Name: Ice-Cap: un procédé de croissance Arabidopsis Et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Apprenez la méthode Ice-Cap pour isoler des échantillons de racines de plantules Arabidopsis thaliana et tomates en plaques 96 puits. Cette technique permet un génotypage à haut débit efficace.

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Ce travail a été financé par une subvention de la National Science Foundation (numéro de subvention MCB-0447750).

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
<li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li>
<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single-nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li>
<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode calotte présentée ici permet à un chercheur pour recueillir des échantillons de tissus provenant de centaines, voire des milliers, des plantes individuelles en une seule journée et efficace d&#39;extraire l&#39;ADN génomique à partir de ces échantillons pour une utilisation dans les réactions de génotypage. En donnant un scientifique de la capacité de déterminer le génotype des milliers de plants dans un court laps de temps, la méthode la calotte glaciaire a le potentiel pour faciliter un certain nombre d&#39;expériences génétiques qui autrement ne seraient pas pratiques à réaliser. Plusieurs exemples sont fournis ci-dessous. <ol><li> Cartographie génétique. Beaux échelle de cartographie génétique peut être accéléré si le chercheur est en mesure d&#39;identifier les événements de recombinaison dans un intervalle précis le long du chromosome 3. Si cet intervalle implique une très courte distance génétique, puis les événements de recombinaison sera relativement rare dans la population de cartographie de ségrégation. Pour cette raison, il peut être nécessaire à des milliers d&#39;écran de plantes individuelles pour trouver le nouveau désiréCombinant les individus. Ce processus pourrait être grandement accéléré par l&#39;utilisation de la calotte glaciaire. Même à l&#39;ère du génome entier de re-séquençage, il est encore nécessaire de démontrer que directement une mutation donnée est directement responsable d&#39;un phénotype d&#39;intérêt. Dans ces cas, il sera nécessaire de séparer la mutation d&#39;intérêt au détriment d&#39;autres mutations étroitement liées, afin de prouver une mutation candidat est effectivement responsable. Dans ces situations, la calotte glaciaire pourrait fournir une méthode efficace pour briser lien entre une paire de mutations étroitement liées. </li><li> Multi-mutants. Il est devenu commun pour les chercheurs qui étudient Arabidopsis pour combiner des allèles mutants de plusieurs loci distincts en un seul individu, afin de surmonter la redondance fonctionnelle 4-6. À titre d&#39;exemple, considérons un cas où l&#39;on souhaite combiner des allèles mutants de quatre loci différents dans une seule plante par croisement génétique. Pour ce projet, il sera nécessaire de générer uneParticulier N qui est hétérozygote à ces quatre loci dans le cadre du régime de passage. Lorsque cette graine quadruple hétérozygote ensembles, l&#39;homozygote quadruple est prévu d&#39;être présent à un taux de un sur 256 dans la population résultant de la descendance. Préalable de cette personne rare par les méthodes traditionnelles serait très laborieux. Par comparaison, en utilisant la calotte glaciaire pour ce projet permettrait au scientifique une stratégie efficace pour identifier les homozygotes rares quadrupler en une seule génération. </li><li> iTILLING. Notre laboratoire a récemment décrit une nouvelle approche pour le dépistage de la présence de mutations induites dans les gènes d&#39;intérêt dans 7 Arabidopsis. Cette méthode est une variation sur une technique bien établie appelée TILLING qui est utilisé pour trouver des mutations dans des populations commandé des individus traités avec un mutagene chimique 8-10. Nous avons nommé notre méthode iTILLING parce qu&#39;il s&#39;agit d&#39;une version personnalisée de TILLING qui permet une indchercheur ividual pour accomplir quelque chose qui a traditionnellement exigé une grande équipe de recherche à compléter. Ice-Cap fait partie intégrante de la méthode iTILLING 7, tel que décrit ci-dessous. </li></ol> L&#39;idée derrière iTILLING est de produire une population éphémère mutant, qui est en contraste avec les populations durables mutant créé pour les projets traditionnels TILLING. Pour iTILLING, les graines d&#39;une population en vrac M2 sont semées en 50 100 blocs Ice Cap, et l&#39;ADN est extrait en utilisant la méthode des calottes glaciaires. Plants d&#39;Arabidopsis sont ensuite placés à 4 ° C, alors que le dépistage de mutation est réalisée en utilisant l&#39;ADN calotte glaciaire preps. Plants de tomates sont conservés à 12 ° C. Une fois les plantules présentant des mutations désirées ont été identifiés, ils sont récupérés à partir des plaques de glace-Cap et transféré au sol. iTILLING n&#39;est pas destiné à fournir une population durable mutantes pour une communauté de recherche entier à l&#39;écran. Au lieu de cela, iTILLING fournit une stratégie par laquelleun scientifique peut filtrer une population mutante personnalisées pour des mutations dans une poignée de gènes rapidement, efficacement et à un coût relativement faible. Nous avons trouvé calotte glaciaire d&#39;être une méthode efficace pour la croissance et le génotypage d&#39;Arabidopsis, la tomate et du riz. Nous prévoyons que d&#39;autres espèces de plantes devraient également se prêter à calotte glaciaire. Une limite à la variété des espèces qui peuvent être logés par Ice-Cap est la taille des graines. Seules les plantes avec des graines assez petit pour tenir dans le puits d&#39;une plaque de 96 puits sera compatible avec la calotte glaciaire dans sa configuration actuelle.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Machine pour secouer Plaques racine pour l&#39;extraction d&#39;ADN </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Scelleur </td><td> ABgene Unis </td><td> AB-0384 </td><td> Machine manuelle thermoscellage utilisée à des plaques de Racine avant de désorganisation tissulaire </td></tr><tr><td> Centrifugeuse équipée des supports de microplaques balancer </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Toute centrifugeuse avec des supports de microplaques balancer serait approprié </td></tr><tr><td> MicroFill microplaques Distributeur </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Automated distributeur de liquide pour microplaques remplissant </td></tr><tr><td> Bialetti marque17x11 pouces Fiche commerciaux Cookie Grand </td><td> Target magasin </td><td> www.bialetti.com </td><td> Cette feuille de biscuit spécifique a la profondeur idéale pour la calotte glaciaire </td></tr><tr><td> Custom Made rack métallique </td><td> Quincaillerie </td><td></td><td> Voir le texte pour la description complète </td></tr><tr><td> 33 litres boîte de rangement en plastique </td><td> Target magasin </td><td> Sterilite Marque </td><td> Pour la calotte glaciaire Fontaine. Boîte de rangement en plastique assez grand pour contenir la plaque à biscuits 17x11 pouces </td></tr><tr><td> 30 gallons par heure Pompe de fontaine </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Petite pompe submersible fontaine disponible dans les magasins de fournitures de jardin </td></tr><tr><td> Tuyau pour pompe de fontaine </td><td> Toute entreprise de fournitures de laboratoire </td><td></td><td> Tuyau compatible avec pompe de fontaine </td></tr><tr><td> Pince plastique </td><td> Quincaillerie </td><td></td><td> Pince à tenir le tuyau à biscuitsFiche </td></tr><tr><td> Effacer les couvercles en plastique de Falcon Microtest fond plat de 96 puits des plaques de polystyrène </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Effacer les couvercles en plastique pour couvrir les plaques de glace semis-Cap </td></tr><tr><td> 3M Micropore ruban chirurgical </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch boules de diamètre en acier inoxydable </td><td> Technologies de Hartford, Rocky Hill, CT </td><td> 034 à 006-1K </td><td> Utilisé pour perturber les tissus des racines après la récolte </td></tr><tr><td> 3 pouces bandeaux élastique </td><td> Épicerie locale </td><td></td><td> Utilisé pour sécuriser Plate Racine à la plaque de semis </td></tr><tr><td> 4 brochettes en bois mm de diamètre </td><td> Épicerie locale </td><td></td><td> Ces brochettes sont généralement utilisés pour préparer les brochettes </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marque de 1 ml plaques filtre sans fritte </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> Plaques de semis de 96 puits avec des trous dans le fond. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Eh bien Tall-cheminée Plaque PCR </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> Plaques 96 puits à la racine </td></tr><tr><td> Agar - culture cellulaire testée </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic acide (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige et Skoog (MS) mélange de sel basale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> La chaleur Easy Peel étanchéité feuille </td><td> ABgene Unis </td><td> AB-0745 </td><td> Film d&#39;étanchéité pour l&#39;étanchéité thermique Plaques Racine avant de désorganisation tissulaire </td></tr><tr><td> Marque Canard bande extra large Emballage, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Réf. 21242139 </td><td> Ruban adhésifpour microplaques d&#39;étanchéité contenant des extraits d&#39;ADN pour le stockage </td></tr><tr><td> Rouleau d&#39;étanchéité </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Hand held outil de rouler pour le pressage de bandes d&#39;étanchéité adhésif sur microplaques </td></tr><tr><td> 96 puits à bloc thermique du métal </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Utilisé pour geler les plaques pour la récolte des racines du tissu </td></tr><tr><td> Papier-filtre Whatman </td><td> Whatman international </td><td> 1002 090 </td><td> Utilisé pour les graines de la surface de stérilisation </td></tr><tr><td> Pipette Pasteur jetable </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;jetables pipette Pasteur utilisée pour le transfert de semences à l&#39;assiette des semis </td></tr><tr><td> Pyrex plat allant au four (20 cm x 30 cm) </td><td> Target magasin </td><td></td><td> Utilisé pour construire une glace sèche / éthanol bain. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: un procédé de croissance arabidopsis et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Il est devenu courant pour les scientifiques des plantes pour développer des projets qui nécessitent le génotypage d&#39;un grand nombre de plantes. La première étape de tout projet de génotypage est de collecter un échantillon de tissu de chaque plante. L&#39;approche traditionnelle de cette tâche est de plantes échantillon de un en un temps. Si l&#39;on veut à des centaines ou des milliers de génotypes particuliers, cependant, l&#39;utilisation de ce résultat stratégie dans un goulot d&#39;étranglement important dans le pipeline de génotypage. La méthode la calotte glaciaire que nous décrivons ici fournit une solution haut-débit à ce défi en permettant à un chercheur de collecter des tissus de plusieurs milliers de plants dans un seul jour 1,2. Ce niveau de débit est rendue possible par le fait que le tissu est récolté à partir de plantes de 96 en un temps, plutôt que d&#39;une moins-un-temps. La méthode la calotte glaciaire offre une plate-forme intégrée pour effectuer la croissance des semis, la récolte des tissus, et l&#39;extraction d&#39;ADN. La base de la calotte glaciaire est la croissance de seedliNGS dans une paire empilée de plaques à 96 puits. Les puits de la plaque supérieure contiennent les bouchons de gélose de milieu de croissance sur lequel plants individuels germer. Les racines poussent vers le bas à travers les médias d&#39;agar, sortie de la plaque supérieure par un trou, et de passer dans une eau contenant la plaque inférieure. Pour la récolte de tissus pour l&#39;extraction d&#39;ADN, de l&#39;eau dans la plaque inférieure contenant les tissus des racines est rapidement congelé alors que les semis dans la plaque supérieure rester à température ambiante. La plaque supérieure est ensuite décollé de la plaque inférieure, ce qui donne une plaque avec 96 échantillons de tissu racinaire dans la glace et une plaque avec 96 plants viables. La technique est appelée &quot;Ice-Cap», car il utilise de la glace pour capturer le tissu racinaire. La plaque 96 puits contenant les plantules peuvent ensuite enveloppés dans du papier et transférés à basse température. Ce processus suspend une nouvelle croissance des plants, mais n&#39;affecte pas leur viabilité. Une fois l&#39;analyse du génotype a été achevé, les jeunes plants avec le génotype désiré peut être transférée de la p 96 puitsfin à la terre pour la multiplication ultérieure. Nous avons démontré l&#39;utilité de la méthode de la calotte glaciaire à l&#39;aide d&#39;Arabidopsis thaliana, la tomate, et les semis de riz. Nous prévoyons que la méthode doit également être applicable à d&#39;autres espèces de plantes à graines assez petit pour tenir dans les puits de plaques à 96 puits.

La méthode calotte permet de cultiver des plantes en plaques à 96 puits et non destructive tissu racinaire de récolte de chaque plant. L&#39;ADN extrait à partir de ce tissu racinaire peut être utilisé pour des réactions de génotypage. Nous avons constaté que la calotte glaciaire fonctionne bien pour les<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, La tomate, les plants de riz.

Ice-Cap: un procédé de croissance Arabidopsis Et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit

Il devient courant pour les chercheurs en sciences végétales de développer des projets nécessitant le génotypage d'un grand nombre de plantes. La première étape de tout génotypage...

L'objectif général de cette expérience est d'isoler des échantillons de tissu racinaire de jeunes plantules cultivées dans des plaques de 96 puits pour l'extraction d'ADN et le génotypage. Cette procédure s'effectue en deux étapes : premièrement, la germination des plantules dans des plaques spéciales de 96 puits contenant un milieu de croissance à base d'agar et dotées de trous au fond de chaque puits ; deuxièmement, le positionnement de la plaque de plantules sur une plaque standard de 96 puits remplie d'eau.Une fois que les racines ont poussé vers le bas dans la plaque inférieure de 96 puits, les plaques empilées sont placées dans un bloc de congélation afin de geler l'eau contenue dans la plaque inférieure. La dernière étape consiste à détacher la plaque supérieure de la plaque inférieure, ce qui rompt les racines, restant gelées dans la plaque inférieure. En fin de compte, les échantillons de tissu racinaire obtenus peuvent être utilisés pour extraire des échantillons d'ADN de chaque plante individuelle en vue d'une analyse de génotype.Le principal avantage du capillaire de glace par rapport aux méthodes alternatives est qu'il permet d'isoler l'ADN de milliers de plantes en une seule journée. Ce niveau de productivité est possible car, avec le capillaire de glace, les plantes sont manipulées 96 à la fois, plutôt qu'une par une selon la méthode traditionnelle. Certains exemples d'utilisation du capillaire de glace incluent le criblage de grandes populations de plantes afin d'identifier des recombinants rares entre des gènes étroitement liés, la génération de plantes portant un grand nombre de mutations différentes et cartographiées, ainsi que la sélection assistée par marqueurs chez les espèces cultivées.Fondamentalement, n'importe quelle expérience nécessitant un génotypage, impliquant un grand nombre de plantes individuelles, pourrait potentiellement bénéficier du récipient icecap. Nous avons initialement développé icecap pour son utilisation avec l'abscess du lapin, mais nous avons également obtenu des résultats concluants en l'utilisant pour prélever des tissus de jeunes plants de riz et de tomate. Nous pensons que ice cap sera également efficace sur d'autres espèces, à condition que leurs graines soient suffisamment petites pour tenir dans une plaque à 96 puits.Enveloppez d'abord les boîtes de semis dans du papier d'aluminium et stérilisez-les en même temps au autoclave. Après la fin du cycle d'autoclavage, imbibez les couvercles en plastique transparent avec de l'éthanol à 95 %, puis laissez sécher complètement les boîtes de semis et leurs couvercles dans une hotte à flux laminaire. Une fois les boîtes parfaitement sèches, appliquez du ruban adhésif sur le fond de chaque boîte de semis et scellez fermement à l’aide d’un rouleau.Ensuite, utilisez un distributeur automatique pour microplaque ou une pipette multicanal pour distribuer 450 microlitres de milieu de croissance fondu dans les puits de chaque plaque de semis. Couvrez les plaques avec des couvercles en plastique et laissez le milieu de croissance durcir à température ambiante. Saupoudrez les graines sèches sur du papier filtre Watman et recouvrez chaque graine complètement avec de l'éthanol à 95 %.Ensuite, laissez les graines sécher complètement à l'air. Puis, transférez les graines sur les plaques de germination en touchant d'abord l'extrémité scellée à la flamme d'une pipette en verre modifiée à la surface du milieu gélosé. Ceci humidifie la pointe de la pipette et permet de prélever facilement une seule graine pour la transférer à la surface de l'agar.Une fois que chaque puits contient une graine, couvrez chaque plaque de semis avec un couvercle en plastique transparent et scellez-la avec du ruban adhésif chirurgical micropore. Enveloppez les plaques empilées avec du papier d'aluminium et stockez-les à quatre degrés Celsius pendant quatre jours afin de stratifier les graines et synchroniser la germination. Après quatre jours, placez les plaques de semis sous une lumière fluorescente à 18 à 20 degrés Celsius pendant quatre jours supplémentaires.Pour initier la germination, monter la fontaine à capuchon de glace sur une étagère dans la chambre de croissance végétale de sorte que la surface de la fontaine à capuchon de glace reçoive un éclairage fluorescent direct. Pour monter : placez d'abord la structure de support sur mesure à l'intérieur d'une boîte de rangement en plastique, puis posez une plaque à pâtisserie par-dessus celle-ci.Utilisez les écrous de nivellement pour ajuster le niveau de la plaque à pâtisserie. Ensuite, placez une pompe submersible dans la boîte de rangement et fixez le tuyau de sortie de la pompe sur le côté de la plaque à pâtisserie à l’aide d’un collier à ressort. Puis, remplissez la fontaine à glace avec un mélange composé de trois parties d’eau distillée pour une partie d’eau du robinet.Ajouter de l'eau jusqu'à ce que la pompe submersible soit située à plusieurs centimètres sous le niveau de l'eau. Marquer le niveau final de l'eau dans la boîte de rangement en plastique à l'aide d'un ruban adhésif de laboratoire et d'un stylo-feutre. Préparer les plaques racinaires en ajoutant une bille en acier inoxydable dans chaque puits d'une plaque racinaire 96 puits.Ensuite, distribuez 340 microlitres d'un mélange composé de trois parties d'eau distillée pour une partie d'eau du robinet dans chaque puits de la plaque racinaire. Retirez le film adhésif du fond des plaques de semis et ôtez les couvercles en plastique transparent.Placer chaque boîte de semis dans une boîte racinaire contenant une bille métallique et de l'eau, puis fixer les deux boîtes ensemble à l'aide de deux élastiques. Ensuite, placer les boîtes superposées dans la fontaine à bonnet de glace. Les boîtes appariées doivent rester dans la fontaine à bonnet de glace pendant 10 à 14 jours.Pendant ce temps, maintenir le niveau d'eau dans la fontaine à capuchon de glace en complétant avec de l'eau distillée. Une fois que la majorité des plantules possèdent un tissu racinaire ayant pénétré les plaques racinaires, retirer les plaques de la fontaine à capuchon de glace en vue de la récolte du tissu racinaire. Après avoir retiré les plaques de la fontaine à capuchon de glace, insérer trois brochettes en bois entre les puits des plaques de plantules et racinaires empilées.Les brochettes permettront de soulever les godets des plaques de semis hors des puits des plaques racinaires. Laisser les plaques ice cap empilées, avec les brochettes en bois insérées, en exposition sous lumière pendant la nuit. Cette incubation permet une légère évaporation du liquide présent dans les plaques racinaires, ce qui facilite les étapes ultérieures de congélation et de séparation des plaques.Le jour de la récolte du tissu, préparez un bain de congélation. Placez un bloc thermique métallique de 96 puits dans un plat en Pyrex contenant un mélange de dioxyde de carbone solide et d'éthanol à 95 %. Laissez le bloc thermique atteindre l'équilibre thermique pendant environ 20 minutes.Placer les plaques empilées du capot de glace avec les brochettes en bois sur le bloc thermique refroidi et incuber pendant cinq minutes. Pendant ce temps, l'eau dans la plaque racine va geler complètement. Retirer les plaques empilées du capot de glace du bain de congélation et les placer sur le plan de travail à température ambiante, puis enlever les bandes élastiques et les brochettes en bois des plaques empilées.Appuyez fermement sur le dessus de la plaque de semis pour fendre les plaques. Ensuite, séparez soigneusement la plaque racinaire et les plaques de semis. Laissez décongeler à température ambiante l'eau contenue dans les plaques racinaires.Dans le cas contraire, la décongélation peut être accélérée en incubant les plaques racinaires dans un bloc thermique. Régler la température à 25 degrés Celsius pendant que les plaques racinaires décongèlent. Les plaques de semis peuvent être préparées pour le stockage.Pour ce faire, scellez la partie inférieure de la plaque de semis avec du ruban adhésif. Ensuite, placez un couvercle en plastique transparent sur la plaque de semis et fixez-le avec du ruban micropore.Empilez les plaques de semis, enveloppez-les dans une feuille d'aluminium et placez les semis d'arabidopsis à quatre degrés Celsius. Les semis peuvent être conservés à ces températures pendant plusieurs semaines sans affecter leur viabilité. Veillez à ce que l'eau dans les plaques racinaires ait complètement dégelé.Avant de réaliser la procédure d'extraction de l'ADN, inspectez également les plaques afin de déterminer si certains puits contiennent sensiblement moins d'eau que la moyenne ; ajoutez de l'eau distillée par pipette dans les puits nécessitant davantage d'eau. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution de TRISS 500 millimolaire et d'EDTA 50 millimolaire dans chaque puit de la plaque racinaire. Puis scellez les puits des plaques racinaires à l'aide d'un film de scellage thermique et d'une machine de scellage thermique.Placer les plaques de racines scellées sur la machine Geno Grinder, l'extrémité scellée des plaques orientée vers le bas. Agiter les plaques dans le Geno Grinder pendant trois minutes et demie à 1 350 coups par minute. Transférer les plaques dans une centrifugeuse équipée de supports pour microplaque et centrifuger pendant 10 minutes à 3 500 tr/min à quatre degrés Celsius afin de former un culot de tissu racinaire pulvérisé.À l’aide d’une pipette multicanal, transférez 20 microlitres de surnageant de chaque puits de la plaque racinaire vers une nouvelle plaque de 96 puits contenant 80 microlitres d’eau milli Q dans chaque puits. Cet extrait dilué contient de l’ADN génomique qui peut être utilisé directement dans la réaction de PCR de génotypage selon les protocoles standards. Une fois le génotype de chaque plantule identifié, retirez les plaques de plantules du stockage réfrigéré et préparez des pots avec un mélange de sol saturé en eau à l’aide d’air comprimé et d’un tuyau en caoutchouc ; appliquez une légère pression d’air sur le petit orifice du puits de la plaque de plantules pour faire sortir le bouchon d’agar et la plantule de la plaque sur le plan de travail du laboratoire.Pratiquez un petit trou d’environ la taille du fragment d’agar dans le sol. Placez ensuite le fragment d’agar dans le sol et tassez délicatement la terre humide autour du fragment pour bien fixer la plantule dans le sol. Placez les plantules transplantées sous lumière à une température de 18 à 22 degrés Celsius.Couvrez chaque pot avec un couvercle en plastique pendant les deux premiers jours suivant la transplantation. Retirez ensuite le couvercle et faites pousser la plante dans des conditions de croissance standard. Cette image illustre des semis d'Arabidopsis cultivés dans la fontaine à capuchon de glace pendant deux semaines et prêts à être récoltés pour l'analyse tissulaire.Chacun des deux puits contient un semis d'arabidopsis. Cette vue latérale des mêmes deux puits de la plaque racinaire montre les racines s'enroulant autour de la surface intérieure des puits. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour traiter jusqu'à 40 plaques IceCap en une journée de huit heures.Cela permet à un scientifique de produire des préparations d'ADN à partir de plus de 3 800 plantules individuelles en une seule journée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de transférer rapidement les boîtes de culture dans la fontaine de glace dès que les plantules germent. Vérifiez les boîtes quotidiennement afin de ne pas manquer le moment optimal pour le transfert. Bonne chance dans vos expériences.

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Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis

Un écran à haut débit de petites molécules de synthèse a été réalisé sur les espèces de plantes de modèle, Arabidopsis thaliana. Ce protocole, développé pour un robot de manipulation de liquides, augmente la vitesse d’écrans avant génétique chimique, accélérer la découverte de nouvelles petites molécules affectant la physiologie végétale.

Optimisation de l’utilisation d’un Robot de manutention liquide pour mener un haut débit avant chimique génétique écran d’Arabidopsis thaliana

Il est souvent nécessaire d'évaluer la cytotoxicité potentielle d'un ensemble de composés sur les cellules cultivées. Ici, nous décrivons une stratégie pour dépister de façon fiable les composés toxiques dans un format de 96 puits.

Une stratégie visant à identifier les composés qui affectent la croissance et la survie des cellules mammifères cultivées à un débit faible à modéré

Une douce machine de chargement à force tactile est construite à partir de brosses à cheveux humaines, de bras robotiques et d'un contrôleur. Les brosses à cheveux sont entraînées par des bras robotiques installés sur la machine et se déplacent périodiquement pour appliquer la force tactile sur les plantes. La force des touches de cheveux entraînées par la machine est comparable à celle des touches appliquées manuellement.

Un protocole d'écran mutant de signalisation de transmission de force tactile et répétable de travail pour l'étude de la thigmomorphogenesis d'une plante modèle Arabidopsis thaliana

Cet article décrit deux méthodes pour quantifier des réponses de défense dans Arabidopsis thaliana suivant l'exposition aux eliciteurs immunisés : l'éclatement oxydant transitoire, et l'inhibition de la croissance de plant.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

L’essai d’inondation de semis facilite le criblage rapide des adhésions de tomate sauvage pour la résistance à la bactérie de seringue de Pseudomonas. Cet essai, utilisé en conjonction avec l’essai de croissance bactérienne de semis, peut aider à caractériser davantage la résistance sous-jacente à la bactérie, et peut être employé pour dépister la cartographie des populations pour déterminer la base génétique de la résistance.

Identification à haut débit de la résistance aux seringues Pseudomonas pv. Tomate dans la tomate à l’aide de semis Flood Assay

La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

Un protocole à haut débit pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) est fourni, optimisant les étapes de manipulation des liquides avec un simple dispositif d’aspiration construit avec une pompe à vide. Des centaines d’échantillons de semences peuvent être stérilisés en surface en une journée.

Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Nous décrivons ici un outil avancé conçu pour le suivi de la biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement des plantules d’Arabidopsis . La nouvelle méthodologie fournit une imagerie non invasive de fluorescence de la chlorophylle en temps réel à haute résolution spatiale et temporelle.

Test non invasif pour la détermination de la cinétique de biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis

Apprenez la méthode Ice-Cap pour isoler des échantillons de racines de plantules Arabidopsis thaliana et tomates en plaques 96 puits. Cette technique permet un génotypage à haut débit efficace.

Ice-Cap: un procédé de croissance Arabidopsis Et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit

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