Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l'aide d'adénovirus dérivés Systems

L'objectif général de cette procédure est de produire des virus parvoviraux recombinants, ou rec PVS, à des titres élevés tout en préservant leur qualité et en réduisant les délais et les coûts de production. Cela est réalisé en produisant d'abord un stock viral rec PV initial par transfection de cellules HEC 2 93 T avec des plasmides rec PV, conjointement avec un vecteur dérivé du virus adénoviral de type cinq. L'introduction d'éléments génomiques d'ad dans les cellules HEC 2 9 3 T augmentant la production de rec PVS de plus de dix fois.

Par rapport aux protocoles existants, un nouveau partenaire d'AD VP a été généré, contenant les éléments génomiques adénoviraux nécessaires pour améliorer la production de parvovirus recombinants ainsi que l'unité du gène VP du parvovirus. La prochaine étape consiste à produire et à purifier ce nouveau partenaire ADD VP selon les protocoles standard.

La dernière étape de cette procédure consiste à amplifier les PVS recombinants en co-infectant des cellules NB324K avec les virus PV recombinant et AD-ADP. L'efficacité de production du PV recombinant est améliorée d'un facteur supérieur à 100 grâce à cette stratégie, qui peut être utilisée exclusivement une fois qu'une petite quantité de PVS recombinants a été produite par transfection. Enfin, une PCR quantitative en temps réel ou un dosage de transduction est utilisé pour la titration des stocks viraux produits.

En outre, un dosage par plaque est effectué afin de confirmer que des virus compétents pour la réplication indésirables n'ont pas été générés au cours du processus de production. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la production classique de parvovirus recombinants par plasmide, dans des cellules act et traitées, est qu'une fois les stocks initiaux de parvovirus recombinants produits à l'aide du partenaire adéno-VP, notre production reposera entièrement sur l'infection virale. Cela permet l'utilisation de cellules NBK, qui sont de bons producteurs de parvovirus, mais qui sont transfectables.

De cette manière, il est possible d'amplifier les virus recombinants et d'augmenter le rendement viral commun de plus de 100 fois, tout en réduisant le temps et le coût de production. La démonstration de cette procédure sera assurée par Barbara Loic, responsable de l'Unité de Production de Virus, qui a mis au point avec nous ce nouveau protocole. Nous espérons que vous apprécierez cette vidéo et vous souhaitons bonne chance dans vos expériences.

La production de parvovirus recombinant ou PV rec par transfection est nécessaire pour produire la quantité minimale de PV rec servant d'inoculum lors de la production ultérieure de PV rec par infection. Un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2 est requis pour la production de PV rec un jour avant l'ensemencement par transfection. 2 millions de cellules HEC 293T dans une plaque de 10 centimètres afin d'obtenir une confluence cellulaire de 50 %.

Le jour de la transfection, faire croître les cellules dans 10 millilitres de DMEM complété avec 10 % de FBS, du L-glutamine, de la pénicilline et de la streptomycine, puis incuber toute la nuit à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de dioxyde de carbone et 92 % d'humidité. Le jour de la transfection, préparer un mélange de production de virus dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter les réactifs suivants selon un rapport molaire de un à deux à un : trois microgrammes de vecteur rec PV contenant le transgène d'intérêt.

Six microgrammes du vecteur P-C-M-V-V-P portant l'unité du gène de la capside du parvovirus, et huit microgrammes du plasmide auxiliaire dérivé de l'adénovirus. Pxx six, diluer le mélange de plasmides avec du milieu sans sérum jusqu'à 850 microlitres pour obtenir une concentration finale de 20 nanogrammes par microlitre. Ensuite, ajouter 42,5 microlitres du réactif de transfection FU gene HD selon un rapport de 2,5 à 1 entre le réactif FU gene et l'ADN.

Veillez à ce que le réactif du gène FU ne touche pas la paroi du tube. Vortexez doucement pendant cinq à 10 secondes, puis incubez le mélange de transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Ajoutez le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules. Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément le mélange.

Incubez la plaque pendant 72 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 92 % d'humidité. Pendant cette période, des particules de parvovirus progénies se forment à partir des plasmides de parvovirus afin de récolter le virus. Commencez par racler les cellules dans leur milieu, puis aspirez et transférez la suspension de la plaque dans un tube en plastique de 15 millilitres.

Centrifuger le tube à 250 G pendant cinq minutes. À température ambiante, retirer 95 % du surnageant, en laissant environ 0,5 millilitre résiduel. Vortexer doucement le tube pour remettre en suspension le culot dans le surnageant restant et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre.

Congelez la suspension dans un bain d'azote liquide, puis décongelez-la dans de l'eau tiède à 37 degrés Celsius. Agitez vigoureusement le tube au vortex pendant 15 secondes. Répétez le cycle de congélation-décongélation deux fois supplémentaires.

Centrifuger le tube à 16 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis recueillir le surnageant dans un tube neuf. Le surnageant à ce stade contient l'extrait viral brut, qui peut être utilisé comme inoculum pour la production de PVS rec via une infection. Puissance de gain du virus.

Les réplications dépendent de facteurs cellulaires exprimés dans les cellules en prolifération. Il est donc essentiel que les cellules utilisées pour la production du virus recombinant soient en condition optimale et ensemencées à une densité appropriée, comme le montre ce protocole. Un jour avant l'infection, ensemencer 10 millions de cellules MB 204K dans un flacon T175 afin d'obtenir une confluence cellulaire de 60 à 80 % le jour suivant.

Préparez un deuxième flacon contenant le même nombre de cellules en tant que témoin. Chaque flacon T 1 75 doit contenir 20 millilitres de MEM comme volume final, supplémenté avec 5 % de FBS, de L-glutamine, de pénicilline et de streptomycine, le matin du jour de l'infection. Préparez un mélange viral dans un tube en plastique de deux millilitres.

Ajoutez ces réactifs. AJOUTEZ VP helper. Ajoutez une multiplicité d'infection de 10 rec PVS à un MOI de 0,5 et du MEM jusqu'à un volume total de 1,5 millilitre.

Appliquer tout le mélange viral sur l'un des flacons T 1 75. Incuber le flacon pendant deux heures à 37 degrés Celsius, 92 % d'humidité et 5 % de dioxyde de carbone, avec un agitation douce toutes les 15 minutes. Poursuivre l'incubation pendant 20 à 24 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius, 92 % d'humidité et 5 % de dioxyde de carbone.

Après 20 à 24 heures, remplacez le milieu de culture par du milieu frais et incubez le flacon dans les mêmes conditions pendant 48 heures, ce qui indique une production virale efficace. Des signes nets de cytotoxicité doivent être observés dans le flacon contenant les cellules infectées par le virus. Entre 36 et 48 heures après l'infection, après 48 heures, aspirez et transférez le surnageant du milieu du flacon dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.

Lavez les cellules deux fois avec 1,5 millilitre de PBS, puis ajoutez la trypsine et incubez de trois à cinq minutes. Ajoutez ensuite le milieu de suspension cellulaire au milieu retiré, centrifugez les cellules et le surnageant à 5 000 ×g pendant cinq minutes à température ambiante, jetez le surnageant et ajoutez un millilitre de tampon TE au culot cellulaire. Vortexez doucement le tube pour resuspendre les cellules. Ensuite, congélez la suspension cellulaire dans un bain d'azote liquide et décongelez dans de l'eau tiède à 37 degrés Celsius.

Vortexez vigoureusement le tube pendant 15 secondes. Répétez trois fois le cycle de congélation-décongélation. Ensuite, traitez la suspension cellulaire avec la nucléase Ben Nase pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius afin de digérer l'ADN génomique cellulaire et les ADN viraux non encapsidés.

Après 30 minutes, centrifuger le tube à 5 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Enfin, récupérer le surnageant dans un nouveau tube. Le surnageant à ce stade contient un extrait brut de virus.

Les rendements typiques de rec PV GFP produits selon ce protocole devraient se situer entre un et dix fois dix à la puissance huit unités infectieuses virales. Un exemple de stimulation de la production de rec PV par un plasmide dérivé d'adénovirus est présenté ici. Des extraits bruts de virus contenant le rec PV PHH1 GFP portant le gène GFP, avec ou sans.

Le plasmide à base d'adénovirus PXX a été appliqué sur des cellules indicatrices NBK comme observé sur ces micrographies ; il y a plus de cellules positives pour la GFP en présence de PXX six. Lorsque des tests de transduction de la GFP ont été réalisés, une augmentation nette de la production de PV recombinant a été obtenue en présence de Pxx six. La production est passée de 0,3 unité de transduction de la GFP, ou UT par cellule, obtenue par des protocoles conventionnels, à environ cinq UT par cellule obtenue avec ce protocole.

Les résultats de l'essai de transduction de GFP indiquent que les gènes viraux E deux a, E quatre et ARN VA d'adénovirus contenus dans le plasmide PXX six sont capables d'augmenter la production de parvovirus. Cette figure suivante montre un exemple représentatif de production de PV recombinant par infection. Des cellules NB trois deux zéro quatre K ont été infectées par le virus auxiliaire ADP purifié, puis superinfectées par l'un ou l'autre de deux parvovirus recombinants.

Des extraits cellulaires bruts ont été utilisés pour déterminer les titres viraux par un dosage de transduction qui a montré que l'AD VP helper augmentait davantage la production de PV rec jusqu'à plus de 70 T par cellule. Enfin, des lots viraux produits en présence ou en l'absence d'ADP ont été analysés pour leur teneur en particules virales compétentes pour la réplication, par un dosage de plaques sur des cellules indicatrices MB trois 20 4K. Les résultats indiquent que l'ADP helper améliore la production de PV rec sans augmenter la fréquence de particules virales indésirables compétentes pour la réplication après son développement.

Cette technique permet aux scientifiques spécialisés dans le domaine du cancer et de la thérapie génique d'augmenter davantage la production de virus recombinants à usage thérapeutique. À l'aide de bioréacteurs, des variants peuvent être produits en grandes quantités, comme requis dans un cadre clinique.