et 160 000 cellules. Les densités cellulaires peuvent varier en fonction de l’application. Cependant, l’ensemencement de neurones primaires à une densité trop faible conduit généralement à la mort cellulaire.

L’excès de fluide des puits est éliminé par une section sous vide. Cependant, il faut faire attention à ne pas enlever tous les supports. Il doit y avoir des fluides dans le canal principal, ne pas aspirer les fluides des réservoirs.

Seulement 20 microlitres de cellules sont appliqués sur le réservoir supérieur gauche de l’appareil. Les cellules s’écoulent dans l’appareil et se fixent à la surface traitée PLL. Ici, vous pouvez voir les cellules alors qu’elles s’écoulent dans le canal principal, et vous commencerez à voir certaines d’entre elles réellement attachées au verre.

Après le chargement, les dispositifs contenant les cellules sont remis dans un incubateur pendant environ 10 minutes pour permettre aux cellules de se fixer. Après 10 minutes dans l’incubateur, les appareils sont à nouveau amenés dans l’enceinte de biosécurité, et les réservoirs sont remplis de fluides, puis les appareils sont remis dans l’incubateur. Certaines choses importantes à noter, en fonction de l’incubateur et du niveau d’humidité dont le média a besoin, peuvent devoir être changées dans les appareils tous les deux à trois jours.

Il est recommandé de placer des médias frais dans les puits supérieurs et de laisser certains médias frais s’écouler à travers l’appareil et dans les canaux principaux avant de remplir tous les réservoirs. Les neurones sont visualisés ici avec du calcium, un colorant perméable aux cellules qui colore les cellules vivantes. Ici, vous pouvez voir le compartiment so ou le côté cellulaire de l’appareil qui contient les corps cellulaires, les axones et les dendrites.

Lorsque nous nous déplaçons sur l’appareil, vous pouvez voir les micro-rainures à travers lesquelles les axones se développent pour atteindre l’autre côté de l’appareil, le côté axonal, qui contient une fraction axonale pure. À des fins de démonstration. Ces cellules marquées par fluorescence seront utilisées pour illustrer la procédure d’otomie ax.

L’une des propriétés du dispositif neuronal est qu’il permet au chercheur d’effectuer une exatomie qui consiste à couper les axones de la fraction axonale pure du dispositif. Afin de mener des recherches telles que l’étude de la régénération axonale. Keano va maintenant démontrer la réalisation d’une ex-otomie dans le dispositif neuronal, l’ex-otomie est réalisée par un vide.

Une pipette en verre stérile est placée à l’ouverture inférieure du puits du côté axonal, le milieu est aspiré par le vide. Tous les supports sont complètement retirés de la face axonale de l’appareil, y compris les médias du canal principal. Pour répéter le processus après le retrait du support, 150 microlitres de support sont forcés dans le canal principal en plaçant la pointe de la pipette à l’ouverture du canal principal et en appuyant sur la pipette avec force.

Ensuite, le vide est appliqué à l’ouverture du canal principal et au puits supérieur de la face axonale du dispositif. Le vide est à nouveau utilisé pour éliminer tous les milieux du côté axonal, y compris le canal principal. Une fois de plus, 150 microlitres de support sont forcés dans le canal principal en plaçant la pointe de la pipette à l’ouverture du canal principal et en appuyant sur la pipette avec force.

À ce stade, le chercheur peut examiner l’appareil au microscope pour vérifier l’efficacité de la coupe de l’axone. Si les axones ne sont pas suffisamment coupés, le processus peut être répété si nécessaire. Dans cette vidéo, nous vous avons montré comment préparer les neurones corticaux du rack fœtal E 18 et les charger dans le dispositif neuronal.

Le principal avantage de ces dispositifs est la possibilité de séparer et de compartimenter la culture des corps cellulaires neuronaux d’un côté du dispositif d’une fraction axonale pure de l’autre côté du dispositif. Nous espérons que vous avez trouvé cette vidéo informative et utile. C’est donc tout du John Lab.

Merci d’avoir regardé.