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Immunologie
0 vues • 5:45 min • July 8th, 2025
Les lymphocytes T régulateurs, ou Tregs, sont une sous-population spécialisée de lymphocytes T qui exercent des effets immunosuppresseurs pour médier l’homéostasie du système immunitaire. Les Tregs expriment les marqueurs de surface cellulaire CD4, CD25 et Neuropiline 1, Nrp1, et les facteurs de transcription nucléaire forkhead box P3, Foxp3 et Helios.
Pour isoler les Tregs des ganglions lymphatiques drainants pancréatiques de souris, ou PDLN, placez un treillis métallique sur un tube conique. Placez les PDLN sur le grillage et broyez le tissu pour le dissocier mécaniquement. Ajoutez un milieu approprié sur le maillage, en rinçant les cellules dans le tube.
Centrifugeuse, éliminant les cellules mortes et les débris cellulaires. Remettre en suspension les cellules viables dans le milieu. Passez les cellules à travers un capuchon de crépine de cellule monté sur un tube à fond rond pour obtenir une suspension monocellulaire homogène, éliminant ainsi les amas de cellules restants.
Ajoutez des anticorps anti-CD4, anti-CD25 et anti-Nrp1 conjugués au fluorochrome. Les anticorps anti-CD4 et anti-CD25 se lient à leurs antigènes de surface cellulaire respectifs sur les Tregs. Simultanément, l’anti-Nrp1 se lie aux récepteurs Nrp1.
Traiter les cellules avec un tampon de fixation de perméabilisation approprié, en fixant les cellules et en perméabilisant les membranes cellulaires et nucléaires. Ajoutez des anticorps conjugués au fluorochrome ciblant Foxp3 et Helios.
Les membranes perméabilisées permettent aux anticorps de pénétrer dans les cellules et de se lier à leurs cibles intranucléaires respectives. Analysez les cellules à l’aide de la cytométrie en flux.
Les Tregs sont caractérisés par l’expression positive à la surface cellulaire de CD4, CD25 et Nrp1, ainsi que des facteurs de transcription nucléaires Foxp3 et Helios.
Tout d’abord, placez un tube conique de 15 millilitres dans un support. Placez un treillis métallique stérile de 250 micromètres sur le tube. Rincez le filet avec 1 millilitre de RPMI. Ensuite, transférez les ganglions lymphatiques dans le treillis métallique et utilisez une pince à épiler pour les broyer à travers le treillis. Appliquez 1 millilitre de RPMI sur le treillis pour rincer les cellules dans le tube. Répétez ce processus de transfert et de broyage des ganglions lymphatiques trois fois pour chaque échantillon, puis retirez le treillis.
Centrifugez les tubes à 433 x g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans environ 5 millilitres de RPMI, puis remplissez les tubes de RPMI. Répétez ce processus, de la centrifugation des échantillons au remplissage du tube avec du RPMI une fois.
Centrifugez à nouveau les tubes à 433 x g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 2 millilitres de RPMI. Transférez 2 millilitres de suspension cellulaire dans des tubes à fond rond de 5 millilitres avec des capuchons de crépine de cellule.
Tout d’abord, centrifugez la suspension cellulaire des échantillons PDLN à 433 x g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le surnageant. Colorez les cellules avec des anticorps de surface, comme indiqué dans le protocole de texte, et incubez les tubes sur de la glace pendant 40 minutes.
Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon FACS dans chaque tube. Centrifugez à 433 x g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes et jetez le surnageant. Répétez ce processus : en ajoutant le tampon, en centrifugeant et en jetant le surnageant une fois. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de fixation de perméabilisation pour fixer et perméabiliser les cellules.
Transférez les tubes dans un réfrigérateur à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, centrifuger la suspension cellulaire des échantillons PDLN à 433 x g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de lavage par perméabilisation. Centrifugez à nouveau les cellules à 433 x g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes, puis jetez le surnageant.
Colorer les cellules avec des anticorps intracellulaires, comme indiqué dans le protocole textuel. Incuber les tubes sur de la glace pendant 1 heure. Après cela, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage de perméabilisation dans chaque tube. Centrifuger à 433 x g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de lavage de perméabilisation.
Centrifugez à nouveau à 433 x g à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 300 microlitres de tampon FACS. Ensuite, analysez les cellules sur un cytomètre en flux comme indiqué dans le protocole texte.