Quantifier l'activité agoniste à G récepteurs couplés aux protéines

L'objectif général de cette procédure est d'estimer la constante d'affinité relative KB d'un agoniste pour l'état actif d'un récepteur par l'analyse de sa courbe concentration-réponse. Cela est réalisé en mesurant d'abord les courbes concentration-réponse d'un groupe d'agonistes afin d'induire une réponse au niveau d'un récepteur couplé à une protéine G. L'étape suivante de la procédure consiste à estimer les valeurs eemax et EC 50 des agonistes à l'aide d'une analyse de régression non linéaire.

Ces valeurs sont ensuite utilisées pour calculer des estimations initiales des paramètres dans l'analyse de régression non linéaire ultérieure impliquant le modèle opérationnel. Dans une dernière étape, des estimations relatives des constantes d'affinité des agonistes pour l'état actif du récepteur sont obtenues par une analyse de régression non linéaire globale de leurs courbes de réponse en fonction de la concentration. Enfin, en utilisant une forme modifiée du modèle opérationnel, la constante d'affinité d'un agoniste pour l'état actif d'un récepteur, exprimée relativement à celle d'un autre agoniste, peut être estimée par une analyse de régression non linéaire globale de leurs courbes de réponse en fonction de la concentration.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments, par exemple un agoniste possède-t-il une sélectivité pour une voie de signalisation spécifique ? En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés en raison des détails liés à l'analyse mathématique. Pour l'estimation des valeurs relatives de KB d'un agoniste, une série d'au moins deux courbes de concentration-réponse à l'agoniste est requise.

Une discussion sur les considérations relatives à ces expériences est disponible dans le protocole écrit. Après avoir obtenu les courbes de réponse, soustrayez la réponse basale de celle mesurée en présence de chaque concentration d'agoniste, puis commencez à saisir les données issues des expériences de réponse à la concentration dans un tableau de données. Dans le logiciel Prism, toutes les concentrations logarithmiques d'agoniste sont saisies sous la colonne intitulée X. Les mesures de réponse pour l'agoniste présentant la réponse maximale la plus élevée, ou valeur eax, sont saisies dans la colonne A, et celles des autres agonistes sont saisies dans les colonnes adjacentes identifiées par des lettres.

Saisissez les mesures en réplicats des courbes de réponse en fonction de la concentration dans des sous-colonnes d'une colonne désignée par une lettre. Sélectionnez la feuille de graphique sur laquelle les données sont tracées, puis sélectionnez analyser pour analyser les données par régression non linéaire à l'aide de l'équation à pente variable, en contrainte le paramètre « bottom » à zéro, et effectuez l'analyse de régression. Enregistrez les paramètres « top » et « log CE50 » pour les utiliser dans le calcul des estimations initiales des paramètres.

Pour calculer les estimations initiales des paramètres, attribuez la valeur log tau K observée à l'opposé du log EC50 de l'agoniste de référence. Ensuite, calculez la valeur log RAI de chaque agoniste test comme le logarithme du rapport entre le produit de la valeur eemax de l'agoniste test et du EC50 de l'agoniste de référence, et le produit de la valeur emax de l'agoniste de référence et du EC50 de l'agoniste test. Dans cette équation, les paramètres de l'agoniste de référence sont notés avec un apostrophe.

Ensuite, attribuez la constante d'affinité logarithmique de l'agoniste test à l'opposé du logarithme de leurs valeurs EC respectives. Après avoir saisi les données dans Prism, assurez-vous que les données de l'agoniste ayant la valeur EMAX la plus élevée soient entrées dans la colonne A. Cet agoniste est désormais désigné comme l'agoniste de référence, tandis que les autres agonistes sont désignés comme agonistes test. Ensuite, saisissez une équation définie par l'utilisateur, log RAI, dans Prism sur plusieurs lignes.

Dans ce cas, l'équation définie par l'utilisateur implique un total de cinq agonistes. Saisissez les estimations initiales des paramètres du verrou R et de la constante d'affinité des agonistes testés. M sis se voit attribuer la valeur EMAX de l'agoniste standard et M se voit attribuer une valeur de un.

Saisissez maintenant les estimations initiales des paramètres des valeurs de log RAI des agonistes testés. Appliquez les contraintes de paramètres en fixant le log K un à zéro, et en attribuant au log GR, à m, à sis et à M une valeur commune pour tous les jeux de données. Ensuite, lancez l'analyse de régression non linéaire.

Les résultats fournissent les valeurs de log K observé et de log RAI des agonistes testés permettant l'estimation des valeurs d'agoniste KB en unités absolues d'inverse de molaire. Des tests in vitro basés sur des cellules, présentant une activité réceptrice constitutive, sont utilisés. Choisissez les agonistes et concevez l'expérience comme décrit dans le protocole écrit. Calculez l'activité réceptrice constitutive et la réponse à chaque concentration d'agoniste comme étant la réponse mesurée moins la réponse basale dans les cellules non transfectées avec le récepteur. Ici, des réponses à divers agonistes calculées de cette manière sont présentées pour une voie de signalisation présentant une activité constitutive très faible, destinée à une analyse préliminaire.

Tout d'abord, saisissez les données dans Prism comme décrit pour l'activité non constitutive. Validez. Saisissez également la réponse provoquée par l'activité réceptrice constitutive dans les colonnes désignées par les lettres appropriées, sur la ligne correspondant à une concentration logarithmique d'agoniste de moins 20. Ici, un grand logarithme négatif est saisi pour approcher une concentration d'agoniste nulle.

Analysez les données comme précédemment, sauf que pour l'activité constitutive, le paramètre « bottom » doit être contraint de sorte qu'il soit partagé pour tous les jeux de données. Enregistrez le paramètre partagé ainsi que les paramètres « top » et « log EC » pour chaque agoniste. Après avoir déterminé la constante de log affinité de l'agoniste standard dans des expériences séparées, calculez l'estimation initiale de la valeur log K observée de chaque agoniste partiel testé comme le logarithme de l'expression composée de la différence entre la valeur emax de l'agoniste standard et celle de l'agoniste testé, divisée par le produit du EC 50 et de la différence entre la valeur eemax de l'agoniste standard et la réponse constitutive.

Calculez l'estimation initiale du log KB pour chaque agoniste et l'estimation initiale du log T cis afin d'estimer les valeurs KB de l'agoniste. Saisissez les données dans Prism, puis entrez une équation définie par l'utilisateur. Entrez le log KB dans Prism sur plusieurs lignes, comme illustré ici pour la condition de deux agonistes.

Ensuite, saisissez les estimations initiales des paramètres en entrant l'affinité de chaque agoniste. Le log T sis estime le M sis, l'estimation de M sis se voit attribuer la valeur EMAX de l'agoniste standard et M se voit attribuer une valeur de un. Enfin, saisissez les estimations initiales de log kb.

Appliquez des contraintes aux paramètres en fixant log K un à sa valeur précédemment déterminée, et en attribuant à log T sis, m sis et M une valeur commune pour tous les jeux de données. Lancez l'analyse de régression non linéaire. Les résultats fournissent le log KB de l'agoniste standard, le log K observé, ainsi que les valeurs de log KB des agonistes partiels.

La réponse maximale du système, la valeur log T cys pour le complexe du récepteur libre et le facteur de pente du transducteur dans le modèle opérationnel présenté ici correspondent à l'hydrolyse des phosphoinositides induite par un agoniste muscarinique dans des cellules d'ovaire de hamster chinois exprimant de façon stable le récepteur muscarinique M trois. Les courbes de concentration-réponse d'agonistes muscariniques sélectionnés ont été mesurées dans cet essai, et les données ont été analysées comme décrit ici afin d'estimer la valeur KB de chaque agoniste exprimée relativement à celle de l'Oxo Tremaine M. Les courbes théoriques représentent l'ajustement aux moindres carrés de l'équation de régression aux données. Les estimations du log RAI sont indiquées pour la kabale, le recline, la pilocarpine et le McNeil.

Une 3, 4 3. Les estimations correspondantes de la réponse maximale du système et du facteur de pente du transducteur ont été déterminées. Les valeurs de log K observées des agonistes ont également été obtenues pour chaque agoniste indiqué.

Voici les résultats d'expériences sur l'hydrolyse des phosphoinositides stimulée par un agoniste muscarinique dans les cellules HC 2 93. L'expression stable de G alpha 15 et l'expression transitoire du récepteur muscarinique M trois ont entraîné une augmentation de l'hydrolyse basale des phosphoinositides, attribuée à une activité constitutive du récepteur. Les données ont été analysées afin d'estimer les valeurs log KB d'Oxo Tremaine M et de MacNeil, A 3 43.

Les courbes théoriques représentent l'ajustement des moindres carrés de l'équation de régression aux données. Les estimations logarithmiques de KB sont indiquées pour Oxo Tremoring M et McNeil, A 3 43. L'estimation de la valeur K observée pour McNeil A 3 43 a également été déterminée.

Une fois maîtrisée, cette technique d'analyse des données peut être réalisée en quelques minutes si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment estimer à la fois les valeurs KB relatives et absolues à partir des courbes de réponse en fonction de la concentration des agonistes induisant une réponse en aval de la voie de signalisation d'un récepteur couplé aux protéines G.