Prédiction du VIH-1 Utilisation corécepteur (tropisme) par analyse de séquence en utilisant une approche génotypique

L’objectif général de l’expérience suivante est de prédire l’utilisation des corécepteurs du VIH pour l’administration d’une nouvelle classe de médicaments antirétroviraux. Ceci est réalisé en isolant les acides nucléiques génomiques viraux, l’ARN viral ou l’ADN proviral du sang du patient après amplification de la région de l’enveloppe. La région virale V trois, qui est le principal déterminant du tropisme, est amplifiée par la PCR imbriquée.

Ensuite, le V trois amplicon est séquencé avec différentes amorces afin de générer un fichier fasta. On obtient des résultats qui montrent la sensibilité au tropisme viral et aux antagonistes des corécepteurs sur la base du taux de faux positifs ou FPR obtenu par l’outil d’interprétation en ligne du génomètre au phénorécepteur. Selon l’utilisation du CORÉCEPTEUR, les virus du VIH sont classés comme R cinq ou X quatre.

La roche Miri se lie par l’intermédiaire du récepteur CCR cinq, inhibant l’entrée des virus R-cinq dans la cellule cible. Au cours de la maladie, quatre virus peuvent émerger et dépasser les virus R cinq. L’arrêt de l’utilisation des récepteurs, également appelé tropisme, est donc obligatoire avant l’administration de maraviroc, comme l’exigent l’EMA et la FDA.

Le principal avantage de cette technique est qu’il est très facile de déterminer en parallèle la résistance à d’autres classes de médicaments antirétroviraux. Cette méthode permet une médecine beaucoup plus personnalisée, car les seuils pour les résultats de tropisme peuvent être modifiés en fonction des besoins du patient. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode au début des années quatre-vingt-dix lorsque nous avons voulu connaître la base moléculaire des différentes cultures cellulaires, la croissance des souches de VIH et la progression de la maladie chez les patients, en démontrant que la procédure sera donnée par un technicien de notre groupe Avant le début de ce protocole.

Les échantillons sont prélevés sous forme de sang EDTA sur le site clinique et envoyés au laboratoire pour commencer à isoler les acides nucléiques du VIH à partir de 1000 microlitres de sérum ou de plasma de sang total à l’aide du système compact mag pure et du kit d’isolement des acides nucléiques selon les instructions du fabricant. L’ARN ou l’ADN gagné est ensuite évoqué dans un tampon TE de 50 microlitres. L’étape suivante consiste à amplifier la région de l’enveloppe de l’acide nucléique par PCR de transcription inverse pour l’ARN ou simplement par PCR pour l’ADN, comme indiqué dans le texte, la réaction devrait générer un produit long de 1 245 paires de bases comprenant la majorité de la région de la protéine d’enveloppe pour amplifier la région V trois de la protéine d’enveloppe suivie d’une PCR imbriquée en utilisant cinq microlitres de la première réaction PCR comme matrice.

Préparez les réactions à l’aide du mélange maître pour la PCR interne imbriquée, comme décrit dans le texte. Les paramètres d’exécution de la PCR imbriquée y sont également décrits. Après amplification de la région V trois, analyser le produit PCR pour vérifier le produit attendu à une paire de bases de 902 par électrophorèse sur gel avant le séquençage.

Purifier le produit PCR comme décrit dans le protocole écrit. Une fois le produit PCR purifié, effectuez la réaction de séquençage comme indiqué dans le texte à la fin de la réaction. Purifiez les échantillons de séquençage à l’aide de cidex G 50 superfin et d’une plaque filtrante multi-écrans avec membrane durapore en suivant les instructions de la partie écrite de cette procédure pour séquencer le produit purifié, préparer le séquenceur en vérifiant le polymère et en changeant le tampon.

Ensuite, chargez les échantillons, définissez les conditions et démarrez l’exécution. Après l’exécution du séquençage. Le programme de gènes laser DNA STAR peut être utilisé pour aligner et modifier les séquences.

L’amplicon V trois est séquencé avec au moins une amorce avant et une amorce inverse. Le gène laser aligne les fichiers ABI obtenus à partir du séquenceur avec les séquences de référence. V trois, consensus B et le gène laser enveloppe crée une séquence consensus de l’échantillon analysé en utilisant toutes les données brutes disponibles, mais pas les références, et la stocke sous forme de fichier FATA.

Le fichier FASTA est un fichier texte qui comprend un en-tête avec le nom de l’échantillon et la séquence de nucléotides. Pour commencer l’interprétation des données et la prédiction du tropisme, téléchargez le fichier FASTA dans le système d’interprétation en ligne. Le corécepteur Geno Tono sélectionne le seuil FPR jusqu’à lequel le virus est classé R cinq.

En utilisant les directives allemandes, le virus est classé R cinq. Lorsque le FPR est supérieur ou égal à 20 % et que X quatre, lorsque le FPR est inférieur à 12,5 %, sélectionnez tous les paramètres cliniques supplémentaires si disponibles, puis sélectionnez, alignez et prédisez Ce serveur traduit la séquence nucléotidique en acides aminés, l’aligne sur la séquence B consensuelle V trois et produit une classification de sous-type. De plus, il génère une prédiction de l’utilisation des corécepteurs exprimée en FPR.

Le résultat montre une interprétation graduée en fonction de la probabilité d’utilisation du corécepteur. Pour des valeurs FPR élevées, on est tout à fait sûr que le virus n’est pas X quatre et pour un FPR faible, on n’est pas sûr de ce à quoi ressemble le virus si l’interprétation, le texte et la couleur d’arrière-plan sont verts. Une administration sûre pour Ravi Rock est indiquée, tandis que le jaune suggère un risque possible faible pour l’utilisation de Ravi Rock, et le rouge indique que le Ravi Rock ne doit pas être prescrit.

De plus, le serveur génère un rapport PDF qui peut être imprimé et envoyé au médecin. Des données supplémentaires telles que le nom du patient ou la date d’extraction de sang peuvent être incluses manuellement à l’aide d’un programme de rédaction de PDF. Dans le respect de l’intimité de l’ordinateur de l’utilisateur, des commentaires spécifiques peuvent également être ajoutés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer les côtelettes virales à l’aide de l’outil de récepteur génophénophénologique. N’oubliez pas que travailler avec le VIH peut être extrêmement dangereux, donc des précautions et des laboratoires biologiques sécurisés autorisés doivent toujours être utilisés.