Cartographie inhibitrice circuits neuronaux par balayage laser photostimulation

L’objectif général de cette procédure est d’étudier l’organisation fonctionnelle locale des circuits neuronaux inhibiteurs. La procédure commence par la préparation de coupes de cerveau vivantes du cortex somatosensoriel primaire de souris. L’étape suivante consiste à visualiser et à enregistrer à partir de la GFP ciblée exprimant des types de cellules inhibitrices dans la tranche de cerveau.

Suite à cette photostimulation par balayage laser via le glutamate, le décagement est utilisé pour activer de petits groupes de neurones pré-synaptiques comme excitateurs ou inhibiteurs. Les courants post-synaptiques sont enregistrés dans la GFP exprimant les interneurones. La dernière étape consiste à passer par la photostimulation, l’analyse des données et à générer des cartes quantitatives de l’entrée synaptique des neurones enregistrés.

En fin de compte, la photostimulation à balayage laser combinée à des enregistrements de cellules entières permet de construire des cartes détaillées des entrées synaptiques vers des types spécifiques de neurones inhibiteurs, ce qui peut permettre de déterminer l’organisation et la fonction des circuits corticaux inhibiteurs locaux. La technique basée sur la photostimulation a été mise au point par le Dr Larry Katz, Ned Calloway, et développée par le Dr Carols Waboda, mon pi, le Dr Xing Z a été formé avec le Dr Calloway, l’Institut Salk, où il a dirigé de nombreuses études sur les circuits interoraux. Notre groupe étend et poursuit actuellement ces études, en étudiant les circuits interoraux.

Pour commencer cette procédure, sacrifiez une souris transgénique à deux à trois semaines postnatales par décapitation et retirez rapidement le cerveau, placez le cerveau dans une solution de coupe congelée et oxygénée. Ensuite, utilisez les lunettes GFP pour dépister visuellement le cerveau et vérifier l’expression de la GFP. Ensuite, coupez le cortex somatosensoriel primaire en sections de 400 micromètres d’épaisseur avec un vibromasseur.

Incuber les tranches dans le saccharose contenant un LCR bouillonnant avec 95 % d’O2 et 5 % de CO2 à 32 degrés Celsius pendant 30 minutes à une heure. Après cela, transférez les tranches dans le LCR A ordinaire à température ambiante pour préparer le laser pour l’expérience, allumez le système de refroidissement du laser et l’alimentation électrique. Allumez ensuite tout le matériel lié au contrôle de la photostimulation, y compris le système de miroir à balayage, le modulateur optique et l’obturateur électronique, ainsi qu’un amplificateur d’entrée de photodiode.

Ensuite, allumez les équipements électrophysiologiques tels que l’amplificateur multi-pinces 700 B et les micromanipulateurs. Les enregistrements électrophysiologiques, la photostimulation et l’imagerie sont réalisés dans la chambre de perfusion de la tranche montée sur la platine motorisée du microscope. Après cela, allumez la caméra d’imagerie, la coupe sera visualisée dans le microscope droit avec des optiques infrarouges DIC et épifluorescentes à travers le système d’imagerie.

Ouvrez ensuite le logiciel FS basé sur MATLAB et le logiciel de caméra Q capture sur le moniteur. Avant de lancer l’expérience, vérifiez le système de photostimulation laser et assurez-vous qu’il est en état de marche. Placez une feuille de papier sous l’objectif du microscope quatre x pour observer le motif de balayage laser pendant que le système fonctionne.

Pour fabriquer la micro-électrode avec une résistance de quatre à six méga OM, tirez une électrode en verre avec l’extracteur de pipette. Remplissez ensuite l’électrode avec une solution interne contenant 0,1 % de biotine pour le marquage cellulaire et l’identification morphologique. Ensuite, allumez le système de perfusion sous pression pour pomper un LCR dans la chambre.

Assurez-vous d’un niveau de liquide constant de 2,0 millimètres au-dessus de la tranche dans la chambre. Une aliquote de la solution mère de glutamate en cage MNI est ajoutée à 25 millilitres de LCR A circulant pour une concentration de 0,2 millimolaire de glutamate en cage. Transférez ensuite une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement.

Exécutez le système d’imagerie pour vérifier la qualité de la tranche et localiser anatomiquement la zone somatosensorielle primaire. Ensuite, ancrez la tranche avec un anneau en platine cordé sur mesure, et veillez à ne pas mettre l’ancre sur la région du cerveau destinée à l’enregistrement. Visualisez les cellules avec un objectif 60x basé sur la visualisation de l’expression de la GFP sous un microscope fluorescent DIC.

Identifiez et sélectionnez les types de cellules inhibitrices. Veuillez noter que l’enregistrement sera effectué sous contrôle visuel assisté par un DIC infrarouge. La surveillance vidéo et la commutation entre les modes DIC et fluorescent sont nécessaires pour confirmer l’emplacement de la cellule GFP tout en abaissant l’électrode vers la cellule cible.

En utilisant la technique conventionnelle de serrage par patch. Tout d’abord, appliquez une pression positive sur l’électrode. Placez-le près de la surface cellulaire pour établir une fossette perceptible sur la membrane cellulaire ciblée.

Ensuite, appliquez rapidement une pression négative pour former un joint giga et percez la cellule tout en surveillant les réponses d’injection actuelles sur le moniteur vidéo. Lors de l’effraction, prenez les images de la GFP enregistrée exprimant l’intraneurone à un grossissement de 60 x sous les modes DIC et fluorescent pour la vérification en ligne. Avant de collecter les données de photostimulation, injectez des impulsions de courant hyperpolarisantes et dépolarisantes pour examiner les propriétés électrophysiologiques de base de chaque cellule.

Une fois l’enregistrement stable de cellules entières obtenu avec une bonne résistance d’accès, qui est généralement inférieure à 20 mégaohms, changez l’objectif du microscope d’un grossissement de 60 x à un grossissement de quatre x pour la photostimulation à balayage laser, acquérez une image de coupe à un grossissement de quatre x et utilisez-la pour guider et enregistrer les sites de photostimulation. Réglez les paramètres de photostimulation et d’acquisition de données en activant le module de commutation de configuration de phys. Utilisez une impulsion laser d’une milliseconde d’environ 20 milliwatts avec un intervalle de stimulus d’une seconde.

Pour la cartographie de photostimulation, acquérir des traces de données d’une seconde échantillonnée à 10 kilohertz. Ensuite, chargez l’image de la tranche quatre x dans le module de mappage de phys. Définir l’emplacement du soma et mettre en place les sites de photostimulation d’un motif de 16 par 16 avec 80, micromètre par 80 micromètre.

Espacement autour de l’emplacement de la cellule, qui couvre toutes les couches corticales. Ensuite, cartographiez le profil d’excitation du neurone enregistré en examinant les emplacements de pic en réponse à la photostimulation en mode de pince actuel. Notre logiciel convivial avec des fonctions d’affichage en ligne facilite les expériences de cartographie.

Après cela, cartographiez les connexions du circuit excitateur local en détectant les courants post-synaptiques excitateurs de la cellule enregistrée Avec un balayage laser à différents endroits, maintenez la cellule à moins 70 millivolts en mode pince de tension pour détecter les courants excitateurs vers l’intérieur. Répétez ensuite les cartes de courant post-synaptique excitatoires deux à trois fois avec le modèle de photostimulation tourné ou inversé. Pour cartographier les connexions locales des circuits inhibiteurs, détectez les courants post-synaptiques inhibiteurs de la cellule enregistrée.

Maintenez la cellule à près de zéro millivolt dans ce cas, moins 15 millivolts en mode pince de tension afin de détecter les courants inhibiteurs vers l’extérieur. Après avoir terminé tous les tests physiologiques, retirez doucement l’électrode de la cellule enregistrée. Retirez la tranche de cerveau de la chambre, puis fixez-la dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit, et colorez les cellules enregistrées contre la biotine.

Dans cette expérience, la combinaison de l’expression de la GFP, de l’électrophysiologie intrinsèque et des caractéristiques morphologiques est utilisée pour classer les neurones inhibiteurs. Montré. Voici l’exemple et une carte de données brutes pour illustrer la photostimulation à balayage laser, qui permet une cartographie étendue des connexions du circuit cortical local au neurone inhibiteur enregistré. Voici les exemples de cartes d’entrée quantitatives codées en couleur dérivées des traces brutes qui viennent d’être montrées dans la figure D.Les amplitudes des événements synaptiques détectés dans l’interneurone enregistré sont codées en couleur et superposées topographiquement aux emplacements de photostimulation.

L’emplacement du corps de la cellule est indiqué par le cercle ouvert rouge dans la barre d’échelle. Les couleurs chaudes indiquent de fortes entrées synaptiques et les couleurs froides indiquent une connectivité faible ou inexistante avec la cellule ciblée. De même, la figure E présente le nombre d’événements synaptiques par lieu de décage échantillonné au neurone enregistré.

La figure F montre le temps d’apparition du premier événement synaptique détecté à la cellule enregistrée après la photostimulation dans la barre d’échelle. Les couleurs chaudes indiquent une entrée courte, une latence et des couleurs plus froides indiquent des latences synaptiques plus longues. Ainsi, LSPS permet de construire des cartes détaillées de la position, de la force, de la latence et du nombre d’entrées affectant des types spécifiques de neurones inhibiteurs.

Eh bien, en assistant à cette procédure, il est important d’être patient, de faire des conditions d’expérience propres, mais neurone efficacement et très soigneusement pour passer d’un objet à un grossissement élevé à une faible modification. Ensuite, la dernière utilisation du logiciel foncier très bien.