Homme In Vitro comme outil de dépistage pour la reconnaissance d'un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser un test de suppression humain in vitro pour mesurer la fonction des Treg et éventuellement anticiper une perte future de leur fonction. Cela est réalisé en préparant et en testant d'abord des billes codées, qui seront utilisées comme stimulateurs cellulaires. La deuxième étape consiste à isoler des cellules T naïves CD4 positives CD25 négatives, des cellules T CD4 positives activées in vivo CD25 faibles et des cellules T régulatrices CD4 positives CD25 hautes, puis à irradier les PBMC pour les utiliser comme cellules présentatrices d'antigène ou CPA.

Ensuite, des cultures simples sont établies avec des lymphocytes T naïfs ou activés comme cellules réceptrices et les P BMC comme CPA, ou des cocultures dans les mêmes conditions, mais avec ajout de Treg dans un rapport de un pour dix. La dernière étape consiste à récolter les cellules et à mesurer leur prolifération par incorporation de thymidine tritiée. Les résultats finaux obtenus peuvent démontrer des différences dans la suppression des réponses des lymphocytes T naïfs par rapport à celles des lymphocytes T activés in vivo.

Je m'appelle Jeff Woodcliff. Les cellules T régulatrices n'expriment pas de marqueurs uniques à la surface cellulaire. Par conséquent, afin de mesurer de façon fiable leur fonction, elles doivent être isolées à l'aide de techniques offrant la meilleure séparation.

Le principal avantage de l'utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence par rapport à d'autres méthodes comme l'isolement max, c'est que le fax offre des populations cellulaires pures pouvant être obtenues. La fonction cellulaire peut ensuite être testée de manière fiable dans des tests de suppression in vitro, comme le montre cet exemple. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la fonction des Treg chez des sujets sains et chez ceux atteints de diabète de type 1, elle peut également être appliquée à d'autres maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde humaine, le lupus érythémateux systémique, l'érythémateuse mitose, la sclérose en plaques et d'autres. Pour recouvrir les billes activées par le taal d'anticorps anti-CD3 humain.

Ajoutez un millilitre des billes activées M four 50 provenant du flacon d'origine dans un tube de 1,5 millilitre, puis placez le tube sur un support magnétique jusqu'à ce que toutes les billes adhèrent à la paroi du tube. Ensuite, retirez le tampon des billes en l'aspirant à l'aide d'une pipette, le tube étant toujours sur le support magnétique. Puis retirez le tube du support magnétique et ajoutez un millilitre du tampon un.

Placez le tube sur le support magnétique à plusieurs reprises. Éliminez le tampon pendant que le tube est sur le support magnétique. Resuspendez les billes dans un millilitre de tampon une fois de plus.

Cette fois, ajouter 40 microlitres d'anticorps anti-CD3 humain en plus. Agiter les billes et l'anticorps à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Puis ajouter 0,1 % poids par volume de BSA et continuer à agiter pendant les 16 heures suivantes.

Ensuite, lavez les billes deux fois avec le tampon deux en incubant les billes dans un millilitre de tampon deux pendant cinq minutes à deux à huit degrés Celsius, puis en éliminant le tampon pendant que le tube se trouve sur le support magnétique. Lavez ensuite les billes une fois supplémentaire dans les mêmes conditions stériles.

Cette fois, à l'aide d'un millilitre de tampon trois, tester l'efficacité du revêtement par l'anticorps en ajoutant un nombre variable de billes revêtues de CD trois par cellule afin de déterminer le ratio optimal, et citer en ALI 50 020 à 5 000 PBMC par puits en triple exemplaire dans une plaque de 96 puits. Après 72 heures d'incubation à 37 degrés Celsius, ajouter un microcurie de thymidine tritiée et poursuivre l'incubation pendant les 16 heures suivantes. Récolter les cellules dans une plaque de récolte multipuits ou équivalente.

Ajouter le liquide de scintillation et lire les impulsions par minute ou CPM par puits. À l’aide d’un compteur de scintillation de type Top Count N XT ou équivalent, déterminer le rapport billes-sur-cellules en choisissant celui qui donne un CPM régulièrement supérieur à 5 000, mais inférieur à 15 000 selon notre expérience. Un rapport de trois billes par cellule donne généralement une stimulation optimale tant pour les cellules répondeuses que pour les cellules Treg chez tous les sujets humains testés.

Remplissez un tube conique de 50 millilitres avec 15 millilitres de Ficoll Plus. Effectuez ensuite une dilution au 1/6 de 50 millilitres de buffy coat en ajoutant 250 millilitres de PBS au tube de sang. Superposez lentement 25 millilitres du buffy coat dilué au-dessus du Ficoll en veillant à ne pas perturber les couches.

Centrifuger à 800 × g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Avec le frein désactivé, récupérer soigneusement la couche de PBMC, qui correspond à la phase intermédiaire blanche entre le fial et le tampon. Si nécessaire, racler les cellules sur la paroi du tube.

Attendez quelques minutes et récupérez-les à nouveau à partir de la phase intermédiaire. Transférez les cellules dans de nouveaux tubes de 50 millilitres et lavez-les en remplissant les tubes avec du tampon PBS. Le culot de PBM cs.

Répétez l'étape de lavage deux fois à chaque fois. Combinez deux culots cellulaires dans un même tube, puis regroupez finalement tous les culots cellulaires dans un seul tube de 50 millilitres. Ensuite, utilisez 20 microlitres des cellules en suspension pour déterminer la viabilité cellulaire par exclusion du bleu de trypan.

Testez la génération des CPA en transférant un millilitre des PBMC viables dans un nouveau tube. Ajoutez ensuite quatre millilitres de milieu et irradiez les cellules avec 5 000 rads. Complétez le tube contenant le reste des PBMC avec du tampon PBS. Après avoir centrifugé les cellules à 250 ×g pendant 10 minutes à 4 °C, versez le surnageant et resuspendez les cellules dans quatre millilitres du même mélange.

Ensuite, ajouter 200 microlitres de microbilles Max anti-CD4 aux PBMC et incuber le mélange de cellules et de billes à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l'incubation, laver les cellules dans 40 millilitres de tampon PBS, puis centrifuger les cellules. Puis décantation du surnageant et resuspension des cellules dans huit millilitres de tampon PBS désaéré à température ambiante.

Ensuite, utilisez des filtres de séparation prés pour filtrer et séparer la suspension cellulaire. Puis divisez les PBMCs en deux tubes de 15 millilitres. Ajoutez quatre millilitres des PBMCs dans chaque tube.

Fixez fermement deux colonnes à un séparateur minimax et placez des tubes de collecte sous chaque colonne. Ensuite, ajoutez trois millilitres de tampon PBS DGAs dans chaque colonne ; lorsque plus aucun tampon n’est présent, déposez délicatement l’intégralité de la solution cellulaire de quatre millilitres provenant de chaque tube au-dessus des colonnes, avant que la suspension cellulaire ne s’écoule complètement. Ajoutez trois millilitres de tampon PBS DGAs à température ambiante dans chaque colonne et laissez le tampon s’écouler dans les tubes de collecte.

Ajoutez davantage de tampon jusqu'à ce que le liquide s'écoule clairement. Pipetez cinq millilitres supplémentaires du tampon DGA sur les colonnes LS, puis retirez les colonnes LS du séparateur Minimax. Placez les colonnes dans de nouveaux tubes de collecte stériles de 50 millilitres.

Laisser s'écouler un demi-millilitre, puis expulser lentement le reste du volume, soit environ quatre millilitres. Combiner ensuite les deux fractions CD4 positives. Ajouter ensuite jusqu'à 50 millilitres de PBS dans le tube et dénombrer les cellules après avoir centrifugé les cellules à 400 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Resuspendre les cellules dans deux millilitres de tampon PBS. Combiner les anticorps à utiliser pour la coloration en surface dans un même tube : anti-CD14, CD32, CD116 et, facultativement, anti-CD4. Prélever un aliquot du mélange pour colorer le tube fluorochrome moins un.

Préparez le tube FMO en transférant cinq microlitres de la suspension cellulaire par millilitre dans un tube fax et en colorant les cellules avec deux microlitres du cocktail d'anticorps préparé précédemment. Ensuite, ajoutez des cellules non colorées et des billes revêtues d'IgG de souris à colorer avec un seul fluorochrome dans de nouveaux tubes fax individuels, à utiliser comme témoins de compensation pour le tri cellulaire. Puis ajoutez 50 microlitres d'anti-CD25 humain PE au cocktail et ajoutez le cocktail au reste de la suspension cellulaire.

Incuber les tubes à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir incubé les cellules avec le cocktail d'anticorps, ajouter du tampon PBS aux cellules, puis les centrifuger pour former un culot. Suspendre le culot dans du tampon PBS à une concentration de 10⁷ cellules par millilitre.

Utilisez le tube FMO pour régler le seuil de tri des lymphocytes T CD25 positifs. En utilisant cette stratégie de gating, définissez d'abord un portail autour des cellules FITC négatives afin d'exclure les cellules FITC positives, qui comprennent les monocytes, les macrophages et toutes les autres cellules non T CD4 positives, comme illustré sur cette figure. Sur un graphique distinct, tracez des portails pour les lymphocytes T CD25 négatifs et CD25 faibles, ainsi que pour les cellules Treg CD25 fortes, comme indiqué sur cette figure.

Après l'écoulement, trier les sous-populations cellulaires, centrifuger les tubes de collecte, puis maintenir les lymphocytes T sur de la glace jusqu'au moment de la mise en culture. Étiqueter une plaque 96 puits en U selon le tableau. Suspendre un aliquot de 50 microlitres de billes revêtues de CD3, calculé pour atteindre une concentration de trois billes par cellule répondante par puits, dans un milieu complet contenant 10 % de sérum humain AB poolé dans la plaque 96 puits, puis diluer les CPA préalablement irradiées dans le milieu pour obtenir une concentration de 5 × 10⁵ cellules par millilitre.

Ajoutez 50 microlitres des cellules dans la plaque 96 puits, puis ajoutez 2,5 fois 10 à la puissance quatre cellules T CD4 positif CD25 négatif ou CD4 positif CD25 faible par puits en triplets. Ajoutez les Treg à la rangée B et dans les puits étiquetés « Treg uniquement » de la co-culture dans un rapport de 1 à 10, comme indiqué ici. Incubez ensuite la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec 5 % de CO2 sous humidité saturée pendant 72 heures. Ensuite, pulsez les cellules avec un microcurie de thymidine tritiée, puis poursuivez l'incubation à 37 degrés Celsius pendant les 16 heures suivantes, après incorporation de la thymidine durant les dernières heures de la co-culture.

Utilisez un récolteur de cellules à filtre pour récolter les cellules sur une plaque de récolte multipuits. Ensuite, recouvrez la plaque de récolte d'un couvercle en plastique transparent préalablement rempli d'un liquide de scintillation. Enfin, mesurez les CPM par puits.

À l'aide d'un compteur à scintillations, les sous-populations de lymphocytes T peuvent être isolées avec une grande pureté par ce système, comme le montrent les séries de diagrammes de dispersion suivantes : les cellules T CD4 positif CD25 négatif sont indiquées ici dans la fenêtre inférieure. Sur cette figure suivante, on peut observer des cellules T CD4 positif CD25 faible fortement purifiées. Une population pure de cellules triées par cytométrie en flux CD4 positif.

Les cellules Treg à expression élevée de CD25 sont indiquées dans la fenêtre témoin supérieure. Des cultures pures d'APC et de cellules Treg provenant de sujets sains ont montré peu ou pas de prolifération au-dessus du niveau de fond, mesurée par l'incorporation de thymidine, tandis que les cellules T naïves CD25 négatives et les cellules T activées in vivo CD25 faibles ont présenté une prolifération marquée, laquelle est supprimée lorsque ces types cellulaires effecteurs sont cultivés en co-culture avec des cellules Treg. Bien que de légères différences aient été observées concernant la capacité des cellules Treg à supprimer la prolifération des cellules naïves CD25 négatives et des cellules T activées in vivo CD25 faibles.

Ce n'était pas un contrôle significatif. Les cultures de type cellulaire unique de CPA et de Treg provenant de sujets à risque ont montré peu ou pas de prolifération par rapport au témoin, mesurée par l'incorporation de thymidine. Alors que les cellules T naïves CD25 négatives et les cellules T activées in vivo CD25 faibles présentaient des niveaux de prolifération inférieurs par rapport aux témoins sains.

Les lymphocytes T répondeurs ont été davantage supprimés par les Treg et les cultures co, puisque le test produit des résultats fiables. On peut en outre conclure que des valeurs basses de CPM suggèrent des anomalies potentielles dans la transduction du signal, qui devraient être approfondies dans un autre type d'étude. La différence de capacité des Treg à supprimer les lymphocytes T répondeurs CD25 négatifs par rapport aux lymphocytes T répondeurs CD25 faibles chez les sujets à risque était toutefois significative.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment relier de manière fluide toutes les étapes nécessaires à la réalisation d'un test fonctionnel fiable et réussi pour détecter la présence de lymphocytes T régulateurs chez des sujets sains et chez des sujets présentant des systèmes immunitaires altérés. Par exemple, chez des sujets atteints de diabète de type 1.