Name: Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec laide dadénovirus dérivés Systems (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Découvrez une méthode efficace de production de parvovirus recombinants utilisant un vecteur adénoviral dérivé du type 5. Cette technique améliore le rendement viral par plus de dix fois tout en réduisant les coûts et les délais de production.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions l&#39;équipe de la production de virus DKFZ et de l&#39;unité de développement, en particulier Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, et Mandy Roscher. Cette étude a été partiellement financé par des subventions du Ministère fédéral de l&#39;éducation et la recherche (BMBF) et l&#39;Association Helmholtz dans le cadre de la Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est Programme commun dans la tumeur appliquée virologie.

Notez que d'un laboratoire avec un niveau de biosécurité 2 est nécessaire pour la production de parvovirus recombinants (recPV). Le protocole est subdivisé en deux parties principales. La première partie (production de recPV par transfection) est nécessaire pour produire la quantité minimale de recPVs qui sert d'inoculum dans la deuxième partie du protocole (production de recPVs via l'infection). Une fois une petite quantité de recPVs est produite, la première partie du protocole peut être omis, et le parvovirus recombinant peut être amplifié que par l'intermédiaire d'infection fournissant le gène codant pour les protéines de capside du parvovirus par l'assistant adénovirus (voir ci-dessous). 1. Production de recPVs via Transfection 1,1 transfection d'ADN viral Il est possible d'utiliser n'importe quelle méthode d'ADN établi transfection dans cette section du protocole, soit à base de lipides cationiques ou phosphate de calcium. Nous utilisons généralement Fugene HRéactif de transfection D. Pour contrôler l'efficacité de transfection, nous vous recommandons de transfection plaque supplémentaire avec un plasmide exprimant la protéine fluorescente verte améliorée (par exemple pEGFP-N1, Clontech). Transfection est considéré efficace et optimal pour la production de virus lorsqu'au moins 50% de la population cellulaire résulte EGFP-positives 24 heures après transfection. <ol><li> 1 jour avant transfection, les cellules de semences, HEK293T 2 millions dans une plaque de 10 cm, pour obtenir 50% de confluence cellulaire à jour de la transfection. Cultiver les cellules dans 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec plus de 10% sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 U par ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Préparer le virus de décision mélange (1:2:1 rapport molaire) dans un tube de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 3 pg de vecteur recPV hébergeant le transgène d'intérêt (ei pHH-1-GFP 6). </li><li> 6 pg de vecteur pCMV / VP 5 abriter l'unité du gène de capside du parvovirus </li><li> 8 o ugf adénovirus dérivé plasmide auxiliaire pXX6 7. </li></ol></li><li> Diluer le mélange des plasmides avec un milieu sans sérum jusqu'à 850 (concentration finale de 20 ng / pl) ul. </li><li> Ajouter 42,5 pi Fugene HD (2.5:1 Fugene ul rapport: pg d'ADN). Ne pas toucher le côté du tube lors de l'ajout au milieu Fugène. </li><li> Vortex doucement pendant 5-10 secondes. </li><li> Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. </li><li> Ajouter les mélanges de transfection goutte à goutte aux cellules. Agiter la plaque doucement afin de répartir le mélange à travers. </li></ol> 1.2 Production Virus <ol><li> Incuber la plaque à 37 ° C avec une humidité de 92% et 5% de CO 2 pendant 72 heures avant la récolte. Pendant cette période, des particules de parvovirus descendance sont formés à partir des plasmides parvovirus. </li></ol> 1,3 récolte de virus <ol><li> Dans une hotte de culture tissulaire, racler les cellules au sein de leur milieu, aspirer et transférer la suspension de la plaque dans un 15en plastique ml tube. </li><li> Centrifuger le tube à 250 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Retirer 95% du surnageant. </li><li> Vortex doucement le tube pour remettre en suspension le culot dans le surnageant restant (environ 0,5 ml). </li><li> Congeler le tube à -80 ° C. Il est possible d'arrêter la production à ce stade ou de continuer avec le protocole. </li><li> Décongeler la suspension et l'amener à la température ambiante. </li><li> Congeler la suspension dans un bain d'azote liquide et de dégel dans l'eau chaude à 37 ° C. Vortex les tubes vigoureusement pendant 15 sec et répéter les cycles de gel-dégel en outre deux fois. </li><li> Centrifuger les tubes à 16.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Le tube à ce stade contient la préparation de virus brut extrait. </li><li> Procéder à l'titrage du virus (voir ci-dessous). Pour la recPV portant le gène de la GFP, une production typique devrait donner 1-3 x 10 7 unités infectieuses virales correspondant à environ 1 -3 x 10 10 génome viral contenant des particules. </li></ol> 1.4 Stockage Virus <ol><li> Pour stockage à long terme geler le tube contenant l'extrait virus brut à -80 ° C. Il est possible d'utiliser des extraits bruts virales comme inoculum dans la deuxième partie du protocole. </li></ol> 2. Production de recPVs par infection Avant de commencer la production recPV par infection, de produire et de purifier l'adénovirus 5 portant le parvovirus VP gène (Ad-VP aide, décrit en 5) selon le protocole standard 8. Il est également nécessaire de disposer d'une quantité minimale de recPVs portant le transgène d'intérêt (par exemple, produit par transfection comme décrit ci-dessus). Ci-dessous, nous décrivons la production recPV dans 175 cm 2 flacon (T175) en format. Une amplification supplémentaire du stock viral produit de cette manière peut être menée dans 10 chambres de culture multicouches CellSTACK (Corning)avec des ajustements mineurs du protocole proposé. 2.1 Infection <ol><li> 1 jour avant que les cellules d'infection de la plaque, les NB324K 10 millions dans un flacon T175 pour obtenir 60-80% de confluence cellulaire à la journée de l'infection. Préparer un second flacon contenant le même nombre de cellules sous forme de commande (cellules non infectées). Chaque T175 devrait avoir 20 ml de milieu essentiel minimum (MEM) en tant que volume final, supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100U par ml Penicillium et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Le lendemain matin, préparer le mélange du virus dans un tube en plastique de 2 ml consistant en: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-helper 5 à la multiplicité d'infection (MOI, unités infectieuses par cellule) = 10 (correspondant à 1 x 10 8 unités infectieuses); </li><li> recPVs à MOI = 0,5 (correspondant à 5 x 10 6 unités infectieuses). Remplissez à 1,5 ml avec du MEM. </li></ol></li><li> Appliquer le mélange dans un virus entier de la fiole T175. </li><li> Incuber laballon pendant 2 heures à 37 ° C, humidité 92%, 5% CO 2 en secouant doucement toutes les 15 min. </li><li> Incuber pendant encore 20 à 24 h à 37 ° C, humidité 92%, 5% de CO 2. </li><li> Remplacez le milieu culturel du milieu frais. </li></ol> 2.2 La production de virus Incuber les flacons à 37 ° C avec une humidité de 92% et 5% de CO 2 pendant 48 heures. Comme indication de la production virale efficace, des signes clairs de cytotoxicité doit être observée dans le flacon contenant virales des cellules infectées, en commençant 36-48 heures post-infection. 2,3 récolte de virus <ol><li> Dans une hotte de culture tissulaire, aspirer et transférer le surnageant du milieu de la fiole dans un tube de 50 ml centrifugeuse. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 1,5 ml de PBS. </li><li> Trypsiniser les cellules avec 1,5 ml de 0,25% Trysin-EDTA. Ajouter la suspension de cellules dans le milieu enlevé. </li><li> Centrifuger les cellules et le surnageant à 5000 xg pendant 5 min à tempérament chambrerature. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon TE (1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) à la cellule et le culot vortexer doucement le tube pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Congeler la suspension cellulaire dans un bain d'azote liquide et de dégel dans l'eau chaude à 37 ° C. Vortex vigoureusement le tube pendant 15 secondes et répéter le cycle de gel-dégel à trois reprises. </li><li> Traiter la suspension cellulaire avec 50 nucléase U / ml Benzonase pendant 30 min à 37 ° C afin de digérer l'ADN génomique de cellules et non-emballés ADN viraux. </li><li> Centrifuger le tube à 5000 xg pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Le surnageant à ce stade de la préparation contient le virus extrait brut. Les rendements typiques de recPV-GFP produite à la suite de ce protocole devrait être de l'ordre de 1-10 x 10 8 unités infectieuses virales. </li></ol> 2.4 Entreposage Virus <ol><li> Pour le stockage à court terme (maximum 2 mois), le virus conserver à 4 ° C. </li><li> Pour lonstockage à long terme g (plus de 2 mois), le virus conserver à -80 ° C. </li></ol> 3. Purification RecPV <ol><li> Pour la purification de recPVs des lysats bruts, nous recommandons d'exécuter un gradient discontinu iodixanol selon Zolotoukhine et al. 9. Nous vous recommandons d'utiliser un minimum de 5 ml d'extrait brut virale (obtenu à partir de la production dans cinq flacons T175) pour la purification de virus efficace. </li></ol> 4. Titrage Parvovirus recombinant <ol><li> Effectuer le titrage recPV tel que décrit dans El-Andaloussi et al. 5 </li></ol> 5. Contrôles de qualité <ol><li> Utilisez le protocole décrit dans El-Andaloussi et al. 5 à vérifier la présence de virus de réplication indésirables compétentes (AN) effectuant un essai sur plaque parvovirus dans les cellules indicatrices NB324K. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple de recPVs production par l'intermédiaire d'une transfection, en présence ou en l'absence d'éléments génomiques adénovirales est représenté sur la figure 3. Cellules ont été transfectées avec pCMV / VP (plasmide portant le gène codant pour les protéines de capside VP parvovirus) avec pHH-1-GFP (recPV une hébergeant le gène de la GFP) ou pHH-1-luciférase (recPV une hébergeant le gène de la luciférase de luciole) , avec (+ pXX6) ou sans (-pXX6) le pXX6 plasmide (portant l'adénovirus E2A, E4 (orf6) et VA gènes de l'ARN). Volume égal d'extraits cellulaires bruts ont été appliqués à NB324K cellules et transduction GFP ou luciférase essais ont été effectués comme indiqué dans El-Andaloussi et al. 5. Une nette augmentation de la production recPVs a été obtenue en présence de pXX6 avec augmentation de la production de 0,3 unités GFP transductional (TU) ou de cellules obtenues selon des protocoles classiques à environ 5 TU / cellulaire obtenue à la suite de notre méthode (Fig. 3A, B). Une augmentation significative (environ 24 fois) de recPV productisur a également été observé dans le cas de PHH-1-luciférase (Fig. 3C). Ces résultats indiquent que le matériel génétique contenu dans pXX6 est capable de stimuler la production parvovirus. Un exemple représentatif de la production par l'intermédiaire recPVs infection sont présentées dans la figure 4. Cellules ont été NB324K co-infectés par recPVs divers (comme indiqué dans la figure) et Ad-VP-helper (hébergeant le gène codant pour les protéines de capside VP PV). Ad-VP aide de production renforcée recPV jusqu'à&gt; 70 TU par ensemencée cellule (figure 4A) sans augmenter la survenance d'indésirables capables de réplication des particules virales (Fig. 4B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Vecteurs sur la base de parvovirus autonomes. (A) Haut: Le transgène remplace une partie des gènes VP-codage et est sous le contrôle du promoteur viral P38. Les gènes de NS1 / 2 sont à nouveauentretenus et leur expression est contrôlée par le promoteur viral P4. Le génome du vecteur est flanqué par le parvovirus RTI, qui contiennent des éléments agissant en cis qui sont nécessaires à la réplication et l'emballage du génome recombinant. Bas de: Un plasmide portant le gène de sous-VP soit une hétérologue (par exemple CMV.), Ou autologue (par exemple P38.) Promoteur (Px), est fourni en trans lors de la production recombinante de parvovirus, afin de compenser la perturbation des gènes de structure dans le génome recombinant. ITR, répétition terminale inversée. Figure adaptée de 4. Schéma (B) du protocole classique utilisé pour la production de recPVs. HEK293T cellules sont transfectées transitoirement avec l'ADN viral (vecteur et plasmides auxiliaires) et au bout de trois jours, les cellules sont collectées et les virus récoltés. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. La production d'recPVs avec lel'aide de l'Ad-VP. (A) des cartes schématiques des génomes recPV et Ad-VP. Le recPV contient un transgène hétérologue qui remplace une partie de la région VP. Le comité ad-VP abrite le gène parvovirus VP. Vue schématique (B) du protocole décrit dans ce manuscrit. Cellules NB324K sont co-infectés par recPV et Ad-VP virus. Après trois jours cellules sont récoltées et les particules recPV récupéré à partir du lysat cellulaire. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Stimulation de la production par recPV à base d'adénovirus plasmides pXX6. Cellules HEK293T, ensemencées dans des boîtes de 10 cm, ont été transfectées avec pCMV / VP en combinaison avec PHH-1-GFP (A et B) ou pHH-1-luciférase (C) pour produire recPVs. Simultanément, les cellules ont été co-transfectées avec les plasmides auxiliaires adénovirus dérivés pXX6 ou non, comme indiqué. Trois jours après la transfection, les cellules ont été récoltées et lysées par des cycles de gel et de dégel trois. Des volumes égaux de crudextraits de virus e ont été appliqués à NBK cellules indicatrices, et des essais de transduction ont été effectuées. (A) micrographies représentatives montrant cellules GFP-positives dans les monocouches confluentes NB324K. (B) Quantification des essais de transduction de GFP exprimée en unité de transduction (TU) par cellule ensemencée (C). La quantification de l'activité de la luciférase exprimée en unités relatives de la luciférase (RLU). Le dosage de la luciférase a été réalisée comme décrit dans El-Andaloussi et al. 5. Colonnes représentent des valeurs moyennes de trois répétitions avec des barres d'écart-type. Nombre au sommet de la colonne + pXX6, dans (B et C), indique la multiplication dans les titres de virus recPV, obtenu en présence d'pXX6 versus sans. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Stimulation de la production recPV au moyen d'un virus recombinant Ad-helper VP. (A) des cellules NB324K, étaient les infectionsTed avec le virus purifié aide Ad-VP à une MOI de 10 (Ad-X unité / cellule, titré avec Adeno-X Kit Rapid titre), puis surinfectées avec l'un des parvovirus recombinants suivants Chi-hH-1-EGFP 11 (0,1 TU / cellule) ou H-1-GFP (0,5 TU / cellule) 5. Un jour post-infection, le milieu a été changé et deux jours plus tard, les cellules ont été collectées et lysées par trois gel-dégel. Des extraits cellulaires bruts ont été utilisés pour déterminer le titre de virus par un test de transduction selon El-Andaloussi et al. 5. TU, unité de transduction. (B) lots virales produites dans la présence ou l'absence d'Ad-VP ont été analysés pour leur teneur en particules virales compétentes pour la réplication (RCV) par dosage de plaque sur des cellules indicatrices NB324K.

<ol><li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus.+Res%22%5BJournal%5D)">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).</li>
<li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).</li>
<li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1%2C+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li>
<li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCornelis%2C+JJ+%22J.+Virol%22">J. Virol</a>. 6, 193-193 (2004).</li>
<li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li>
<li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224(1998).</li>
<li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509(1998).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973(1999).</li>
<li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129(1997).</li>
<li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851(2003).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous avons montré que la production recPV peut être renforcée par la présence d&#39;éléments génomiques adénoviraux. Nous avons augmenté les rendements recPV de plus de 10 fois (0,3 à 5 TU / cellule) en fournissant des éléments génomique adénovirus par transfection et de plus de 100 fois co-infectant les cellules avec Ad-VP-helper en combinaison avec le recPV dans Comparaison de protocoles conventionnels. Le protocole décrit ici peut être encore optimisée en déterminant le moment le plus approprié pour la livraison des ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Le sérum fœtal bovin </td><td> AAP </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase nucléase </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X rapide Titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficacité de la production parvovirus recombinant avec l&#39;aide d&#39;adénovirus dérivés systems

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Parvovirus des rongeurs (PV) comme chez le rat H-1PV et MVM, sont de petits icosaédrique, simple brin virus à ADN,. Leur génome comprend deux promoteurs P4 et P38 qui régulent l&#39;expression des protéines non structurales (NS1 et NS2) et (capside VP1 et VP2), respectivement 1. Ils attirent un grand intérêt en tant qu&#39;agents anticancéreux pour leurs capacités oncolytiques et oncosuppressive tout en étant non-pathogènes pour l&#39;homme 2. NS1 est l&#39;effecteur majeure du 3 cytotoxicité virale. Afin de renforcer davantage leurs activités naturelles antinéoplasiques, dérivés de ces vecteurs ont été générées par le remplacement du gène codant pour les protéines de la capside d&#39;un transgène thérapeutique (par exemple un polypeptide cytotoxique, cytokine, une chimiokine tumeur du gène, suppresseur etc) 4. Les parvovirus recombinants (recPVs) vecteur conserve les séquences NS1 / 2 de codage et les télomères du génome qui sont nécessaires PV pour l&#39;amplification d&#39;ADN viral et l&#39;emballage. La production derecPVs se produit uniquement dans les cellules productrices (générale HEK293T), par co-transfection des cellules avec un second vecteur (pCMV-VP) exprimant le gène codant pour les protéines VP (fig. 1) 4. Les vecteurs recPV générés de cette manière sont défectif pour la réplication. Bien que recPVs prouvé posséder une intensification des activités oncotoxic à l&#39;égard des virus parentaux à partir de laquelle ils ont été générés, leur production reste un défi majeur et entrave fortement l&#39;utilisation de ces agents dans la lutte contre le cancer des applications cliniques. On a constaté que l&#39;introduction d&#39;un vecteur d&#39;annonce-5 dérivée contenant l&#39;E2a, E4 (orf6) et les gènes d&#39;ARN VA (par exemple plasmide pXX6) dans HEK293T amélioré la production de recPVs de plus de 10 fois par rapport à d&#39;autres protocoles en cours d&#39;utilisation. Partant de ce constat, nous avons construit un roman Ad-VP-helper qui contient les éléments génomiques adénoviraux nécessaires pour améliorer la production recPVs ainsi que la parvovirnous VP gène unité 5. L&#39;utilisation d&#39;Ad-VP-helper, permet la production de recom-PV en utilisant un protocole qui repose entièrement sur ​​les mesures infection virale (par opposition à la transfection de plasmide), ce qui rend possible l&#39;utilisation de lignées cellulaires qui sont difficiles à transfecter (par exemple NB324K) ( Fig. 2). Nous présentons une méthode qui améliore considérablement la quantité de virus recombinant produit, réduisant à la fois le temps de production et les coûts, sans affecter la qualité du produit final 5. En outre, la production à grande échelle de recPV (dans les cellules en suspension et les bioréacteurs) est maintenant envisageable.

Nous décrivons ici un protocole basé uniquement sur l&#39;infection des cellules, ce qui améliore l&#39;efficacité de la production parvovirus recombinant de plus de 100 fois par rapport à d&#39;autres protocoles en cours d&#39;utilisation. Ce protocole basé sur l&#39;utilisation d&#39;un adénovirus 5 nouvelle base auxiliaire contenant l&#39;unité de transcription parvovirus VP (Ad-VP).

Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l&#39;aide d&#39;adénovirus dérivés Systems

Les parvovirus (PV) des rongeurs, tels que le H-1PV du rat et le MVM, sont de petits virus à ADN monocaténaire de structure icosaédrique. Leur génome comprend deux promoteurs, P4 et P38...

L'objectif général de cette procédure est de produire des virus parvoviraux recombinants, ou rec PVS, à des titres élevés tout en préservant leur qualité et en réduisant les délais et les coûts de production. Cela est réalisé en produisant d'abord un stock viral rec PV initial par transfection de cellules HEC 2 93 T avec des plasmides rec PV, conjointement avec un vecteur dérivé du virus adénoviral de type cinq. L'introduction d'éléments génomiques d'ad dans les cellules HEC 2 9 3 T augmentant la production de rec PVS de plus de dix fois.Par rapport aux protocoles existants, un nouveau partenaire d'AD VP a été généré, contenant les éléments génomiques adénoviraux nécessaires pour améliorer la production de parvovirus recombinants ainsi que l'unité du gène VP du parvovirus. La prochaine étape consiste à produire et à purifier ce nouveau partenaire ADD VP selon les protocoles standard.La dernière étape de cette procédure consiste à amplifier les PVS recombinants en co-infectant des cellules NB324K avec les virus PV recombinant et AD-ADP. L'efficacité de production du PV recombinant est améliorée d'un facteur supérieur à 100 grâce à cette stratégie, qui peut être utilisée exclusivemen

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Sauvetage d'arénavirus recombinantes à partir des ADNc clonés, une approche appelée génétique inverse, permet aux chercheurs d'étudier le rôle des produits spécifiques de gènes viraux, ainsi que la contribution de leurs différents domaines et les résidus spécifiques, à différents aspects de la biologie des arénavirus . De même, les techniques de génétique inverse dans les lignées cellulaires approuvé par la FDA (Vero) pour le développement d'un vaccin fournit de nouvelles possibilités pour la...

Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

Virus de la maladie de Newcastle (NDV) a été largement étudiée au cours des dernières années afin de développer de nouveaux vecteurs pour la vaccination et le traitement, entre autres. Ces études ont été possibles grâce à des techniques de sauvetage virus recombinant à partir d'ADNc, comme celles que nous décrivons ici.

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Ces 15 dernières années, les vecteurs dérivés de l’adénovirus canin de type 2 (CAV2) ont prouvé leur efficacité à transduire des cellules in vitro et in vivo et sont largement utilisés pour la vaccination et la thérapie génique. Nous décrivons ici une procédure de construction, de production et de purification des vecteurs CAV2, donnant lieu à des suspensions virales à titre élevé.

Production et purification de vecteurs dérivés d’adénovirus canins non réplicatifs de type 2

Ici, nous présentons un protocole pour générer un type bivalent adénovirus 5 (Ad5) vecteur preuve-de-principe Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 en utilisant la stratégie Antigène capside-Incorporation. Ce vecteur a été démontrée à exposer remise en forme qualitative, la capacité d'échapper sérums Ad5 positif in vitro, et l'antigénicité ainsi que l'immunogénicité des antigènes incorporés.

Utilisant la stratégie capside-Incorporation Antigen pour le développement d&#39;approches adénovirus sérotype 5 Vectored vaccins

Un protocole de génération de vecteurs adénoviraux de grande capacité dépourvus de toutes séquences codantes virales est présenté. Le clonage des transgènes contenus dans le génome du vecteur est basé sur des endonucléases à tête chercheuse. L’amplification virale dans les cellules productrices cultivées en tant que cellules adhérentes et en suspension repose sur un virus auxiliaire fournissant des gènes viraux chez trans.

Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5

Nous décrivons une méthode permettant de générer et amplifier les organismes génétiquement modifiés virus syncytiales respiratoires (RSVs) et un dosage de plaque optimisé pour RSVs. Nous illustrons ce protocole en créant deux virus recombinants qui sont respectivement permettent la quantification de la réplication de la RSV et analyse des corps d’inclusion de RSV et dynamiques associés à corps d’inclusion des granules en direct.

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

La génération de rotavirus recombinants à partir de l’ADN plasmide fournit un outil essentiel pour l’étude de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, et le développement de vecteurs et de vaccins d’expression de rotavirus. Ici, nous décrivons une approche simplifiée de génétique inverse pour générer des rotavirus recombinés, y compris des souches exprimant des protéines fluorescentes de reporter.

Méthode simplifiée de génétique inversée pour récupérer les rotavirus recombinés exprimant des protéines reporter

Il s’agit d’une méthode pour générer des virus vaccinias recombinants « sans cicatrices » à l’aide de la sélection de la gamme d’hôtes et de l’identification visuelle des virus recombinants.

Génération rapide et transparente de poxvirus recombinés à l’aide de la gamme d’hôtes et de la sélection visuelle

Ici, nous présentons un protocole pour la production d’adénovirus en utilisant le système pAdEasy. La technologie comprend la recombinaison des plasmides pAdTrack et pAdEasy-1, l’emballage et l’amplification des adénovirus, la purification des particules adénoviraux du lysat cellulaire et du milieu de culture, le titrage viral et le test fonctionnel de l’adénovirus.

Une méthode efficace pour la production d’adénovirus

Le taux de rotation du virus dans les systèmes marins et d'eau douce peut être estimée par une réduction et la technique ne se reproduise. Les données permettent aux chercheurs de déduire les taux de mortalité microbienne virus de médiation dans les systèmes aquatiques.

Estimation des taux de production de virus dans les systèmes aquatiques

Découvrez une méthode efficace de production de parvovirus recombinants utilisant un vecteur adénoviral dérivé du type 5. Cette technique améliore le rendement viral par plus de dix fois tout en réduisant les coûts et les délais de production.

Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l'aide d'adénovirus dérivés Systems

Explorer plus de vidéos