Prédiction du VIH-1 Utilisation corécepteur (tropisme) par analyse de séquence en utilisant une approche génotypique

L'objectif général de l'expérience suivante est de prédire l'utilisation du co-récepteur du VIH-1 en vue de l'administration d'une nouvelle classe de médicaments antirétroviraux. Cela est réalisé en isolant les acides nucléiques génomiques viraux, ARN viral ou ADN proviral, à partir du sang du patient, après amplification de la région de l'enveloppe. La région V3 virale, qui constitue le principal déterminant du tropisme, est amplifiée par PCR imbriquée.

Ensuite, l'amplicon V trois est séquencé avec des amorces différentes afin de générer un fichier fasta. Les résultats obtenus indiquent le tropisme viral et la sensibilité aux antagonistes du corecepteur, en fonction du taux de faux positifs (FPR) fourni par l'outil en ligne d'interprétation geno to pheno coreceptor. Selon l'utilisation du CORECEPTOR, les virus du VIH sont classés comme R cinq ou X quatre.

Miri rock se lie au récepteur CCR5, inhibant l'entrée des virus R5 dans la cellule cible. Au cours de la maladie, des virus X4 peuvent émerger et supplanter les virus R5. La détermination de l'utilisation du récepteur, également appelée tropisme, est donc obligatoire avant l'administration de maraviroc, comme exigé par l'EMA et la FDA.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une détermination parallèle très facile de la résistance à d'autres classes de médicaments antirétroviraux. Cette méthode ouvre la voie à une médecine beaucoup plus personnalisée, car les seuils de résultats en matière de tropisme peuvent être modifiés selon les besoins du patient. Nous avons eu l'idée de cette méthode au début des années quatre-vingt-dix, lorsque nous souhaitions connaître la base moléculaire des différences de croissance en culture cellulaire des souches de VIH et de l'évolution de la maladie chez les patients, ce qui démontre que la procédure fournira des données à un technicien de notre équipe avant le début de ce protocole.

Les échantillons sont prélevés sous forme de sang avec anticoagulant EDTA sur le site clinique et envoyés au laboratoire afin d'isoler les acides nucléiques du VIH à partir de 1000 microliters de sérum ou de plasma sanguin total, en utilisant le système mag pure compact et le kit d'isolement des acides nucléiques selon les instructions du fabricant. L'ARN ou l'ADN obtenu est ensuite redissous dans 50 microliters de tampon TE. L'étape suivante consiste à amplifier la région de l'enveloppe de l'acide nucléique par PCR en transcription inverse pour l'ARN, ou simplement par PCR pour l'ADN, comme décrit dans le texte ; la réaction doit produire un fragment de 1 245 paires de bases comprenant la majeure partie de la région codant la protéine d'enveloppe. Pour amplifier la région V3 de la protéine d'enveloppe, réaliser une PCR imbriquée (nested PCR) en utilisant cinq microliters de la première réaction de PCR comme matrice.

Préparez les réactions en utilisant le mélange maître pour la PCR interne réalisée en laboratoire, comme décrit dans le texte. Les paramètres de fonctionnement de la PCR interne y sont également indiqués. Après l'amplification de la région V trois, analysez le produit de PCR afin de vérifier la présence du produit attendu de 902 paires de bases de longueur par électrophorèse sur gel avant le séquençage.

Purifiez le produit PCR comme décrit dans le protocole écrit. Une fois le produit PCR purifié, effectuez la réaction de séquençage telle que décrite dans le texte, après l'achèvement de la réaction. Purifiez les échantillons de séquençage à l'aide de Cidex G 50 superfine et d'une plaque filtrante multipuits munie d'une membrane Durapore, en suivant les instructions de la partie écrite de cette procédure. Pour séquencer le produit purifié, préparez le séquenceur en vérifiant le polymère et en changeant le tampon.

Ensuite, chargez les échantillons, réglez les conditions et démarrez l'exécution. Après l'exécution du séquençage, le programme DNA STAR LaserGene peut être utilisé pour aligner et modifier les séquences.

L'amplicon V trois est séquencé avec au moins un amorceur direct et un amorceur inverse. Laser gene aligne les fichiers ABI obtenus à partir du séquenceur avec les séquences de référence. V trois, consensus B et enveloppe laser gene créent une séquence consensus de l'échantillon analysé en utilisant toutes les données brutes disponibles, mais pas les références, et la stockent sous forme de fichier FASTA.

Le fichier FASTA est un fichier texte qui comprend un en-tête avec le nom de l'échantillon et la séquence de nucléotides. Pour commencer l'interprétation des données et la prédiction du tropisme, téléversez le fichier FASTA dans le système d'interprétation en ligne. Geno Tono choisit le seuil FPR jusqu'auquel le virus est classé comme R5.

En utilisant les directives allemandes, le virus est classé comme R cinq lorsque le FPR est supérieur ou égal à 20 %, et comme X quatre lorsque le FPR est inférieur à 12,5 %. Sélectionnez tous les paramètres cliniques supplémentaires disponibles, puis sélectionnez, alignez et prédisez. Ce serveur traduit la séquence nucléotidique en acides aminés, l'aligne avec la séquence consensus V trois B, et fournit une classification en sous-type. En outre, il génère une prédiction de l'utilisation du co-récepteur exprimée sous forme de FPR.

Le résultat présente une interprétation graduée selon la probabilité d'utilisation du co-récepteur. Pour des valeurs élevées de FPR, on est assez certain que le virus n'est pas X4, tandis que pour des valeurs basses de FPR, on ne peut pas déterminer avec certitude le type de virus si l'interprétation, le texte et la couleur d'arrière-plan sont verts. L'administration de Ravi Rock est indiquée comme sûre, tandis que le jaune suggère un risque faible possible d'utilisation de Ravi Rock, et le rouge indique que Ravi Rock ne doit pas être prescrit.

En outre, le serveur génère un rapport au format PDF qui peut être imprimé et envoyé au médecin. Des données supplémentaires, telles que le nom du patient ou la date de prélèvement sanguin, peuvent être ajoutées manuellement à l’aide d’un programme de création PDF. En toute confidentialité sur l’ordinateur de l’utilisateur, des commentaires spécifiques peuvent également être ajoutés.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer les clivages viraux à l’aide de l’outil de récepteur génophénotypique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d’effectuer régulièrement des contrôles de qualité. N’oubliez pas que le travail avec le VIH peut être extrêmement dangereux ; des précautions strictes et des laboratoires biologiques sécurisés autorisés doivent toujours être utilisés.