Name: Culture à long terme des spécimens humains de cancer du sein et leur analyse en utilisant la tomographie optique de projection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez la culture à long terme de tissus primaires de cancer du sein et leur analyse par tomographie optique de projection. Cette méthode permet de quantifier les patterns d'invasion tumorale tridimensionnelle et d'évaluer les réponses aux médicaments.

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Nous tenons à remercier Lorna Renshaw (Breast Unit Edimbourg) pour son aide précieuse dans l&#39;obtention des échantillons cliniques. Utilisation de matériel tumoral a été approuvé par le comité éthique de la recherche Lothian (08/S1101/41) et obtenu sous les auspices du Centre de médecine expérimentale du cancer de programme (Edimbourg). Ce travail est soutenu par le Conseil écossais de financement. ADL est une Mlle Margaret Butters Reekie confiance moniteur clinique.

1. Extraction du collagène des queues de rat <ol><li> Placez congelés queues de rat frais dans l'éthanol à 70%. </li><li> Deglove la peau recouvrant avec un scalpel, d'exposer les tendons. </li><li> Bande tendons loin de la queue et sa place dans l'éthanol à 70% pour stériliser. </li><li> Peser les tendons collectées et transfert à l'acide acétique (tendon 1g à 250ml d'acide acétique 0,5 M). Mélanger pendant 48 h à 4 ° C. </li><li> Centrifuger le mélange d'acide tendon / acide acétique à 10.000 g pendant 30 minutes et jeter le culot. </li><li> Ajouter un volume égal de 10% (p / v) de NaCl au surnageant et laisser le mélange reposer une nuit à 4 ° C. </li><li> Recueillir les riche en collagène, couche inférieure insolubles et centrifugat pour une autre 30min à 10.000 g. </li><li> Reprendre le collagène matière riche en acide acétique 0,25 M à 4 ° C et on dialyse contre 1:1000 acide acétique à 4 ° C pendant 3 jours, en changeant le tampon de dialyse deux fois par jour. </li><li> En outre stériliser la solution de collagène par centrifugation (20000 g pour 2h) et stocker à 4 ° C. </li><li> Diluer collagène tel que requis par l'ajout de l'acide acétique 1:1000 stériles à une concentration stock de 1mg/ml. </li></ol> 2. Création Assay 3D Le test 3D est basée sur un dosage de la lignée cellulaire, publiés précédemment 2. <ol><li> Biopsies multiples sont récoltées de patients consentants au moment de la résection chirurgicale curative pour cancer du sein invasif. </li><li> Par les yeux, diviser les noyaux en utilisant un scalpel dans 1mm 3 fragments. Trim et jeter le gras macroscopiquement distincts. </li><li> Plongez les morceaux dans les médias MEGM complète. Le tissu peut être stocké dans cet état jusqu'à 1h. </li><li> Pour créer le gel de collagène, mélanger sur glace 1mg/ml collagène de queue de rat, l'acide filtrée 1:1000 acétique, 10x DMEM/F12 et 0,22 M de NaOH dans un rapport de 3:5:1:1 à créer une concentration de collagène finale de 0,3 mg / ml. </li><li> Injecter 1,2 ml de mélange de collagène dans des puits individuels d'une plaque de 24 puits et la placer dans une étuve à 37 ° C pendant 10min pour initier la gélification. </li><li> Après 10min, enlever la plaque de 24 puits de l'incubateur. Placez les morceaux de tumeur sur le collagène de gélification et délicatement les pousser dans le centre du gel en utilisant une pointe 10 ul pipette. Retour de la plaque à 24 puits à l'incubateur pendant 1 heure. </li><li> Pour les tumeurs ER +, supplément MEGM média complet avec β-estradiol à une concentration de 3.2x10 -10 M. Une fois les tests de gel ont gélifié pour 1h, 1,2 ml introduire prudemment des médias complétées dans chaque puits. La finale β-oestradiol concentration dans le dosage sera s'équilibrer à 1.6x10 -10 M de récapituler les niveaux d'oestrogène physiologiques dans les tissus mammaires 3. </li><li> Exécuter une pointe de pipette 10 ul autour du bord intérieur de chaque puits, libérant chaque gel circonférentiellement, permettant ainsi à chaque gel à flotter librement dans les médias. Retour de la plaque à 24 puits à l'incubateur. </li><li> Bourse complété les médias deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'expérience. Fin à l'expérience par la suppression des médias et en ajoutant un fixateur de formol. </li></ol> 3. Coloration des anticorps du dosage dans la préparation de la tomographie optique de projection Nous avons adopté une méthode précédemment publiée pour 4 échantillons coloration entier. <ol><li> Lavez le formol échantillons fixés pendant 30min dans du PBS. Déshydrater les gels par étapes dans le méthanol dilué dans du PBS contenant 0,05% de Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% et 100% pour ≥ 15min à chaque étape. </li><li> Incuber les tissus fraîchement préparés MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 à un ratio de 02:01:03 (15% v / v H 2 O 2) à température ambiante pendant 24 heures pour étancher l'autofluorescence. </li><li> Lavez échantillons à deux reprises pour 30min dans le méthanol. Congeler les échantillons à -80 ° C à cinq reprises au moins 1h à chaque fois et revenir à température ambiante (TA) pour s'assurer que les antigènes dans les parties les plus profondes du tissu sont rendus accessibles. </li><li> Réhydrater les tissus Retour à PBST 0,05% avec du méthanol comme diluant (33%, 66% et 100% pour 15min à chaque étape). </li><li> Bloquer le tissu dans une solution de blocage (10% de sérum dans le PBST 0,05%) pour 24 heures. </li><li> Incuber le tissu avec l'anticorps primaire afin d'identifier le contenu épithéliales, en utilisant de lapin anti-cytokératine à une concentration de 1:500 dilué dans 1,5 ml de solution de blocage contenant 5% de DMSO pour 48h. </li><li> Lavez échantillons quatre fois avec PBST 0,05% pendant 30 minutes chacun. </li><li> Incuber le tissu avec fluorescentes anticorps secondaire (1:100 chèvre anti-lapin Alexa555), dilué dans une solution de blocage 1.5ml contenant du DMSO 5% pour 48h. </li><li> Laver les échantillons à nouveau avec 0,05% PBST quatre fois pendant 30 minutes chacun. </li></ol> 4. Tomographie optique de projection La tomographie optique de projection est une technique de microscopie précédemment développés pour produire des images haute résolution en 3D de spécimens biologiques fluorescentes avec une épaisseur allant jusqu'à 15 millimètres 5. <ol><li> Montez le scontenue dans un gel à 1% d'agarose à faible point de fusion et déshydrater dans le méthanol à 100% pour 24 heures. Effacer le spécimen à Babb solution (01h02 alcool benzylique, le benzoate de benzyle) pour 48h et de numérisation en utilisant le scanner OPT 3001M (Bioptonics). </li><li> Les deux cibles et autofluorescence sont capturés en utilisant l'ensemble Cy3 filtre (l'excitateur 545nm/30 nm, émetteur 610/75 nm) et GFP1 ensemble de filtres (d'excitation 425nm/40 nm, émetteur LP475 nm) respectivement. </li></ol> 5. Reconstruction 3D et la quantification <ol><li> L'ensemble des projections angulaires acquises par l'OPT peut être reconstituée à l'aide du logiciel NRecon (SkyScan) pour créer une série de tranches de section transversale à travers l'analyse d'invasion. Ce logiciel est disponible au téléchargement gratuitement à <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Analyser les données reconstruites en utilisant le logiciel Volocity (PerkinElmer). Logiciel de démonstration gratuite est disponible pour téléchargement à <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> Afin de quantifier le volume épithéliales par coloration cytokératine, fixer un seuil minimum d'intensité de voxels pour réduire les interférences de la fluorescence de fond dans le canal cible. Nous avons défini ce seuil empiriquement à 9000 UA utilisant une liste de paramètres disponibles dans l'application de mesure, nous avons quantifié le volume de l'épithélium en continuité avec le noyau originel (délimitées dans le canal autofluorescente). Cela nous a permis de quantifier les volumes d'excroissance épithéliale entre les différents échantillons tumoraux. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Pendant le développement de l'analyse, un total de 52 cancers du sein biopsies avec une large gamme d'histopathologie ont été utilisés. Parmi ces &lt;10% (5 / 52) a omis de fournir au moins un dosage d'invasion viable. L'échec de dosage a été due à des bactéries soit supra-infection ou d'insuffisance matérielle biopsie tumorale. Par conséquent l'application du test n'est pas limité à un sous-type spécifique de cancer du sein. Dosages typiques (figure 1) fixée au bout de 20 jours en culture de collagène et ensuite colorées pour la cytokératine. Logiciels Volocity est capable de reconnaître à la fois la plus grande partie épithéliale continue avec le noyau originel et les groupes détachés d'envahir les cellules et quantifier chaque volume séparément. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 Invasion des dosages. Après la fixation et à la quantification. Le test prend en charge les échantillons obtenus à partir de plusieurs sous-types de cancer du sein: a) ER + b) HER2 + et c) ER-.

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW et JF sont employés par MRC Technology, qui commercialise des scanners Bioptonics OPT. D&#39;autres auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêt.

À base de collagène essais pour étudier le comportement des lignées cellulaires de cancer sont maintenant largement utilisés 6,7,8. Néanmoins, ces essais n&#39;ont pas reflété pleinement la complexité de la tumeur et son environnement. Dans cette étude, nous montrons que du matériel humain cancer du sein peut être utilisé d&#39;une manière semblable, ex vivo. Par ailleurs, l&#39;OPT est un outil utile pour caractériser l&#39;expansion 3D de cancer du sein. Nous avons constaté que la principale limitation de cette technique est la disponibilité du matériel tumoral (une seule biopsie est suffisant pour 4-6 dosages). Un autre facteur limitatif est que l&#39;invasion de structure ne survient que dans environ 40% des essais. Pour surmonter cela, nous ajoutons régulièrement de tout traitement désiré journée autour de 7 à tous les tests avec une croissance visible. L&#39;utilisation de l&#39;OPT pourrait être étendu à l&#39;avenir également de détecter les changements en vrac, ex vivo, résultant d&#39;un traitement médicamenteux. Ce pourrait à son tour de faciliter le traitement du cancer plus individualisée, indépendante des modèles animaux. Nous étudions actuellement la réponse des tumeurs ER + au tamoxifène ex vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> No de catalogue </td></tr><tr><td> Remplissez MEGM </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-oestradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E8875-250MG </td></tr><tr><td> Lapin anti-cytokératine </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> Chèvre anti-lapin Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> Tous les autres réactifs standard ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich.

culture à long terme des spécimens humains de cancer du sein et leur analyse en utilisant la tomographie optique de projection

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Le cancer du sein est une cause majeure de mortalité dans le monde occidental. Il est bien établi que la propagation du cancer du sein, d&#39;abord localement et plus tard distalement, est un facteur majeur dans le pronostic du patient. Systèmes expérimentaux de cancer du sein s&#39;appuient sur des lignées de cellules généralement tirées de tumeurs primaires ou un épanchement pleural. Deux obstacles majeurs entravent cette recherche: (i) certains sous-types connus de cancers du sein (notamment mauvais pronostic des tumeurs luminales B) ne sont pas représentés dans les collections de la ligne actuelle, (ii) l&#39;influence du microenvironnement de la tumeur n&#39;est généralement pas pris en compte. Nous démontrons une technique pour la culture primaire spécimens de cancer du sein de tous les sous-types. Ceci est réalisé en utilisant trois dimensions du système de culture (3D) dans lequel de petits morceaux de tumeur sont intégrés dans le collagène chez le rat douce, je coussins. Dans 2-3 semaines, la propagation des cellules tumorales dans le collagène et la forme des différentes structures similaires à celles observées dans tumours1 humaine. Adipocytes viables, les cellules épithéliales et les fibroblastes au sein du noyau originel étaient évidentes sur l&#39;histologie. Cellules épithéliales malignes avec une morphologie squamoid ont démontré l&#39;invasion dans le collagène environnant. Pléomorphisme nucléaire était évidente au sein de ces cellules, avec des figures de mitose et de corps apoptotiques. Nous avons utilisé la tomographie optique de projection (OPT), une technologie d&#39;imagerie 3D, afin de quantifier l&#39;ampleur de la propagation de la tumeur dans la culture. Nous avons utilisé l&#39;OPT pour mesurer le volume en vrac de la culture tumeur, un paramètre couramment mesurés durant le traitement néo-adjuvant du cancer du sein pour évaluer la réponse au traitement médicamenteux. Ici, nous présentons une occasion pour les tumeurs du sein de la culture humaine sans sous-type et de quantifier les biais de la propagation de ces ex vivo. Cette méthode pourrait être utilisée à l&#39;avenir afin de quantifier la sensibilité au médicament dans la tumeur d&#39;origine. Cela peut fournir un modèle plus prédictif que des lignées cellulaires utilisées actuellement.

Nous avons développé une base de collagène<em&gt; In vitro</emTest&gt; qui favorise la prolifération et l&#39;invasion à partir d&#39;échantillons de tous les sous-types de cancer du sein. Tomographie optique de projection, une technique de microscopie en trois dimensions a été utilisée pour visualiser et de quantifier expansion de la tumeur. Ce test peut être utilisé pour quantifier la réponse aux médicaments des échantillons tumoraux individuels.

Culture à long terme des spécimens humains de cancer du sein et leur analyse en utilisant la tomographie optique de projection

Le cancer du sein est l'une des principales causes de mortalité dans le monde occidental. Il est bien établi que la propagation du cancer du sein, d'abord localement puis...

L'objectif général de cette procédure est de créer une culture à long terme de tissu cancéreux mammaire primaire et de quantifier le modèle de croissance tridimensionnel. Cela est réalisé en extrayant d'abord la collagène de type I des queues de rat. Ensuite, l'échantillon de biopsie cancéreuse est préparé et inclus dans la matrice de collagène.Après 20 jours de culture, le tissu de cancer du sein est marqué par immunofluorescence et analysé par tomographie par projection optique, puis les données sont reconstruites et quantifiées. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant le schéma d'envahissement de la tumeur d'un individu, qui peut être davantage quantifié par une analyse tridimensionnelle. Le principal avantage des cultures ex vivo est qu'elles utilisent des échantillons tumoraux réels dans un contexte physiologique.Contrairement aux cultures de lignées cellulaires, la démonstration visuelle de cette technique est importante car il est difficile d'obtenir du tissu cancéreux primaire. La technique correcte optimisera les chances d'obtenir un résultat expérimental réussi. Je vais démontrer cette technique avec Joanne Farrell de MRC Technology, afin de commencer l'extraction de collagène de type I.Placer les queues de rat congelées dans de l'éthanol à 70 % jusqu'à décongélation. À l'aide d'un scalpel, retirer la peau superficielle pour exposer les tendons, détacher les tendons de la queue et les placer dans de l'éthanol à 70 % pour les stériliser. Peser les tendons recueillis et les transférer dans de l'acide acétique.Agiter pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifuger le mélange acétique de tendon à 10 000 ×g pendant 30 minutes et éliminer le culot.Ajouter un volume égal de chlorure de sodium à 10 % au surnageant S et laisser le mélange reposer toute la nuit à quatre degrés Celsius. Prélever et éliminer la couche supérieure. Ensuite, recueillir la couche inférieure riche en collagène et insoluble, puis centrifuger pendant 30 minutes à 10 000 ×g.Resuspendre ensuite par gravité le matériau riche en collagène dans de l'acide acétique molaire 0,25 à quatre degrés Celsius et pipeter dans un sac de dialyse. Dialyser contre un à 1000 d'acide acétique à quatre degrés Celsius pendant trois jours.Changer le tampon de dialyse deux fois par jour. Le collagène peut être davantage stérilisé par une autre étape de centrifugation et une suspension dans de l'acide acétique pour ce dosage. Commencer par plusieurs biopsies par emporte-pièce prélevées sur des patients consentants au moment de la résection chirurgicale curative d’un cancer du sein invasif, à l’œil nu et à l’aide d’un scalpel.Divisez le tissu en fragments d'un millimètre cube, retirez et jetez tout tissu adipeux macroscopiquement distinct. Le montage de l'échantillon sur la lame d'un scalpel permet une meilleure visualisation sous la hotte et rend la dissection plus précise et plus sûre. Immergez les fragments dans un milieu MEGM complet.Le tissu peut être conservé dans cet état jusqu'à une heure pour préparer un mélange de gel de collagène à 0,3 milligramme par millilitre. Mélangez sur de la glace du collagène de queue de rat à une concentration de un milligramme par millilitre, de l'acide acétique filtré à une dilution de un sur 1000, du D-M-E-M-F 12 à dix fois et de l'hydroxyde de sodium 0,22 molaire. Pipetez 1,2 millilitre du mélange de collagène dans chaque puits d'une plaque de 24 puits et placez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour initier la gélification, retirez la plaque de l'incubateur.Placer les morceaux de tumeur sur le collagène gélifié et utiliser une pointe de pipette de 10 microlitres pour les enfoncer délicatement au centre du gel. Remettre la plaque dans l'incubateur pendant une heure. Compléter le milieu A-M-E-G-M complet avec du bêta-estradiol jusqu'à une concentration finale de 3,2 fois 10 à la puissance moins 10 molaire.Une fois les tests sur gel terminés après une heure d'incubation, introduisez soigneusement 1,2 millilitre de milieu supplémenté dans chaque puits. La concentration finale en bêta-estradiol s'équilibrera à 1,6 fois 10 à la puissance moins 10 molaire afin de recréer les niveaux physiologiques d'œstrogènes présents dans le tissu mammaire. Passez la pointe d'une pipette de 10 microlitres le long du bord intérieur de chaque puits pour détacher chaque gel de manière circulaire, permettant ainsi à chaque gel de flotter librement dans le milieu.Replacer la plaque 24 puits dans l’incubateur et renouveler le milieu supplémenté deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Une croissance invasive peut être observée en temps réel à l’aide d’un microscope en champ clair ici. Une vidéo en capture avec retard temporel et profondeur de champ étendue montre l’envahissement de l’épithélium depuis le bord de la tumeur vers le collagène environnant, sur une période de 60 heures allant du jour sept au jour neuf.Terminer l'expérience en éliminant le milieu et en ajoutant une formule. Fixer pendant 48 heures pour réaliser une immunomarquage des échantillons de test 3D destinés à la tomographie par projection optique. Transférer d'abord les spécimens fixés au formol des puits vers un flacon.Ensuite, lavez-les pendant 30 minutes. Réalisez une déshydratation progressive des gels à l'aide de méthanol dilué dans du PBS contenant 0,05 % de Tween 20, puis incubez le tissu dans un mélange fraîchement préparé de méthanol, DMSO et peroxyde d'hydrogène à 30 % dans un rapport de deux à un à trois, à température ambiante pendant 24 heures afin de supprimer l'autofluorescence. Ensuite, lavez les échantillons deux fois pendant 30 minutes.Dans du méthanol, effectuez cinq cycles de congélation-dégélation des échantillons, en passant de moins 80 degrés Celsius à la température ambiante, pendant au moins une heure à chaque fois, afin de rendre accessibles les antigènes situés dans les parties les plus profondes du tissu. Réhydratez ensuite le tissu dans du PBS contenant 0,05 % de Tween (T) en utilisant du méthanol comme diluant, incubez le tissu dans une solution de blocage pendant 24 heures à quatre degrés Celsius pour identifier le contenu épithélial, puis incubez les échantillons dans des anticorps primaires de lapin anti-cytokératine dilués dans 1,5 millilitre de solution de blocage contenant 5 % de DMSO pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. Lavez les échantillons dans du PBS contenant 0,05 % de Tween (T) entre 20 et 24 fois, pendant 30 minutes chacun.Incuber le tissu dans des anticorps secondaires fluorescents, dilués dans 1,5 millilitre de solution de blocage contenant 5 % DMSO pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. Laver à nouveau les échantillons dans du PBS avec 0,05 % Tween 24 fois pendant 30 minutes chacun. Pour préparer les échantillons en vue d'une tomographie par projection optique, monter le gel coloré dans de l'agarose à point de fusion bas de 1 % et déshydrater dans du méthanol à 100 % pendant 24 heures.Ensuite, clarifiez l'échantillon dans la solution BABB pendant 48 heures. Analysez les échantillons à l'aide du scanner OPT 3001 M. La cible et l'autofluorescence sont capturées à l'aide des jeux de filtres SI trois et GFP un, respectivement.L'échantillon est fixé dans un cylindre transparent de gel d'aro et tourné par incréments angulaires de 0,9 degré. Une image numérique de l'échantillon fixe est prise à chacune des 400 positions tournées. Utilisez le logiciel n recon pour reconstruire l'ensemble des projections angulaires acquises en OPT en créant une série de tranches en coupe transversale à travers le test d'invasion.Analyser les données reconstruites à l'aide d'un logiciel de vélocimétrie pour quantifier le volume épithélial par la cytokeratine. Coloration, définir un seuil minimal d'intensité de voxel afin de réduire les interférences dues à la fluorescence de fond dans le canal cible. Ici, ce seuil est défini empiriquement à 9 000 unités arbitraires.Enfin, utilisez une liste des paramètres disponibles dans l'application de mesure et les données issues du canal autofluorescent, qui délimite l'épithélium continu avec le noyau d'origine, afin de quantifier le volume d'épithélium dans une prolifération tumorale. Un essai typique, fixé après 20 jours en culture dans le collagène puis coloré pour la cytokeratine, est montré ici. Le logiciel Velocity est capable de reconnaître à la fois la masse épithéliale, continue avec le noyau d'origine, et les groupes détachés de cellules invasives, et de quantifier séparément chaque volume.Les biopsies initiales obtenues provenaient d'une variété de tumeurs après des cultures ex vivo. On pourrait également utiliser d'autres techniques telles que l'immunohistochimie ou l'immunofluorescence pour déterminer les taux de prolifération ou d'apoptose, ou toute mesure similaire. Le développement de cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la recherche translationnelle sur le cancer du sein d'explorer des méthodes permettant d'identifier la résistance aux médicaments chez les personnes atteintes d'un cancer du sein.

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Les protocoles sont décrits pour l'étude de la migration des cellules de cancer du sein, de la prolifération et de la colonisation dans un système de modèle d'expiant de tissu osseux humain.

Méthodes pour explants de tissus en culture fémur humain pour étudier le cancer du sein cellulaire colonisation de la Niche métastatique

Tomographie par cohérence optique (OCT), une technologie d’imagerie en trois dimensions, a été utilisé pour surveiller et caractériser la cinétique de croissance des sphéroïdes multicellulaires de tumeur. Une quantification volumétrique précise des sphéroïdes de tumeur à l’aide d’un voxel comptage approche et la détection de tissu mort exempte d’étiquette dans les sphéroïdes basé sur contraste intrinsèque d’atténuation optique, ont été démontrées.

Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Les cultures tridimensionnelles des spécimens patients de BMPC et des xénogreffes du cancer de la prostate métastatique d'os maintiennent l'hétérogénéité fonctionnelle de leurs tumeurs originales ayant pour résultat des kystes, des sphéroïdes et des organoïdes complexes de tumeur-comme. Ce manuscrit fournit une stratégie d'optimisation et un protocole pour la culture 3D d'échantillons dérivés de patients hétérogènes et leur analyse à l'aide de l'IFC.

Établissement et analyse des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés des spécimens de métastasie osseuse du cancer de la prostate du patient et de leurs Xénogreffes

Les organoïdes dérivés du patient (AOP) sont un outil puissant dans la recherche translationnelle sur le cancer, reflétant à la fois l’hétérogénéité génétique et phénotypique de la maladie et la réponse aux thérapies anticancéreuses personnalisées. Ici, un protocole consolidé pour générer des AOP pour le cancer primaire de la vessie humaine en préparation de l’évaluation des analyses phénotypiques et des réponses médicamenteuses est détaillé.

Culture des organoïdes du cancer de la vessie comme outils de médecine de précision

Nous décrivons un protocole pour la production, la culture et la visualisation des cancers humains, qui ont métastasé aux surfaces péritonéales. Les échantillons tumoraux réséqués sont coupés à l’aide d’un vibratome et cultivés sur des inserts perméables pour une oxygénation et une viabilité accrues, suivis d’une imagerie et d’analyses en aval utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux.

Culture et imagerie de tranches tumorales organotypiques ex vivo de pseudomyxomes péritonei à partir de spécimens tumoraux humains réséqués

Un protocole détaillé est fourni ici pour établir des organoïdes mammaires humains à partir de résections de tumeurs mammaires dérivées de patientes ou de tissu mammaire normal. Le protocole fournit des instructions complètes étape par étape pour la culture, la congélation et la décongélation d’organoïdes mammaires humains dérivés de patientes.

Établissement et culture d’organoïdes mammaires dérivés de patientes

Ce protocole offre un cadre systématique pour l’établissement d’organoïdes du cancer de l’ovaire à différents stades de la maladie et relève les défis de la variabilité spécifique à la patiente pour augmenter le rendement et permettre une expansion robuste à long terme pour des applications ultérieures. Il comprend des étapes détaillées pour le traitement des tissus, l’ensemencement, l’ajustement des exigences en matière de milieux et la coloration par immunofluorescence.

Stratégie de mise en banque d’organoïdes du cancer de l’ovaire : Aborder l’hétérogénéité interpatiente entre les sous-types histologiques et les stades de la maladie

Découvrez la culture à long terme de tissus primaires de cancer du sein et leur analyse par tomographie optique de projection. Cette méthode permet de quantifier les patterns d'invasion tumorale tridimensionnelle et d'évaluer les réponses aux médicaments.

Culture à long terme des spécimens humains de cancer du sein et leur analyse en utilisant la tomographie optique de projection

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